实验十四 血清胆固醇测定(胆固醇氧化酶法)

实验十四血清胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）胆固醇的测定方式很多；通常可分为化学试剂比色法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法五大类。

化学试剂比色法中有直接法和间接法；前者可用血清直接测定，后者是用溶剂或其它方式提取胆固醇后再作定量。

酶法由于操作简便、结果准确，试剂无侵蚀性，而且因利用特异性酶，大大减少了血液中其它成份的干扰，目前已成为测定胆固醇的主要方式。

【目的】1．了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理，能进行血清胆固醇测定的操作。

2.掌握血清胆固醇测定的临床意义。

【原理】血清中总胆固醇（TC）包括胆固醇酯(CE)和游离型胆固醇(FC),酯型占70%，游离型占30%。

胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）的作用下氧化生成Δ4-胆甾烯酮和过氧化氢。

后者通过氧化物酶（POD）催化氢与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反映，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500nm波优势测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。

反映式如下：【器材】试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计。

【试剂】酶法测定胆固醇多采用市售试剂盒。

1. 酶应用液胆固醇酶试剂的组成为：pH6.7磷酸盐缓冲液50mmol/L胆固醇酯酶≥200U/L胆固醇氧化酶≥100U/L过氧化物酶≥3 000U/L4-氨基安替比林0.3 mmol/L苯酚 5 mmol/L另外还含有胆酸钠和Triton X-100，胆酸钠是胆固醇酯酶的激活剂，表面活性剂Triton X-100能增进脂蛋白释放胆固醇和胆固醇酯，有利于胆固醇酯的水解。

2．5.17 mmol/L（200mg /dl）胆固醇标准液精准称取胆固醇200mg溶于无水乙醇，移入100ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度(也可用异丙醇等配制)。

【操作】取试管3支，编号，按下操作。

表3-15 酶法测定血清胆固醇操作步骤加入物（ml）测定管标准管空白管血清0.02－－胆固醇标准液－0.02－蒸馏水－－0.02酶应用液 2.00 2.00 2.00混匀后，37℃水浴保温15分钟，在500nm波优势比色，以空白管调零，读取各管吸光度。

一、实验目的1. 了解血清胆固醇测定的原理和方法。

2. 掌握血清胆固醇测定的操作步骤。

3. 分析实验结果，了解血清胆固醇水平与临床疾病的关系。

二、实验原理血清胆固醇是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和，包括游离胆固醇和胆固醇酯。

血清胆固醇测定是临床血脂检测的重要指标，对诊断和预防心血管疾病具有重要意义。

血清胆固醇测定方法主要有酶法、化学法和比色法等。

本实验采用酶法测定血清胆固醇，其原理如下：血清中的胆固醇酯在胆固醇酯酶的作用下水解为游离胆固醇和脂肪酸。

游离胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下氧化生成胆烷4烯3酮及过氧化氢。

过氧化氢在4-氨基安替比林和酚存在下，经过氧化物酶催化，生成红色醌亚胺。

颜色的深浅与标本中胆固醇含量呈正比，通过比色法测定吸光度，计算血清胆固醇含量。

三、实验材料1. 试剂：胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、苯酚、Good's缓冲液、胆固醇标准溶液、血清标本。

2. 仪器：721型分光光度计、移液器、离心机、试管等。

四、实验步骤1. 标准曲线绘制：将胆固醇标准溶液分别加入试管中，加入胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林和苯酚，混匀后置于37℃水浴中保温15分钟。

用721型分光光度计在510nm波长处测定吸光度，以胆固醇含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品测定：将血清标本分别加入试管中，按照标准曲线绘制步骤加入试剂，混匀后置于37℃水浴中保温15分钟。

用721型分光光度计在510nm波长处测定吸光度，查标准曲线得到胆固醇含量。

3. 结果计算：根据样品吸光度，查标准曲线得到胆固醇含量，计算血清胆固醇浓度。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：绘制标准曲线，计算相关系数R²，R²≥0.99表示曲线拟合良好。

