酶活力测定

酶活力测定
酶是一种能够催化生物体内化学反应的蛋白质，广泛存在于动植物、微生物、真菌等
生物体内。

酶在生理代谢、免疫系统、消化系统等方面扮演着重要的角色。

因此，对于酶
的活力测定十分重要。

下面将详细介绍酶活力测定方法。

酶活力测定的基本原理是通过测定一个给定反应体系下酶所催化的底物转化速度来确
定酶的活力。

酶活力的测定通常采用标准曲线法、比色法、荧光法、放射性同位素标记法、酶电极法等多种方法。

其中，比色法和荧光法是最为常用的两种方法。

二、比色法
比色法是通过反应体系中某一底物和产物的比色反应来测定酶的活力。

常用的比色反
应有蛋白质和氨基酸比色法、尿素酶测定法等。

以蛋白质和氨基酸比色法为例，其测定步骤如下：
1. 选定底物，例如眼镜蛇毒素，反应物为酸性的巴氏液
2. 选定测定时点，例如反应20分钟之后
3. 加入颜色试剂，例如Folin验液，使反应产生深色络合体
4. 测定吸光度，根据标准曲线计算出反应深度，从而计算出酶的活力值
三、荧光法
荧光法是通过酶催化的底物转化产生的荧光信号来测定酶活力。

荧光法具有高灵敏度、高精度、高速度、低误差等优点，越来越受到人们的关注。

1. 选择荧光素为底物，荧光素在激发光的作用下会发出荧光信号
2. 酶催化荧光素转化为羟基荧光素，生产出更强的荧光信号
四、注意事项
酶活力测定的过程中需要注意以下几个方面：
1. 选择适当的反应体系、底物和试剂
2. 在测定前保持合适的反应条件（例如pH、温度等）
3. 为了获得比较准确的测定结果，需要进行多次测定
4. 保证测定设备和试剂的质量和准确性。

说明测定酶活力时的一般步骤
酶活力的测定呀，就像是一场小小的科学探险呢。

咱先得准备好各种东西。

要有合适的底物，这底物就像是酶要去攻克的小城堡一样。

还有缓冲溶液，这就像给整个反应创造一个舒适的小环境，让酶能舒舒服服地工作。

当然啦，酶的样品肯定不能少呀。

然后呢，就开始把这些东西混合在一起。

把酶和底物放在一起的时候，就像是一场奇妙的相遇。

这时候反应就开始啦，酶就像一个超级小工匠，开始对底物进行加工改造。

在反应进行的时候呀，我们得注意时间哦。

就像烤小饼干，烤太久就糊了，反应时间太长或者太短都不行。

要选择一个恰到好处的时间点，这个时间得根据酶的特性来定呢。

接着呢，我们要想办法检测反应的结果。

这就有很多有趣的方法啦。

比如说，如果反应产生了有颜色的东西，那我们就可以用比色法，就像看哪个小溶液颜色更漂亮一样。

或者如果有气体产生，我们还可以测量气体的量呢。

等检测完结果之后呀，我们就能根据这些数据来计算酶的活力啦。

这个计算过程就像是在解一个小谜题，根据我们之前知道的一些规则和数据，算出酶到底有多能干。

不过在整个过程中呀，可一定要小心呢。

就像照顾小宠物一样，每个小细节都要注意到。

比如说温度呀，温度不合适的话，酶可能就会偷懒不干活啦。

还有pH值，要是这个没调好，酶可能也会闹小脾气呢。

测定酶活力虽然听起来有点复杂，但就像做一个超级有趣的小实验，每一步都充满了惊喜和发现哦。

生物样品预处理预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作均在4℃下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl 溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。

将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆（匀浆比（W/V）1:5），腮组织放入组织匀浆（匀浆缓冲液含40mmol/L咪唑，250mmol/L蔗糖，5mmol/L EDTA，pH7.0），匀浆比为1:40，匀浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。

分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4℃下离心(9000g，20min)，取上清液-80℃下保存，待测。

（1）250mL 0.15 mol/L KCl：取2.7956g（2）Tris-HCl缓冲液：125mL 0.1 mol/L Tris（1.5143g）+ 105mL 0.1 mol/L HCl+ KCl（0.15*0.23*74.55=2.5720g）（Na+＋K+）－ATPase活性的测定1、试剂（1）匀浆液（250ml）：40mmol/L咪唑0.6808g+250mmol/L蔗糖21.3931g +5mmol/LEDTA 0.3653g（2）反应缓冲液（250ml）：80mmol/L咪唑 1.3616g+4mmol/LMgCl2 0.2033 g+40mmol/LKCl 0.7455g（3）16mmol/L Na2ATP（10ml）：0.0988g（4）30%三氯乙酸（TCA）9g TCA+21mlH2O（5）定磷试剂（硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml）：10ml 5mol/LH2SO4+1.3556 g钼酸铵+90mlH2O每10ml加入FeS040.5g（FeS04·7H2O 0.0941g），25ml加入FeSO4·7H2 O 0.2353g，临用前配制。

