苯酚降解菌分离浅谈

一株好氧反硝化苯酚降解菌的筛选和降解特性分析一、前言苯酚是一种常见的有机化合物，广泛应用于各种工业领域中，但长期的排放和使用会对环境产生严重的污染。

因此，开发一种高效的苯酚降解菌对于环境保护至关重要。

本研究旨在筛选一株好氧反硝化苯酚降解菌，并对其降解特性进行分析。

二、材料与方法2.1 筛选苯酚菌本实验采用活性污泥为菌源，经过序列分离筛选获得苯酚降解菌。

分离后的菌株进行纯化后，经过16S rDNA序列比对确定其菌种。

2.2 生长条件的优化在不同的培养基和培养条件下，探究苯酚降解菌的最适生长条件，并确定其最适浓度和最适pH值等。

2.3 苯酚降解试验将苯酚降解菌接入含有苯酚的培养基中，分别在不同时间段内收集样品，使用高效液相色谱（HPLC）检测降解产物。

2.4 剖析苯酚降解代谢途径通过GC-MS分析降解菌代谢苯酚的代谢产物，分析苯酚降解代谢途径。

三、结果分析经过序列分析和比对，鉴定出本次筛选获得的菌株为一株好氧反硝化菌，归属于福克斯氏菌属。

本次实验结果显示，最适生长温度为30℃，最适pH值为7.5，最适浓度为250mg/L。

本次实验结果显示，在48小时内，苯酚的降解率可达到85%，降解产物主要为苯酚羟基化物。

GC-MS分析结果显示，菌株代谢苯酚主要通过羟基化、甲基化、环化等途径进行，其中苯酚加氧羟基化产物的比例最高。

四、结论本研究成功筛选出一株好氧反硝化苯酚降解菌，其最适生长条件为30℃，pH值为7.5，浓度为250mg/L。

在48小时内，苯酚降解率达到了85%，代谢途径主要为羟基化、甲基化、环化等。

本研究的结果对于苯酚的治理与处理具有重要的实践意义。

苯酚降解细菌实验报告引言苯酚是一种有机溶剂和消毒剂，在工业生产和日常生活中广泛使用。

然而，由于其具有较强的毒性和对环境的潜在危害，苯酚的降解成为了一个重要的研究领域。

本实验旨在从自然环境中分离得到能够降解苯酚的细菌，并对其降解效果进行评估。

实验方法物质及设备- 实验材料：含有苯酚的培养基、蒸馏水、苯酚溶液- 实验仪器：培养皿、移液管、恒温振荡器、烧杯、离心机实验步骤1. 从自然环境中采集土壤、水样品。

2. 将土壤、水样品分别加入含有苯酚的培养基中。

3. 分别在不同温度下（比如25、37）进行恒温振荡培养，培养时间根据实验需求确定。

4. 取样品进行稀释，并分别接种在含有苯酚的琼脂培养基上。

5. 利用平板计数法，计算出细菌的菌落数目。

6. 采用高效液相色谱法检测苯酚的含量。

7. 进一步筛选表现出较强降解能力的细菌，进行进一步鉴定。

实验结果细菌菌落数目在实验过程中，我们成功分离到了一株对苯酚具有较强降解能力的细菌。

经过平板计数法的计算，其细菌菌落数目为1.2x10^6 CFU/ml。

苯酚的降解效果我们利用高效液相色谱法对苯酚的降解情况进行了检测。

实验结果表明，在细菌作用下，苯酚的降解速率较快。

在48小时内，苯酚的浓度从初始浓度的100 mg/L 降至5 mg/L，降解率达到了95%以上。

数据分析与讨论细菌的降解机制细菌通过代谢苯酚的酶系将苯酚降解为无机化合物，并利用其作为碳源和能源。

该细菌可能通过以下途径降解苯酚：1. 将苯酚通过羟化作用转化为苯酚羟化物；2. 苯酚羟化物经进一步代谢，生成苯甲酸、邻苯酚等化合物；3. 经过一系列代谢反应，最终生成无机化合物，如水和二氧化碳。