2. 样品测定：对血清标本进行测定，计算血清胆固醇浓度。

3. 结果分析：根据实验结果，分析血清胆固醇水平与临床疾病的关系。

1. 掌握血清总胆固醇测定的原理和方法。

2. 了解血清总胆固醇测定的临床意义。

3. 培养实验操作技能，提高实验分析能力。

二、实验原理血清总胆固醇（Total Cholesterol，TC）是指血液中所有胆固醇的总和，包括游离胆固醇和胆固醇酯。

血清总胆固醇测定是临床诊断和预防动脉粥样硬化、冠心病等疾病的重要指标。

测定血清总胆固醇的方法主要有酶法、化学比色法、荧光法等。

本实验采用酶法测定血清总胆固醇，利用胆固醇氧化酶（COD）和过氧化物酶（POD）催化反应，将胆固醇氧化生成胆烷4烯3酮，再与4-氨基安替比林和酚在过氧化物酶的作用下生成红色醌亚胺，通过比色法测定吸光度，从而计算出血清总胆固醇含量。

三、实验材料1. 试剂：胆固醇氧化酶试剂、过氧化物酶试剂、4-氨基安替比林试剂、酚试剂、胆固醇标准液、血清样本、蒸馏水、721型分光光度计等。

2. 仪器：恒温水浴箱、移液器、试管、试管架等。

四、实验步骤1. 标准曲线绘制：取一系列已知浓度的胆固醇标准液，分别加入胆固醇氧化酶试剂、过氧化物酶试剂、4-氨基安替比林试剂和酚试剂，混匀后置于37℃水浴箱中保温15分钟。

以蒸馏水为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，胆固醇浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2. 样本测定：取血清样本，按照与标准曲线绘制相同的步骤，测定吸光度。

3. 结果计算：根据标准曲线，计算血清总胆固醇含量。

五、实验结果1. 标准曲线绘制：以吸光度为纵坐标，胆固醇浓度为横坐标，绘制标准曲线，相关系数R²=0.997。

2. 样本测定：测定血清总胆固醇含量，结果显示：血清总胆固醇为5.8mmol/L。

1. 本实验采用酶法测定血清总胆固醇，操作简便、准确度高，适合临床应用。

2. 标准曲线绘制过程中，应注意标准液的浓度范围，以保证标准曲线的线性关系。

3. 在实验操作过程中，应注意试剂的配制、仪器的校准等，以保证实验结果的准确性。

4. 血清总胆固醇测定结果对临床诊断和预防动脉粥样硬化、冠心病等疾病具有重要意义。

血清总胆固醇测定实验报告一、实验目的血清总胆固醇（Total Cholesterol，TC）测定是临床生化检验中的常见项目之一，本实验旨在掌握血清总胆固醇测定的原理、方法和操作步骤，熟悉实验过程中的注意事项，并对实验结果进行准确分析和判断。

二、实验原理目前，血清总胆固醇测定常用的方法是酶法。

其原理是胆固醇酯酶（CE）将胆固醇酯水解为游离胆固醇（FC）和脂肪酸，胆固醇氧化酶（COD）将 FC 氧化为胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶（POD）的催化下与 4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应生成红色醌亚胺。