酶活力测定实验报告一、实验目的酶活力测定实验的主要目的是了解酶的活性及其影响因素，掌握测定酶活力的基本方法和原理，以及学会使用相关仪器和试剂进行实验操作。

二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质或核酸。

酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用在一定条件下酶催化反应的速度来表示。

本实验采用分光光度法测定酶活力，其原理是基于酶催化反应所产生的产物在特定波长下具有光吸收特性，通过测定反应体系在该波长下吸光度的变化，可以计算出酶催化反应的速度，从而反映酶的活力。

以过氧化氢酶为例，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。

在本实验中，通过加入一定量的过氧化氢溶液，使其与过氧化氢酶反应，然后使用高锰酸钾溶液滴定剩余的过氧化氢，根据高锰酸钾溶液的用量计算出过氧化氢酶的活力。

三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的猪肝或土豆等富含过氧化氢酶的组织。

过氧化氢溶液（3%）。

高锰酸钾溶液（002 mol/L）。

磷酸缓冲液（pH 70）。

2、实验仪器研钵。

离心机。

移液器。

分光光度计。

恒温水浴锅。

试管、量筒、容量瓶等玻璃仪器。

四、实验步骤1、酶液的制备称取新鲜的猪肝或土豆组织_____g，置于研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH 70），研磨成匀浆。

将匀浆转移至离心管中，以_____rpm 的转速离心_____min，取上清液即为粗酶液。

2、酶活力的测定取_____支试管，分别标记为 1、2、3。

在 1 号试管中加入_____mL 磷酸缓冲液（pH 70）作为空白对照，在 2、3 号试管中分别加入_____mL 粗酶液。

向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 过氧化氢溶液（3%），立即摇匀，并同时开始计时。

在反应进行_____min 后，迅速向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 浓度为 2 mol/L 的硫酸溶液终止反应。

用移液器吸取_____mL 反应液，加入到另一支装有_____mL 高锰酸钾溶液（002 mol/L）的试管中，摇匀。

1、酶活力测定：样品待测液用0.5MpH6.5磷酸盐缓冲液适当稀释（稀释倍数因酶含量不同而异，可参考下表）。

测定时，取样品稀释液0.5毫升，37℃预热2分钟，加入37℃预热的底物0.5毫升，精确反应15分钟后加入乳化剂2毫升，停止反应。

反应液3000转/分离心10分钟，上清液在721型分光光度计上于540毫微米波长处比色，空白管以缓冲液代替酶，其它操作同上。

附：艳红K-2BP标记溶性微球菌
M.lysodeikticus的制备
1、菌体的培养与收集：取菌种Micrococcus lysodeikticus 634，接种于肉汤培养基（牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、琼脂：2.5%、pH7.5压力为1 03.4Kpa，灭菌15分钟）。

37℃培养48~72小时后收集菌体，先用蒸馏水后用丙酮反复洗涤，最后用乙醚处理，可得到干燥菌体。

2、艳红K-2BP标记溶性微球菌M.lysodeikticus：取干燥菌体5g，加入50毫升1.25mol/LNaOH，再加2.5克活性染料艳红K-2BP（上海染化入厂生产）搅拌均匀，于25℃水浴放置24小时进行染色后，3000r/min离心10分钟收集红色菌体。

染色菌体反复用蒸馏水洗涤并离心，以尽量除去末参加反应的游离染料，必要时再用强碱性711树脂在搅拌下进行处理（树脂处理成Cl—型，pH7，树脂的湿重量约为染色菌体的50倍），除去未能洗尽的游离染料，反复处理直到上清液无色。

由此得到净化的染色菌体，直接悬于0.5mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液内，制成浓度为1%底物溶液。

或者将
染色菌体冻干或制成丙酮粉，使用时再磷酸盐缓冲液配制。

木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。

2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。

吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。

3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。

待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。

4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。

0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。

5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。

冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。

此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。

使用前重新确认并调整pH至规定值。

二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。

L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。

表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。

以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。

利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。

其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。

2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。

然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。

测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2mi n加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2mi n加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。