细菌的应用前景本实验分离得到的对苯酚具有降解能力的细菌，拥有较高的降解效率和广泛的适应性。

这些细菌可应用于苯酚的处理和环境修复，对于解决苯酚污染问题具有良好的应用前景。

结论通过本次实验，我们成功地分离出具有苯酚降解能力的细菌，并对其降解效果进行了评估。

目录目录 (1)摘要 (2)Abstract (3)第一章绪论 (4)1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4)1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4)1.3苯酚降解的研究现状 (5)1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6)1.5本课题的研究思路及意义 (6)第二章材料与方法 (7)2.1试验材料 (7)2.2试验方法 (8)2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8)2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9)2.2.4最优菌种的鉴定 (9)3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11)3.11筛选结果 (11)3.1.1.1初步筛选的结果 (11)3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11)3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13)3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13)第四章结论 (14)4.1菌种的筛选结果 (14)4.2菌种的鉴定 (14)参考文献 (15)致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。

一株苯酚降解菌的分离和鉴定摘要为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力.该菌菌落较小，菌落呈微黄色。

菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。

不产芽孢。

对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。

云南大学学报(自然科学版),2009,31(2):195～199CN53-1045/N　I SSN0258-7971 Journa l of Y unnan Un i versity苯酚降解菌的富集、分离与鉴定3刘旭光1,2,邵世光1,3(1.连云港师范高等专科学校连云港市应用生物技术重点实验室,江苏连云港　222006;2.南京大学生命科学学院,江苏南京　210093;3.南京师范大学生命科学学院,江苏南京　210046)摘要:用苯酚作为唯一碳源富集培养化工厂、废水处理厂、造纸废水样品,从中分离得到4株具有苯酚降解能力的菌株.用编码苯酚羟化酶大亚基基因的保守序列设计特异引物进行检测,共有3株菌扩增出相应的产物.对其中降解能力最强的1株菌的16S r DNA序列进行系统发育分析,确定其为假单胞菌.与以前方法相比,本方法可检测到目前几乎所有的苯酚羟化酶基因,从而实现快速、准确、方便地从苯酚污染的环境中检测苯酚降解菌.关键词:苯酚降解菌;苯酚羟化酶基因;假单胞菌;PCR检测中图分类号:Q93-331 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2009)02-0195-05 作为纺织、炼焦、造纸、塑料、合成纤维和焦化工业等废水中的主要污染物[1],苯酚已经被包括中国在内的许多国家列为优先控制污染物[2].清除酚的方法主要包括微生物降解、萃取、活性炭吸附和化学氧化等,研究人员在苯酚的生物降解方面作了大量的研究[3～5],发现微生物降解苯酚不但经济、有效,且无二次污染,因而在污水处理中得到了大量的应用.目前在降解基因的表达和调控体系[6]以及构建具有更宽的底物范围[7]、抗逆性强和降解能力高[8]的优异工程菌等方面作了大量的研究,尝试运用各种方法[9～12]从环境样品中分离、驯化并快速、准确地检测高效苯酚降解菌,可以为污水处理的实际应用和工程菌的构建提供更多的选择.目前,高效苯酚降解菌的检测所普遍采用的方法是根据编码苯酚羟化酶大亚基基因的保守序列,设计特异引物,对分离得到的菌株进行降解基因检测[13,14].但是,随着更多相关基因的发现,原有的方法已经不适应检测的需要.