在一定波长下，通过比色法测定吸光度，从而计算出血清总胆固醇的含量。

三、实验材料与设备1、材料血清样本：新鲜无溶血、无脂浊的血清。

试剂盒：包含胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、酚等试剂。

2、设备分光光度计移液器恒温水浴箱离心机四、实验步骤1、样本处理空腹采集静脉血，置于干燥无抗凝剂的试管中，室温下静置 30 分钟使其凝固。

以 3000 转/分钟离心 10 分钟，分离血清，备用。

2、试剂准备按照试剂盒说明书的要求，将试剂 R1 和试剂 R2 分别配制好，并放置于恒温水浴箱中预热至规定温度。

3、测定操作取两支干净的比色管，分别标记为空白管和测定管。

空白管中加入蒸馏水20μL 和试剂R1 1000μL，混匀，置于 37℃恒温水浴箱中保温 5 分钟。

测定管中加入血清样本20μL 和试剂R1 1000μL，混匀，置于 37℃恒温水浴箱中保温 5 分钟。

然后，向空白管和测定管中分别加入试剂R2 500μL，混匀，置于37℃恒温水浴箱中保温 10 分钟。

4、比色测定以空白管调零，在分光光度计 500nm 波长处读取测定管的吸光度值（A）。

五、实验结果计算血清总胆固醇（mmol/L）＝（测定管吸光度空白管吸光度）×校准品浓度÷校准管吸光度六、实验结果本次实验测定的血清总胆固醇结果为_____mmol/L。

血清总胆固醇的测定实验报告胆固醇是人体内一种重要的脂质物质，它在维持细胞膜的完整性、合成激素和胆汁酸等方面发挥着重要作用。

然而，过高的血清总胆固醇水平会增加心脑血管疾病的风险。

因此，及时测定血清总胆固醇水平对于预防和治疗心脑血管疾病具有重要意义。

本实验旨在通过测定血清中总胆固醇的含量，掌握其测定方法，并了解不同因素对血清总胆固醇含量的影响，为临床诊断和研究提供参考。

1. 实验原理。

本实验采用酶法测定血清总胆固醇含量。

首先，将血清样本与试剂中的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶发生反应，将胆固醇酯水解成游离的胆固醇和脂肪酸，然后游离的胆固醇与试剂中的胆固醇氧化酶再次发生反应，生成过氧化物酶，最终生成带有颜色的化合物。

通过测定产生的有色产物的光密度，即可计算出血清中总胆固醇的含量。

2. 实验步骤。

（1）取适量血清样本，离心沉淀，取上清液备用。

（2）将标准品和上清液分别加入反应管中，加入试剂A和试剂B，混匀后放置37℃恒温水浴中反应一定时间。

（3）加入硫酸后，混匀放置10min，再加入试剂C混匀后放置2min。

（4）测定吸光度值，并根据标准曲线计算出血清总胆固醇的含量。

3. 实验结果。

通过实验测定，得出不同血清样本中总胆固醇的含量分别为X mg/dL、Ymg/dL和Z mg/dL。

根据实验结果，我们可以得出……（根据实验结果进行分析和讨论）。

4. 实验结论。

本实验通过酶法测定了血清中总胆固醇的含量，结果表明……（根据实验结果进行结论）。

5. 实验注意事项。

（1）在实验过程中，要注意血清样本的保存和处理，避免样本受到污染或变质。

（2）在试剂配制和使用过程中，要按照相关操作规程，严格控制试剂的质量和使用量。

（3）实验操作过程中，要注意实验室安全，避免发生意外。

6. 实验意义和应用。

本实验方法可以准确测定血清中总胆固醇的含量，为临床诊断和研究提供了重要的参考数据。

同时，也为进一步研究血清总胆固醇与心脑血管疾病的关系提供了实验基础。

胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇（标准管法）实验目的：1.了解自动生化分析仪的工作原理2.熟悉血清总胆固醇相关生化的检测项目及检测方法3.掌握血清总胆固醇相关生化检测项目的临床意义。

实验原理：胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇:血清中的胆固醇由游离胆固醇及胆固醇酯构成，胆固醇酯在胆固醇酯酶的作用下水解为胆固醇，再与胆固醇氧化酶作用产生△4-胆甾烯酮及H202;后者在过氧化物酶的作用下，与苯酚及4-氨基安替比林作用生成红色化合物醌亚胺。

测定该红色化合物在500nm波长的吸光度，可以计算出血清总胆固醇含量。

实验操作：1.将准备好的酶工作液（胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、苯酚、4-氨基安替比林）加入空白管、浓度标准管、测定管各1.5ml，再向标准管加20μl胆固醇标准液（5.18mmol/L），再向测定管加入20μl血清。

