黑曲霉产果胶酶的分离提取及活力测定

柚子皮黑曲霉的分离鉴定及产酶特性研究张超凤;汪雨晨;陈卫平;张凤英【摘要】对柚子皮上自然生长的黑曲霉进行分离鉴定,并探讨其产酶特性.以平板稀释法从柚子皮上分离出一株霉菌菌株,通过观察其形态特征和培养特征,对照《真菌鉴定手册》判定该菌株的种属;采用鉴定培养基法对其产酶特性进行分析.根据柚子皮的成分特性,以干柚子皮为主要原料,该菌为生产菌株,采用固态发酵法探究培养基的成分、柚子皮含量、培养基初始含水量及发酵时间4个因素对纤维素酶活力的影响.结果表明,该菌株为黑曲霉(Aspergillus nige),可产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶;固态发酵培养基中添加柚子皮12g,麸皮0.5g和(NH4) 2SO40.5g,培养基初始含水量保持在68.5 mL/100 g,培养时间控制在60 h左右时纤维素酶产量较高.%Aspergillus niger naturally grow on pomelo peel was separated and characterized,and investigated for its enzyme-producing features.Plate dilution method was used to isolate a mold strain,and it was identified through observ ing its morphological and culture features,and compare to Fungi Characterization Handbook to judge the genus and species of the strain.The identification medium is adopted to discuss the enzyme production characteristics.Dried pomelo peels as major rawmaterial,according to the component feature of pomelo peel,and the strain as producing strain,adopting solid state fermentation method to investigate the effects on cellulase activity of four factors,component of culture medium,the content of pomelo peel,the initial water content of the medium,as well as fermentation time.The result showed that the strain was Aspergillus niger and it can produce fourenzymes:amylase,protease,cellulase and pectinase;12 g pomelo peels,0.5 g wheat bran,and 0.5 g (NH4)2SO4,and initial water content at about 68.5mL/100 g and fermentation time at about 60 h,the yield of cellulase was at the higher level..【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】6页(P22-27)【关键词】柚子皮;黑曲霉;固态发酵;纤维素酶【作者】张超凤;汪雨晨;陈卫平;张凤英【作者单位】江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌334450;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌334450;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌334450;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌334450【正文语种】中文【中图分类】Q93-331黑曲霉(Aspergillus nige)属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是一种常见的繁殖能力较强的真菌，且又是不产生毒素的安全菌种，因而被人类长期利用[1]。

黑曲霉HG-1固态发酵苹果渣和棉粕生产果胶酶的工艺研究黑曲霉HG-1固态发酵苹果渣和棉粕生产果胶酶的工艺研究一、引言果胶酶是一类重要的工业酶，在果汁酿造、果蜜糖化、纸浆漂白等过程中有着广泛的应用。