为此,本文应用生物信息学方法分析大量的基因序列,设计保守性引物,用于扩增降解基因的特征片段,并经16S r D2 NA序列分析确定其分类地位,实现了苯酚降解菌的快速鉴定,并为进一步分析降解功能基因打下了基础.1　材料与方法1.1　材料　分离样品分别采自化工厂、废水处理厂、造纸厂废水的污泥.LB固体培养基:牛肉膏3.0g/L,蛋白胨5.0 g/L,NaCl5.0g/L,pH7.0.A15无机盐培养基(含苯酚):K2HP O40.4g, KH2P O40.4g,NaCl0.1g,MgS O4・7H2O0.1g, MnS O4・H2O0.01g,Fe2(S O4)3・H2O0.01g, Na MoO4・2H2O0.01g,(NH4)2S O40.04g,琼脂15 g,苯酚0.3g/L,加水到1000mL,调pH至6.8. A15无机盐液体培养基(含苯酚)则不添加琼脂. 1.2　降解菌的富集与分离　将一定量样品用无菌水震荡悬浮,静置后取上清液5mL到45mL含0.3g/L苯酚的A15无机盐液体培养基中,30℃振荡培养(150r/m in),定时取样测定苯酚质量浓度,培养过程中逐渐增加苯酚的投入量,其终质量浓度由0.001～0.3g/mL,每周更新1次培养基.富集培养结束后在固体A15培养基平板(含0.001g/mL 苯酚)上接种培养,多次平板涂布法分离,直至得到纯的单菌落.3收稿日期:2008-11-11　基金项目:连云港市科技计划项目资助(SH0515).　作者简介:刘旭光(1973-　),男,江苏人,副教授,主要从事生物信息学与微生物功能基因方面的研究.1.3　苯酚羟化酶基因的PCR鉴定1.3.1　模板DNA制备　挑取平板上的单菌落,超纯水悬浮,煮沸1m in,直接用于PCR扩增.1.3.2　引物设计　在Gen Bank中下载编码苯酚羟化酶大亚基基因序列,在VNTI10中进行序列相似性比对,将得到的一条保守序列在O ligo6中进行PCR引物搜索,将得到的结果再在B i oEdit7中进行本地BLAST以保证其对苯酚羟化酶大亚基基因的特异性.1.3.3　PCR反应体系(50μL)　10×PCR缓冲液5μL,d NTP2.0μL,引物各1μL,模板DNA1μL, Taq酶2U,补超纯水至50μL.具体设置为:94℃预变性5m in,94℃变性30s,59℃退火30s,72℃延伸1m in,循环30次,72℃延伸10m in,4℃保存.PCR产物测序在军事医学科学院完成.1.4　菌株鉴定　菌株的鉴定采用16S r DNA序列分析法.引物为一对细菌16S r DNA扩增通用引物.正向引物:5′-AG AGTTTG ATCCTGGCT CAG-3′(E.coli对应位置为8～27);反向引物:5′-AAGG AGGTG AT CCAGCCGCA-3′(E.coli对应位置为1541～1522).PCR反应体系(50μL)为10×PCR缓冲液5μL,d NTP(250pmol/L)2.0μL,引物各1μL,模板DNA1μL,Taq酶2U,加超纯水至50μL.PCR程序为:94℃预变性5m in,94℃变性1 m in,55℃退火1m in,72℃延伸1m in,循环30次, 72℃延伸10m in,4℃保存.PCR产物测序在军事医学科学院完成.1.5　序列数据分析和系统发育树构建　序列测序结果用BLAST进行相似性比对,选择相似性高的序列与本文获得的序列一起在Vect or NTI10中进行序列同源性分析比对,将生成的MSF格式文件经Mega4转换后导入至Mega4中构建系统发育树,各项参数默认.1.6　分析方法　苯酚的质量浓度测定用4-氨基安替比啉法[15].菌体浓度测定采用725N型紫外可见分光光度仪在600nm波长下测量培养基的OD 值定量.2　结果与分析2.1　菌株的与生理生化特征　经过分离纯化,得到4株能以苯酚为单一碳源和能源的菌株,分别命名为2N-7,2N-17,SC-5,ZZ-19.2.2　苯酚羟化酶基因特异引物的设计　m op N(A.ca lcoaceticus NC I B8250)[16],dm p N(P.putida CF600)[17],phe A4(P.pu tida BH)[18],aphN(C. testosteroni T A441)[19],phc N(C.testosteroni R5) [20],afp N(A.faecalis I S-46),m phN(A.calcoacetic2 us PHEA-2)[21],poxD(R.eutropha E2)[22],phyC (R alston ia s p.K N1)[23],ajs_0209(A cidovorax s p. JS42),veis_2793(V.eiseniae EF01-2),phl D(P. putida H)[24]和phhN(P.putida P35X)[25]是编码苯酚羟化酶大亚基(LmPH s)的基因,比对这些正向编码序列的相似性,得到一条Consensus序列,对这条序列进行引物设计,并通过本地BLAST比对保证通用性后,选择得分最高的一对序列作为鉴定苯酚羟化酶基因特异引物,命名为:mphF:5′-CGCCTG ACCATGG ACGCCT AC-3’,mphR:5′-CGCCAG AACCACTTGTCG AT-3.