2.将三支试管放入水浴锅中，37℃保温20分钟3.调节分光光度计波长500nm,透光度T至100%，将空白管试液对光的吸收调节为0，再用空白管调“零”点测定其他各管的吸光度。

实验结果:分光光度计测得标准管吸光度和测定管吸光度，根据朗伯-比尔定律,得到血清样品总胆固醇值=（测定管吸光度/标准管吸光度）x5.18分析讨论：为什么用酶酚混合液作为空白管溶液？酶酚混合液作为空白试剂，调节分光光度计透光度T至100%，可将酶酚混合液对光的吸收调节为0，从而消除对葡萄糖反应产物吸光度测定的影响。

思考题：1.血清甘油三酯升高有和临床意义？血脂代谢紊乱对机体有何危害？血清甘油三酯升高可能代表着各种疾病的发生：如原发性继发性高脂蛋白血症、动脉粥样硬化、糖尿病、肾病、脂肪肝等。

血脂代谢紊乱对机体的危害：血脂代谢紊乱的影响分两种：1）高胆固醇血症引起的危害：主要是动脉粥样硬化，包括大动脉、中动脉、小动脉动脉硬化。

动脉斑块形成主要表现在心、脑、肾等位置，如果动脉硬化斑块较重或者不稳定，发生在心脏可出现急性心肌梗死；在脑血管会出现急性脑血栓，即急性脑梗死，以及肾脏出现急性肾梗死；在外周血管，如腿部可引起坏疽；2）高甘油三酯血症引起的危害：在暴饮暴食的情况下，高甘油三酯可以诱发急性胰腺炎。

血清总胆固醇测定实验报告背景介绍：总胆固醇（TC）是指血浆中所有脂蛋白的胆固醇总和，包括低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）。

总胆固醇水平的高低与心血管疾病的发生密切相关，因此对其进行准确测定具有重要的临床意义。

实验目的：通过本实验，掌握血清总胆固醇的测定方法，了解其在临床诊断中的应用。

实验原理：本实验采用酶法测定血清总胆固醇，其原理为将胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶加入样本中，将胆固醇和脂蛋白水解为游离胆固醇和过氧化物，再由过氧化物与酚类物质发生反应，生成有色产物，最后通过比色计测定其吸光度，从而计算出总胆固醇的含量。

实验步骤：1. 取血清标本，离心分离血清。

2. 用标准吸光度计预热，设置波长为500nm。

3. 取适量样本和对照品，加入试剂A和试剂B，混匀后在37°C恒温水浴中反应15分钟。

4. 加入试剂C混匀，再在37°C恒温水浴中反应5分钟。

5. 用比色计在波长为500nm处对样本和对照品吸光度，计算总胆固醇含量。

实验结果：样本A吸光度为0.6，对照品吸光度为0.3，根据标准曲线计算出样本A的总胆固醇含量为5.0mmol/L。

样本B吸光度为0.7，对照品吸光度为0.4，计算出样本B的总胆固醇含量为6.0mmol/L。

实验结论：根据上述实验结果，样本A的总胆固醇含量正常，而样本B的总胆固醇含量超标，提示可能存在心血管疾病的风险。

因此，血清总胆固醇的测定对于心血管疾病的筛查和诊断具有重要意义，有助于及时采取预防和治疗措施。

总结：通过本次实验，我们掌握了血清总胆固醇的测定方法及其临床意义，了解了其在心血管疾病中的重要性。

在临床实践中，我们应该重视血清总胆固醇的监测，及时发现异常情况并采取相应的干预措施，以保障患者的健康。

胆固醇氧化酶法（Cholesterol oxidase）血清中测定方法包括化学方法和酶法，化学方法包括抽提法和直接测定法酶法临床上常用的是胆固醇氧化酶法LDL是一组不均一的富含胆固醇的脂蛋白颗粒，颗粒大小、电荷或apoB含量等应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将LDL与其他脂蛋白分离开，然后测定LDL 组分中胆固醇含量。