传统的果胶酶生产方法多采用液态发酵，但该方法存在投资高、废水多、反应不均匀等问题。

因此，开展固态发酵果胶酶生产的研究具有一定的意义。

二、实验目的本实验旨在通过黑曲霉HG-1固态发酵苹果渣和棉粕，优化果胶酶的生产工艺，提高酶活力和产酶量。

三、实验方法1. 实验材料准备我们选择了黑曲霉HG-1作为发酵菌株，购买了苹果渣和棉粕作为底料。

实验中，我们对不同比例的苹果渣和棉粕进行试验，以确定最佳的底料组合比例。

2. 试管中固态发酵实验首先将苹果渣和棉粕按照一定比例混合，并加入适量的水，使底料湿度达到50%左右。

然后将混合后的底料分装到试管中，每个试管重量为20g。

接下来，用菌针在试管中接种黑曲霉HG-1菌株。

将试管封闭，放置于恒温振荡器内进行固态发酵。

3. 试验参数调控在菌种接种后的发酵过程中，我们调节温度、pH值和发酵时间等参数，以寻找最佳的发酵条件。

4. 酶活测定发酵结束后，取出试管中的发酵产物，加入适量的缓冲液并用搅拌器打碎。

然后离心收集上清液，测定其果胶酶活力。

四、结果与讨论1. 底料组合比例的优化根据试验结果，我们发现当苹果渣与棉粕的比例为4:1时，果胶酶的产酶量最高。

2. 发酵条件的优化经过试验比较，我们发现在温度为35℃、pH值为5.0、发酵时间为72小时时，果胶酶的产酶量最大。

3. 酶活测定结果根据实验数据，我们发现黑曲霉HG-1固态发酵苹果渣和棉粕的果胶酶酶活力为XX U/ml。

五、结论通过实验，我们成功地利用黑曲霉HG-1进行了苹果渣和棉粕的固态发酵，优化了果胶酶的生产工艺。

结果表明，最佳的底料组合比例为苹果渣与棉粕的比例为4:1，最佳的发酵条件为温度35℃、pH值5.0、发酵时间72小时。

最终，我们得到的果胶酶酶活力为XX U/ml。

黑曲霉β-甘露聚糖酶的纯化和活力测定实验指导（综设实验）一．实验目的及要求1、掌握黑曲霉ASP.Niger的固体发酵工艺2、掌握粗酶浸提、硫酸铵分级沉淀的原理和操作3、掌握透析原理、脱盐及透析袋的处理方法和使用4、掌握β-甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β-糖苷键的机制和理论5、掌握以魔芋精粉为底物DNS光度法（3,5－二硝基水杨酸法）测定发酵制品中β-甘露聚糖酶活力的操作方法二．实验原理1、微生物的β-甘露聚糖酶都是诱导酶，只有在培养基中含有β-甘露聚糖时才进行β-甘露聚糖酶的合成，产酶最适培养基除需要一定的碳氮源，还加入一定诱导物魔芋粉。

2、硫酸铵分级沉淀（盐析）原理中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。

3、透析原理、脱盐：酸性β-甘露聚糖酶相对分子质量为39000和40000，选择MWCO（切割分子量或截留分子量）14000的透析袋，透过掉分子量小于10000的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。

4、DNS光度法测定还原糖：β-甘露聚糖酶能水解含β-1，4甘露糖苷键的甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等），以魔芋精粉为底物主要得到含还原性端基的甘露寡糖，还原性端基与DNS试剂共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈棕（桔）红色，在520nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量，由此测定出酶的活力。

三．实验试剂和器材菌种：黑曲霉(Aspergillus niger)JXW12-1，生物工程发酵实验室保藏。

斜面培养基:马铃薯20.0%，蔗糖2.0%，琼脂 2.0%，pH自然，此培养基用于菌种保藏、斜面种子和平板分离。

二级种子培养基：250 mL三角瓶装麸皮10g，水12mL，121℃灭菌30 min；接种一菌耳斜面种子，32±1℃静置培养96h，其间翻曲2～3次。

一、实验目的1. 了解果胶酶的提取方法；2. 掌握果胶酶活性的测定方法；3. 探究不同提取方法对果胶酶活性的影响。

二、实验原理果胶酶是一种复合酶，主要由果胶分解酶、果胶酯酶和半乳糖醛酸酶组成。

它能够分解植物细胞壁中的果胶，使植物组织变得柔软，便于提取。

本实验通过提取黑曲霉等真菌中的果胶酶，并测定其活性，以了解果胶酶的特性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 黑曲霉菌种- 柑橘皮- 硫酸铵- 乙酸乙酯- 氯化钠- 碳酸氢钠- 磷酸氢二钠- 磷酸二氢钠- 果胶- 水浴锅- pH计- 离心机- 移液器- 烧杯- 试管- 滴定管- 酶标板- 酶标仪2. 实验试剂：- 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）- 果胶酶提取液- 果胶溶液- 氯化钠溶液- 碳酸氢钠溶液- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液四、实验方法1. 果胶酶提取（1）将黑曲霉菌种接种于装有马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的培养皿中，培养48小时。

（2）将培养好的黑曲霉菌种接种于装有马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中，培养48小时。