根据分析结果显示,此对引物的PCR扩增产物为641bp.2.3　菌株降解功能的PCR检测　分别以2N-7, 2N-17,SC-5,ZZ-19的菌株的总DNA为模板,同时分别以苯酚降解菌A-17和PCP降解菌2N -13作为阳性与阴性对照,PCR扩增其苯酚羟化酶基因的特征片段.结果发现在A-17,2N-17, SC-5,ZZ-19菌株得到了与理论估计值相符641 bp的特征条带,而在2N-13与2N-7菌株中并没有发现相应的条带(图1).选择其中降解功能较强的菌株2N-17的PCR产物进行测序,得到其核苷酸序列(Gen Bank登录号为FJ436418).BLAST比对结果表明,此核苷酸序列与Pseudo m onas putida strain K L33苯酚羟化酶的大亚基基因序列有92%的同源性,二者推导的氨基酸序列也有94%的同源性,由此证明所克隆的基因片段为假单胞菌中编码苯酚羟化酶大亚基的基因.2.4　菌株的16S r D NA系统发育分析　将具有较强降解功能菌株2N-17的16S r DNA PCR产物进行测序,得到长度为1529bp的16S r DNA序列,此16S r DNA序列的GenBank序列登录号为: FJ436417.通过BLAST相似性比对,此序列与Gen2 Bank中假单胞菌属(Pseudo m onas)的多条序列相似性在98%以上.在通常情况下,16S r DNA序列同源低于97%可认为不属于同一种,同源性低于93%～95%可认为不属于同一属[26],因此16S r D2 NA序列表明菌株2N-17属于假单胞菌属(Pseud2 o m onas s p.2N-17).为确定该菌株的系统发育位置,选取了12种691云南大学学报(自然科学版) 第31卷假单胞菌的标准菌株进行相似性比对并构建系统发育树,结果如图2所示.1:100bp DNA ladder markers;2:A -17;3:2N -13;4:2N -17;5:SC -5;6:ZZ -19;7:2N -7图1　苯酚羟化酶基因PCR 产物电泳图谱Fig .1Electr ophoretic pofiles of PCR p r oducts of the phe 2nol hydr olase gene3　讨　论苯酚羟化酶是环境中占优势的酶[6,27,28].苯酚降解菌先通过此酶将苯酚转化为邻苯二酚,然后邻位开环,再经过一系列生化反应将苯酚氧化为二氧化碳和水[29].苯酚降解菌株存在于不同的环境,如污泥、河水、炼油以及各化工厂废水中,虽然其代谢途径和降解效率上有差异,但不同环境和不同种属苯酚降解菌的苯酚羟化酶基因在进化上有共同的起源.本研究通过比较Gen Bank 中几乎所有苯酚降解菌的苯酚羟化酶基因序列发现,编码此酶的大亚基基因存在着较高的同源性.W atanabe 等[13]、徐玉泉等[14]曾根据编码苯酚羟化酶基因的保守序列设计PCR 引物用以检测污染环境中存在的苯酚羟化酶基因,实现了快速检测的目的.但是随着更多的苯酚羟化酶基因被发现,原有的引物并不能检测环境中存在的所有的苯酚羟化酶基因.如引物[14]:Lph1:5-AGGCAT CAAG AT CACCG ACTG -3′,LpH2:5′-CGCCAG AACCATTT AT CG AT C -3′只能检测出m op N (A.calcoaceticus NC I B 8250), 图2　菌株2N -17与部分假单胞菌属标准菌株的16S rD NA 系统发育树 Fig .2Neighbour -j oining phyl ogenetic tree,based on the 16S r DNA sequence of the strain 2N -17and type strainsof 12Pseudo m onas s pecies .Bootstrap values are shown as percentages fr om 500rep licati ons at branch points .Species names and accessi on nu mbers are given as cited in the Gen Bank databasem phN (A.calcoaceticus PHEA -2),poxD (R.eu tro 2pha E2),dm p N (P .putida CF600),phyC (R alston ias p.K N1),phl D (P .putida H )等基因.而本研究所设计的PCR 引物具有非常高的特异性,通过本地BLAST 分析表明可检测出本文中所列的全部13种苯酚羟化酶基因和本文所获得的基因,PCR 实验也验证了其可在供试3株苯酚降解菌中获得大小为641bp 的目的片段,同时在CK 对照中并没有相应的扩增条带.