酶活力的测定实验报告酶活力的测定实验报告引言：酶是一类生物催化剂，能够加速生物体内化学反应的速率。

酶活力的测定是生物学实验中常见的实验之一，通过测定酶活力的大小，可以了解酶在不同条件下的催化效果，进而研究酶的特性及其在生物体内的作用机制。

本实验旨在通过测定过氧化氢酶的活力，探究酶活力与温度、酶浓度和底物浓度的关系。

材料与方法：1. 实验所需材料包括过氧化氢酶溶液、过氧化氢底物、缓冲液、显色剂等。

2. 实验仪器包括分光光度计、试管、移液器等。

3. 实验步骤：a. 准备一组不同温度下的试验样品，分别将过氧化氢酶溶液和过氧化氢底物按照一定比例混合，并加入适量的缓冲液。

b. 在不同温度下，将试验样品分别放入预先恒温的水浴中反应一定时间。

c. 取出反应后的试验样品，加入显色剂，并在分光光度计中测定吸光度。

d. 重复上述步骤，分别改变酶浓度和底物浓度，进行实验。

结果与讨论：通过实验测定，我们得到了不同条件下的酶活力数据，并进行了分析和讨论。

1. 温度对酶活力的影响：在实验中，我们分别将试验样品置于不同温度下进行反应，结果发现酶活力随温度的变化呈现一定的规律性。

当温度较低时，酶活力较低，随着温度的升高，酶活力逐渐增加，但当温度超过一定范围后，酶活力开始下降。

这是因为酶是一种蛋白质，其结构在高温下容易受到破坏，从而导致酶活力的降低。

2. 酶浓度对酶活力的影响：在实验中，我们分别改变了酶的浓度，结果发现酶浓度对酶活力有着明显的影响。

当酶浓度较低时，酶活力较低，随着酶浓度的增加，酶活力逐渐增加，但当酶浓度超过一定范围后，酶活力开始趋于饱和，增加酶浓度对酶活力的提高效果不明显。

这是因为酶浓度的增加会导致底物与酶结合的速率增加，但酶分子之间的竞争也会增加，从而限制了酶活力的提高。

3. 底物浓度对酶活力的影响：在实验中，我们分别改变了底物的浓度，结果发现底物浓度对酶活力也有着明显的影响。

当底物浓度较低时，酶活力较低，随着底物浓度的增加，酶活力逐渐增加，但当底物浓度超过一定范围后，酶活力开始趋于饱和，增加底物浓度对酶活力的提高效果不明显。

酶活力测定的方法
酶活力测定的方法有多种，下面列举常用的几种方法：
1. 比色法：通过测定酶反应产生的可见光吸收或色素形成来间接测定酶活力。

常用的比色法有尼林蓝法、间苯二酚法、对苯二酚法等。

2. 发光法：利用酶催化的氧化还原反应产生的发光信号来测定酶活力。

常用的发光法有荧光发光法、葡萄糖氧化酶法等。

3. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。

4. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。

5. 凝胶电泳方法：通过观察酶在凝胶上的迁移距离或酶活性的带状图案的强度来测定酶活力。

6. 标记物法：利用酶催化与标记物反应产生的物质变化来测定酶活力，常用的标记物有放射性同位素、酶标记物等。

以上是常用的酶活力测定方法，不同方法适用于不同类型的酶和反应体系。

在实
际应用中，需要根据具体情况选择最合适的方法来测定酶活力。

④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。

几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。

如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。

该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。

酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。

酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。

为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。

而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。

下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。

紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。

能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。

【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。

【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。

2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。

SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。

自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。

欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。

【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。

酶活力测定实验报告酶活力测定实验报告引言：酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的速率，对于维持生物体内的代谢平衡起着重要的作用。

酶活力测定实验是一种常用的实验方法，通过测量酶催化反应中底物消耗量或产物生成量的变化，来间接反映酶的活性水平。

本实验旨在通过测定过氧化氢酶（catalase）在不同温度下的活性变化，探究酶活性与温度之间的关系。

材料与方法：1. 实验仪器：分光光度计、恒温水浴槽。

2. 实验试剂：过氧化氢酶溶液、过氧化氢底物溶液、磷酸盐缓冲液。

3. 实验步骤：a. 在分光光度计中设置波长为240nm。

b. 准备一组含有过氧化氢酶、过氧化氢底物和磷酸盐缓冲液的混合溶液，作为实验组。

c. 将实验组的混合溶液分别置于不同温度的恒温水浴槽中反应一段时间。

d. 取出反应后的混合溶液，通过分光光度计测定其吸光度，得到反应速率。

e. 重复以上步骤，分别在不同温度下进行实验，并记录实验数据。

结果与讨论：通过实验测定，我们得到了不同温度下过氧化氢酶的活性变化曲线。

实验结果显示，随着温度的升高，过氧化氢酶的活性呈现出先增加后降低的趋势。

在较低温度下，酶的活性较低，反应速率较慢；随着温度的升高，酶的活性逐渐增强，反应速率也随之增加；然而，当温度超过一定范围后，酶的活性开始下降，反应速率逐渐减小。

这一结果可以解释为酶的活性受到温度的影响。

酶是一种蛋白质，其活性受到温度的变化而变化。

当温度升高时，酶分子内部的振动加剧，使得酶与底物之间的碰撞频率增加，酶活性增强；然而，当温度过高时，酶分子的结构开始发生变化，部分酶分子失去了原有的构象，导致酶活性下降。

这种变化可能是由于酶分子的部分构象发生变化，使得酶活性中心的空间结构发生改变，从而影响了酶与底物之间的互作用。

此外，实验结果还表明，酶活性与温度之间存在一个最适温度。

在最适温度下，酶的活性达到最高点，反应速率最快。

这是因为在最适温度下，酶分子的结构处于最稳定的状态，酶活性中心与底物之间的互作用最为紧密，因此反应速率最高。