由于化学沉淀法和免疫分离法测定LDL-C均需要进行样本预处理，其最大缺点是不能进行自动化分析，不适应大规模流行病学调查或临床大批量标本诸多项目同时检测。

国外近两年相继研制开发出几种不同类型的均相测定法，标本不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪自动测定。

(1)选择性反应法［12～14］：基于用表面活性剂控制酶与相应脂蛋白的反应的新技术研制而成，多为液体双试剂。

目前有两类检测系统：第一类系统的试剂1中的表面活性剂1可使血清样品中的HDL、CM和VLDL颗粒解离，Chol分子被开释出来，与胆固醇酶试剂反应，产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色，此时LDL颗粒还是完整的。

加试剂2(含表面活性剂2和偶联剂DSBmT)，它可使LDL颗粒解离开释Chol，参与Trinder反应而显色，因其他脂蛋白的Chol分子已除往，光彩深浅与LDL-C量呈比例［12，13］。

HDL 目前临床常规实验室直接分离测定HDL-C的方法大致可分为3代。

第1代为化学沉淀法,常用的沉淀剂为多阴离子,如磷钨酸(FTA)、DS、肝素(Hep)或非离子多聚体如聚乙二醇（PEG）与某些两价阳离子(如Mg2＋、Ca2＋、Mn2＋)适用。

最早为美国国立卫生研究院(NIH)所采用的肝素-锰沉淀法(HM法),后多采用DS50-Mg2＋矿法,欧洲则多采用磷钨酸镁沉淀法(PTA-Mg2＋法)和聚乙二醇沉淀法(PEG法)。

1995年中华医学会检验分会曾在国内推荐PTA-Mg2＋法作为HDL-c测定的常规方法。

但此类方法常因含apoB的脂蛋白组份沉淀不完全导致结果假性偏高。

血清总胆固醇测定法1.实验原理胆固醇酯被胆固醇酯酶水解酶(CEH)水解成游离胆固醇，后者被胆固醇氧化酶(COD)氧化成胆甾烯酮并产生过氧化氢，再经过氧化物酶(POD)催化，使4-氨基安替比林与酚（三者合称PAP）反应，生成红色醌亚胺色素（Trinder反应）。

醌亚胺的最大吸光度在500nm左右，吸光度与标本中TC含量成正比。

反应式如下：CEH胆固醇酯+ H2O 胆固醇＋脂肪酸COD胆固醇＋O2Δ4-胆甾烯酮＋H2O2POD2H2O2+ 4-AAP +酚苯醌亚胺(显色) + 4H2O 2. 标本：2.1 病人准备：12小时禁食。

2.2 类型：血清，肝素或EDTA抗凝血浆。

3. 标本存放：血清稳定性：20～25℃保存可稳定1周；4～8℃保存可稳定1周；-20℃保存可稳定3个月。

4. 标本运输：常温条件下保存运输。

5. 标本拒收标准：细菌污染的标本。

6. 实验材料6.1 试剂欧泰克总胆固醇试剂盒（货号：112 1307170 1 试剂8×70ml）6.1.1 试剂组成Tris缓冲液pH7.3 50mmol/L酚20mmol/L4-氨基安替比林 1.0mmol/L 胆固醇酯酶(CHE) ≥400U/L 胆固醇氧化酶(CHO) ≥200U/L 过氧化物酶(POD) ≥4000U/L 6.1.2 试剂准备试剂为即用式。

6.1.3 试剂稳定性与贮存：试剂保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。

试剂不可冰冻。

6.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。

6.1.5 注意事项：试剂中含叠氮钠（0.95g/L）为防腐剂。

不可入口！避免接触皮肤及粘膜。

应采取必要的预防措施使用试剂6.2 校准品：使用罗氏复合校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP文件。

6.3 质控品：具体参见生化检验校准品和质控品.SOP 文件。