（3）将培养好的菌液以4,000 r/min离心10分钟，收集菌体。

（4）将菌体用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤三次，去除杂质。

（5）将洗涤后的菌体加入硫酸铵溶液中，搅拌溶解，调节pH至7.0。

（6）将溶液以4,000 r/min离心10分钟，收集沉淀。

（7）将沉淀用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤三次，去除杂质。

（8）将洗涤后的沉淀加入乙酸乙酯溶液中，搅拌溶解，去除蛋白质。

（9）将溶液以4,000 r/min离心10分钟，收集沉淀。

（10）将沉淀用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤三次，去除杂质。

（11）将洗涤后的沉淀加入氯化钠溶液中，搅拌溶解，调节pH至7.0。

（12）将溶液以4,000 r/min离心10分钟，收集沉淀。

（13）将沉淀用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤三次，去除杂质。

（14）将洗涤后的沉淀加入碳酸氢钠溶液中，搅拌溶解，调节pH至7.0。

第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 201092 文章编号：1008-8717（2010）07-0092-03黑曲霉生产糖化酶及酶活测定单 海 艳（牡丹江大学，黑龙江 牡丹江 157000）摘 要：本文对黑曲霉突变株Uv11－48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究，证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌，经液体深层通风发酵可得出：只要充分利用突变株的有利条件，掌握好菌种特性，合理配制营养，控制好发酵条件，便可获得高酶活力的高产糖化酶。

本实验还运用了几种酶活力测定方法，以资进行优劣探讨。

关键词：黑曲霉；液体通风发酵；糖化酶；酶活力 中图分类号：Q-331 文献标识码：B 一、前言（一）黑曲霉菌种特性 1．黑曲霉的分类地位黑曲霉在分类学上处于：真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群，拉丁学名：Aspergillus niger 。

2．黑曲霉形态、生理、生态特性孢子头呈暗黑色，菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丝黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。

一般进行无性生殖，其可育细胞称足细胞。

3．黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色，有辐射沟纹，从菌落边缘向中心，分化为伸长部位，活性部位，成熟部位，老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位，并逐渐形成密生部位，分生孢子部位，最后在中心出现的是成熟部位，菌落背面无色或稍黄。

（二）糖化酶的分类、地位、性质及用途 1．糖化酶在国际酶学委员会，在系统命名法中的地位糖化酶是淀粉酶，在系统命名法中属水解酶类。

2．糖化酶的性质糖化酶（glucamylase ）又名糖化型淀粉酶（glueoamylase ）或淀粉葡萄糖苷酶。

其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。

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1. 菌种培养。

选择高产果胶酶的黑曲霉菌株。

黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测作者：2006级生物工程专业刘强指导教师：杜志兵工程师摘要：本实验旨在利用微生物固体发酵技术，以廉价农产品副产物作为发酵培养基,大量制备黑曲霉菌体，用于有机物料腐熟剂的生产，并检测产品的有效活菌数。

首先以济宁三环化工生产用黑曲霉菌种作为原始菌种，采用平板划线技术，进行菌种的分离筛选；将获得的纯系菌株接入豆芽汁液体培养基中，开始摇瓶扩大培养；然后选择合适的摇瓶培养物作为固体发酵菌种，接入固体发酵基质中，进行曲盒发酵；发酵结束后，黑曲霉生产接种量为1‰。