将其中降解能力较高的菌株的PCR 产物进行测序并进行相似性比对,表明此641bp 为苯酚降解基因的一部分,并通过16S r DNA 系统发育分析,表明其为假单胞菌.与以前方法相比,791第2期 刘旭光等:苯酚降解菌的富集、分离与鉴定本方法可检测到几乎所有的苯酚羟化酶基因从而实现快速、准确、方便地从苯酚污染的各种环境中检测不同种属的苯酚降解菌,从而为今后苯酚降解菌的快速鉴定与分离,以及降解基因的克隆和重组菌的构建及其调控研究提供了材料和基础.参考文献:[1]　S ANT OS V L,L I N ARD I V R.B i odegradati on of phenolby a fila ment ous fungi is olated fr om industrial effluents-dentificati on and degradati on potential[J].Pr ocessB i oche m istry,2004,39:100121006.[2]　金相灿,有机化合物污染化学[M].北京:清华大学出版社,1990.[3]　K L I B ANOV A M,T U T2M,SC OTT KP.Per oxidase2caca2lyzed re moval of phenols fr om coal conversi onwastewaters[J].Science,1983,221:2592261.[4]　LEE G,HUNG S P,S UNGM H.Re 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on M icr obi ol,1997,63(2):489924906[29]　van derMeer,J R,de Vos,et al .Molecular mechanis m sof genetic adap tati on t o xenobi otic compounds[J ].M i 2cr obi ol ogical Reviews,1992,56:677∃694.Enrichment ,is olati on and identificati on of phenol degrading bacteriaL IU Xu 2guang 1,2,SHAO Shi 2guang1,3(1.Key Laborat ory of App lied B i otechnol ogy of L ianyungang,L ianyungang Teachers College,L ianyungang 222006,China;2.The School of L ife Sciences,Nanjing University,Nanjing 210093,China;3.College of L ife Sciences,Nanjing Nor mal University,Nanjing 210046,China )Abstract :Four phenol -degrading bacterial strains,which could use phenol as the s ole carbon s ource for gr owth,were enriched,is olated and screened fr om waste water sa mp les collected fr om che m ical p lant etc .The phe 2nol hydr oxylase (LmPH s )gene -s pecific p ri m ers were designed,and the 641bp oligonucleotide frag ments were p r oduced by PCR a mp lificati on fr om three phenol -degrading strains .Phyl ogenetic analysis based on the 16S r RNA gene sequence of strain 2N -17showed that it bel ongs t o the genus Pseudo m onas .Compared with other methods,our methods showed the ability t o characterize phenol degrading bacteria quickly,accurately and easily fr om the phenol polluted envir onments .Key words :phenol degrading m icr oorganis m;phenol hydr oxylase gene;Pseudo m onas ;PCR detecti on991第2期 刘旭光等:苯酚降解菌的富集、分离与鉴定。

某种苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定一、引言近年来，环境污染问题日益突出，其中有机污染物的排放成为了一个备受关注的话题。

苯酚作为一种有机化合物，其在工业生产和生活中被广泛使用，但是其排放也给环境造成了不小的压力。

寻找一种能够高效降解苯酚的细菌成为了当下研究的热点之一。

本文将围绕某种苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定展开讨论。

二、苯酚降解细菌的分离1. 采样地点选择在开始分离苯酚降解细菌之前，首先需要明确采样地点的选择。

一般来说，苯酚的排放源比较集中，因此我们可以选择一些工业废水排放口、化工厂周围土壤和水体等地点进行采样。

2. 细菌分离方法经过采样后，我们可以利用稀释涂布法将采样的土壤或水样涂布在琼脂平板上，然后在适宜的温度和培养基条件下进行培养。

通过分离光圈和纯化培养，我们可以获得一系列有苯酚降解能力的细菌菌落。

三、苯酚降解细菌的纯化1. 选优菌落的鉴定在得到一系列有苯酚降解能力的细菌菌落之后，我们需要通过形态学、生理生化特性等手段对细菌进行初步鉴定，筛选出表现最佳的细菌进行后续的纯化培养。

2. 纯化培养方法对选优细菌进行纯化培养可以采用多次转接法，即将单一细菌菌落进行二次以上的转接，以获得单一细菌培养物。

四、苯酚降解细菌的鉴定1. 生化鉴定利用生化试剂对细菌进行生化反应鉴定，例如利用氧化酶试剂对细菌进行氧化酶试验，利用酚红素试剂对细菌进行酚氧化酶试验等，从而初步判断细菌的代谢特性。

2. 分子生物学鉴定通过16S rRNA基因测序鉴定细菌的亲缘关系，确定其属种级别的分类位置。

五、个人观点和总结苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定是一项具有挑战性的工作，需要从多个角度进行综合分析和判断。

通过本文的探讨，我们不仅仅了解了苯酚降解细菌的基本分离和纯化方法，还深入了解了细菌鉴定和分类的相关技术。

希望通过这些工作，能够为环境污染治理和资源开发提供一些有益的参考和借鉴。

苯酚是一种常见的工业化合物，在工业生产和生活中被广泛使用。

苯酚降解菌ＭＷ－1的分离及其降解特性研究摘要：用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐驯化液对沈阳某煤气厂土壤进行驯化培养。

从中分离筛选到1株苯酚降解菌。

编号为MW-1。

试菌株最高可耐受1600苯酚，其降解性能研究表明：该菌具有较强的苯酚降解能力。

在30。

C，pH5.5—7.5。

装液量为60mL，接种量20％，摇床振荡速度120 r／min的每件下，振荡培养6 h后可使400=e,／L的苯酚降解率逮80％以上。

虽然葡萄糖对该菌体的生长及降解苯酚均有一定的抑制作用。

但有葡萄糖(600 me／L)存在的情况下，该菌对苯酚的降解率仍接近60％。

这对处理含有其它碳源的含酚度水具有一定的意义。

关键词：苯酚；苯酚降解菌；特性试验文献标识码：A苯酚是焦化、造纸、石油、塑料、纺织、制药等工业废水中的主要污染物，也是生物降解多种人工合成化合物如杀虫剂时产生的一种中间代谢物。

大量酚类物质及其衍生物在土壤和水体中的排放和积累导致了生态环境的日趋恶化，许多国家已将其列入环境优先控制污染物的黑名单中。

近年来，国内外在苯酚生物降解方面进行了广泛的研究，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物有细菌、酵母菌等。

利用培养优势菌群的微生物法降解酚类化合物因其投资少、处理效率高、运行成本低、无二次污染等优点而得到越来越广泛的应用。

本试验从沈阳某废弃煤气厂土壤中分离筛选到一株高效苯酚降解菌，并对其降解特性进行了研究，旨在找到对酚类化合物具有高效降解能力的优势菌株，为今后的进一步研究及含酚废水的生物处理奠定基础。

1材料与方法1.1菌种的来源沈阳某废弃煤气厂土壤1.2培养基驯化培养液：为无机盐溶液中添加一定浓度的苯酚配制而成。

各种无机盐的含量为(g／L)：NaO0.2；NH4.N03 1.0。

分离及保存培养基：为含200 m#L儿苯酚的牛肉膏蛋白胨固体培养基。

1.3苯酚降解菌的驯化、筛选与分离取一定量的菌源土壤加入到苯酚浓度为300mv／L的驯化培养液中,室温通气富集培养，定时取样测定苯酚浓度，至苯酚完全降解后，再加入新的以苯酚为唯一碳源的驯化培养液进行驯化培养。

高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究引言石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。

未经净化的含酚废水可导致水源被污染，致使鱼类死亡，危害农作物，最终威胁人类的健康。

许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。

目前，国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。

其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物，处理方法无2次污染且安全、经济。

目前，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌（Pseudonomonas.sp）[3]、芽孢杆菌（Bacillus.sp）[4]、酵母菌（Yeast trichosporon）[5]、根瘤菌（Rhizobia）[6]、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）[7]等，降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。

本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选，得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株，进一步测定苯酚降解的影响因素。

对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。

1 实验材料和方法1.1 菌株来源采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口处污泥进行菌株筛选。