最后对腐熟剂产品依据GB20287-2006农用微生物菌剂标准中有效活菌数的测定方法进行检测。

结果表明，发酵所产黑曲霉在质量和数量上符合腐熟剂生产标准，产品有效活菌数检测结果符合行业标准的规定，且操作规范、重复性高、结果准确可靠。

关键词：固体发酵；黑曲霉；有效活菌数；测定Abstract:This study was designed to use solid microbial fermentation technology to low-cost agricultural by-products as fermentation medium,large scale preparation of Aspergillus niger biomass, decomposition of organic materials used in the production of agents and the number of active bacteria detection products.Jining first to use three-ring chemical production as the original strain of Aspergillus niger strains,using flat crossed technology for Strains;strains will be of purely physical medium access bean sprout juice,began expanding culture flask;and then select the appropriate culture flask as a solid fermentation bacteria,access solid substrate fermentation,fermentation march boxes;fermentation after inoculation of Aspergillus niger producing1‰.Finally,the decomposition agent agricultural products according to GB20287-2006standard microbiological agents Determination of the number of active bacteria were detected.The results show that the fermentation produced by Aspergillus niger in the quality and quantity production standards consistent with decomposition agent,the product number of active bacteria test results meet industry standard requirements,and operating specifications,reproducible,accurate and reliable.Key words:solid state fermentation；Aspergillus niger；effective viable count；determination1前言秸秆、人畜粪便、生活垃圾、工业废渣等各种有机废弃物是数量巨大的可再生资源，绝大部分没被充分有效利用，不仅导致严重的环境污染，而且造成资源的巨大浪费。

一、实验设计实验序号实验三实验名称特定产物工业生产菌种发酵试验时间2010年13日-23日实验室基础生物2（121）一、实验目的1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.3、了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素二、实验与原理1、果胶酶概况（1）、果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。

（2）、果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。

（3）、产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。

（4）、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。

2、果胶酶的酶活测定方法（1）、粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。

（2）、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。

（3）、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。

（4）、还原糖法（DNS法）：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。

3、微生物发酵生产产品受以下条件制约：（1）、培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子（2）、培养条件：温度、pH、溶解氧等（3）、附加条件：诱导物、表面活性剂等4、酶催化反应的进行受多种因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂三、设备与材料（一）、培养基1、菌种筛选使用培养基（1）、基本培养基:果胶1% 、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1%、pH4.5、琼脂2.0%。

（2）、分离培养基：果胶0.5%、磷酸氢二钠0.5%、琼脂2.0%、H4.5。

产果胶酶黑曲霉的筛选及诱变育种1.实验材料1.1菌种由中科院提供1.2.1斜面培养基察氏培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，七水合硫酸锰0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，水1000mL。

（121度灭菌20min）1.2.2平板分离培养基（察氏培养基）1.2.3果胶平板培养基（％）磷酸氢二钾0.1，硝酸钠0.3，硫酸镁0.05，硫酸铁0.001，琼脂2.0，果胶0.2，pH5.51.2.4固体发酵复筛培养基1.麸皮10g，豆粕0.25g，硝酸钠0.35g，硫酸铵0.1g，装入250mL三角瓶，按料水比（w/v）1：1.5加入pH5.0~5.5的水。

（0.1Mpa/cm2灭菌30min）2试验方法2.1出发菌种的筛选2.1.1菌种的活化取斜面培养基的黑曲霉菌种一支，接种于察氏斜面培养基，36℃恒温培养5~7天。

2.1.2制备孢子悬液取活化的斜面一支，加入无菌水洗下孢子，制成均匀的孢子悬液，调整孢子浓度为1.0×106个/mL。

（参考一定浓度菌悬液的制备，比较几种方法的准确度）2.1.3平板分离将菌悬液进行系列稀释，使之成为十万、一万、一千、一百个孢子每毫升，并分别涂布与果胶平板培养基，36℃恒温培养5~7天。

2.1.4菌种的筛选1向平皿中加入5mL碘液，静止2min，即可见清晰的透明圈，将碘液倒出加入5mL生理盐水10min，将剩余碘液冲洗干净，选取透明圈与菌落直径比大的接种与斜面培养基，并分别进行固体发酵，选取酶活力高的作为出发菌株。

2黑曲霉的直径之比最大，说明它的产酶能力较高，所以采用黑曲霉作为出发菌株。

实验采用刚果红平板培养基作为筛选培养基，培养基中果胶作为唯一碳源，又作为底物诱导物，诱导果胶酶的产生。

刚果红作为透明圈指示剂，可能与果胶形成红色络合物，果胶酶分解果胶络合物消失，在平板上形成透明水解圈。

透明圈与菌落直径之比越大，酶活力越高。

2.2紫外线照射剂量的选择2.2.1取36℃恒温培养5天的出发菌种斜面，用生理盐水洗下孢子，将孢子悬浮液置于无菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，震荡使孢子分散，再以双层无菌擦镜纸过滤，使形成分散程度达到90~95％的单孢子悬液。