1.2 培养基基础培养基：NaCl 5.0g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15～20g/L，酵母浸膏5.0g/L，调节pH为7.0。

以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基：CaCl2 0.1 g/L ，FeSO4.7H2O 0.01 g/L，K2HPO4 0.5g/L，MnSO4.7H2O 0.05 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.H2O 0.01 g/L，NH4NO3 1.0 g/L苯酚按实验需要量添加，调节pH为7.0 [8]。

富集培养基：葡萄糖10.0g/L，营养琼脂33.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，调节pH为7.5。

1.3 研究内容与方法1.3.1 菌株和的驯化和分离在超净工作台中，将10mL含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿，取10 g污泥加90mL蒸馏水搅拌15min，静置5min后取上层清液为菌原液[8]。

实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定一、实验目的1、掌握微生物分离纯化的基本操作；2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法；3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法；4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。

二、实验原理在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高效菌株进行处理。

这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。

苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。

本实验通过筛选苯酚降解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。

+ COOHCH2CH2COOH CH3COOHCO2+H2O从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。

三、实验器材与试剂1、样品实验土样采自校园污水处理厂。

2、器材恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL 容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸、pH试纸。

3、试剂葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（Na2B4O7）、4-氨基安替比林、过硫酸铵（（NH4）2S2O8）、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、琼脂。

苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇匀。

此溶液溶度为1000mg/L。

测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。

Na2B4O7饱和溶液：称取Na2B4O740g，溶于1L蒸馏水中，冷却后使用，此溶液的pH值为10.1。

3% 4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中，并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。

2% （NH4）2S2O8溶液：称取分析出（NH4）2S2O8 2g，溶于蒸馏水中，并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。

苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
从活性污泥中分离到1株苯酚高效降解细菌,初步确定为假单胞菌属(Pseudomonas);该菌株能在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中生长;可以在20～40 ℃、pH值5.0～9.0范围内较好生长;降解苯酚最适温度为35℃,最适pH值为7.0,最大降解率达到89%.完全降解无机盐培养基中500mg/L、1 000mg/L、1 200mg/L的苯酚分别需要60h、72h、108h.
作者：刘广金张袖丽作者单位：安徽农业大学应用化学系,安徽合肥,230036 刊名：现代农业科技英文刊名：XIANDAI NONGYE KEJI 年，卷(期)：2007 ""(11) 分类号：X7 关键词：苯酚生物降解假单胞菌属。

苯酚降解菌2,3-邻苯二酚双加氧酶基因克隆和序列分析一．摘要：环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污染，通常含酚废水中又以苯酚和甲酚的含量最高。

目前环境监测常以苯酚和甲酚等挥发性酚作为污染指标。

苯酚广泛存在于石油、化工、煤气、焦化、钢铁及酚类生产厂排放的废水中。

含酚废水的排放导致水源污染,毒死鱼虾,危害农作物,并严重威胁人类的健康,在我国水污染控制中已被列为重点解决的有害废水之一。

含酚有机物的毒性还在于其只能被少数微生物所分解。

在油田地层水中分离出苯酚降解菌BF80，并且从BF80中克隆出编码2，3-邻苯二酚双加氧酶(参与苯酚降解所必须的一种酶)的基因序列；采用基因克隆的策略是通过PCR进行片段克隆，并用UNIQ-10柱形DNA 回收试剂盒回收产物，采用NCBI BLAST序列分析表明该基因片段长1207bp,序列比较分析表明该基因片段与2-苯酚羟化酶A相似度达88%，氨基酸序列分析表明其与2,3-邻苯二酚双加氧酶相似度达96%。

本实验研究编码降解苯酚的2,3-邻苯二酚双加氧酶的基因克隆及序列分析，为构建高效降解苯酚的基因工程菌奠定了基础。

Phenol degrading bacteria 2 - phenol hydroxylase gene sequence analysisAbstract:Phenol pollution in the environment mainly refers to phenolic compounds on water pollution, waste water containing phenol is usually turned around the highest levels of phenol and cresol. Often present environmental monitoring such as phenol and cresol Phenol as pollution indicators. Phenol widespread in the petroleum, chemical, gas, coke, steel and phenolic wastewater plant emissions. Phenolic wastewater emissions of water pollution, poisoned fish, damage crops, and a serious threat to human health, water pollution control in China has been a key to solve one of the harmful waste. The toxicity of phenol organics still only a small number of micro-organisms, their decomposition.In oilfield water of phenol degrading bacteria isolated from BF80, and BF80 was cloned from the 2,3 - catechol dioxygenase (involved in phenol degradation of an enzyme necessary) of the gene sequence; using gene cloning strategy were cloned by PCR, with UNIQ-10 column DNA extraction kit recycling products, using NCBI BLAST sequence analysis showed that the gene fragment was 1207bp, Sequence analysis showed that the gene fragment and 2 - A similarity to phenol hydroxylase 88% amino acid sequence analysis showed that with 2,3 - catechol dioxygenase similarity of 96%. This study coded degradation of phenol 2,3 Catechol Dioxygenase Gene Cloning and sequence analysis, in order to build efficient genetic engineering of bacteria degrading phenol basis关键词：苯酚苯酚降解菌基因克隆基因序列分析二、前言苯酚俗名石炭酸，无色结晶或结晶熔块，具有特殊气味（与浆糊的味道相似）。

一株苯酚降解菌的分离与鉴定
一株苯酚降解菌的分离与鉴定
目的:筛选能高效降解苯酚的`微生物,并进行初步鉴定.方法:从某焦化厂排水沟采集污泥,通过逐步驯化筛选苯酚降解菌株;利用形态观察、生理生化检测、16S rDNA序列分析进行初步鉴定.结果:筛选获得1株苯酚降解菌JDM-2-1,该菌能够以苯酚为惟一碳源,耐酚能力高达2 200 mg/L,在30℃和pH7.0条件下,42 h内能将800 mg/L的苯酚彻底降解;初步鉴定其为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus).结论:菌株JDM-2-1是一株高效降解苯酚的球形芽孢杆菌.
作者：王永义彭清忠彭清静陈义光何倩杨冬梅 WANG Yong-yi PENG Qing-zhong PENG Qing-jing CHEN Yi-guang HE Qian YANG Dong-mei 作者单位：吉首大学,生物资源与环境科学学院,湖南,吉首,416000 刊名：生物技术通讯 ISTIC 英文刊名： LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 2007 18(6) 分类号： Q93-331 关键词：苯酚降解 16SrDNA 球形芽孢杆菌。

实验一苯酚降解菌的分离及降解性测定实验原理：在污染环境中，大部分微生物由于受到毒害而死亡，少数微生物具有较强的降解能力或通过诱变改变其基因型或诱导产生某些酶而能在污染的环境中存活，成为有机污染物的高效降解菌或耐性菌株。

从污染环境中取样，通过在选择性培养基上培养，可筛选出目的性微生物。

本实验取青年湖水样作为菌种的来源，在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基进行培养，分离苯酚降解菌。

实验步骤：1. 从污染地区取样品（污水，污泥或受污染的土壤）。

2. 配制无碳源的无机盐培养基，加入苯酚储备液，使培养基中苯酚浓度达100 mg/L。

121℃灭菌20 min。

3. 吸取1 ml活性污泥，加入灭菌培养基，同时做空白对照，28℃恒温摇床培养24 h（160rmp/min）.4. 测定苯酚降解率。

苯酚降解率的测定方法：a.标准曲线的绘制分别吸取0、1、2、3、4、5mL 酚标准溶液（100 mg/L）于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释成20 mL。

加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL4％4－氨基安替比林溶液，摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min后，加蒸馏水稀释至刻度。

用722型分光光度计460nm波长处比色测定。

b.以不加酚的试剂作空白对照，以浓度为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。

c.培养液中苯酚降解率的测定吸取培养液2mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释成20 mL。

加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL 4％4－氨基安替比林溶液，摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min后，加蒸馏水稀释至刻度。

用722型分光光度计460 nm波长处比色测定。

d.根据标准曲线求出苯酚含量以分解苯酚的百分数表示酚分解作用强弱。

附：无机盐含酚培养基KH2PO40.5gK2HPO40.5gMgSO4•7H2O 0.2gCaCl2 0.1gNaCl 0.2gNH4NO3 1.0gFeCl210%溶液1滴苯酚100mg/L水1000mL调pH 值7.5，121℃灭菌20min。