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苯酚降解细菌实验报告引言苯酚是一种有机溶剂和消毒剂，在工业生产和日常生活中广泛使用。
然而，由于其具有较强的毒性和对环境的潜在危害，苯酚的降解成为了一个重要的研究领域。
本实验旨在从自然环境中分离得到能够降解苯酚的细菌，并对其降解效果进行评估。
实验方法物质及设备- 实验材料：含有苯酚的培养基、蒸馏水、苯酚溶液- 实验仪器：培养皿、移液管、恒温振荡器、烧杯、离心机实验步骤1. 从自然环境中采集土壤、水样品。
2. 将土壤、水样品分别加入含有苯酚的培养基中。
3. 分别在不同温度下（比如25、37）进行恒温振荡培养，培养时间根据实验需求确定。
4. 取样品进行稀释，并分别接种在含有苯酚的琼脂培养基上。
5. 利用平板计数法，计算出细菌的菌落数目。
6. 采用高效液相色谱法检测苯酚的含量。
7. 进一步筛选表现出较强降解能力的细菌，进行进一步鉴定。
实验结果细菌菌落数目在实验过程中，我们成功分离到了一株对苯酚具有较强降解能力的细菌。
经过平板计数法的计算，其细菌菌落数目为1.2x10^6 CFU/ml。
苯酚的降解效果我们利用高效液相色谱法对苯酚的降解情况进行了检测。
实验结果表明，在细菌作用下，苯酚的降解速率较快。
在48小时内，苯酚的浓度从初始浓度的100 mg/L 降至5 mg/L，降解率达到了95%以上。
数据分析与讨论细菌的降解机制细菌通过代谢苯酚的酶系将苯酚降解为无机化合物，并利用其作为碳源和能源。
该细菌可能通过以下途径降解苯酚：1. 将苯酚通过羟化作用转化为苯酚羟化物；2. 苯酚羟化物经进一步代谢，生成苯甲酸、邻苯酚等化合物；3. 经过一系列代谢反应，最终生成无机化合物，如水和二氧化碳。
细菌的应用前景本实验分离得到的对苯酚具有降解能力的细菌，拥有较高的降解效率和广泛的适应性。
这些细菌可应用于苯酚的处理和环境修复，对于解决苯酚污染问题具有良好的应用前景。
结论通过本次实验，我们成功地分离出具有苯酚降解能力的细菌，并对其降解效果进行了评估。
目录目录 (1)摘要 (2)Abstract (3)第一章绪论 (4)1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4)1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4)1.3苯酚降解的研究现状 (5)1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6)1.5本课题的研究思路及意义 (6)第二章材料与方法 (7)2.1试验材料 (7)2.2试验方法 (8)2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8)2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9)2.2.4最优菌种的鉴定 (9)3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11)3.11筛选结果 (11)3.1.1.1初步筛选的结果 (11)3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11)3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13)3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13)第四章结论 (14)4.1菌种的筛选结果 (14)4.2菌种的鉴定 (14)参考文献 (15)致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。
一株苯酚降解菌的分离和鉴定摘要为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力.该菌菌落较小，菌落呈微黄色。
菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。
不产芽孢。
对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。
一株酚降解菌株的分离鉴定及特性研究
含酚废水是一类危害大、污染范围广的工业废水，主要含有各种酚类化合物，如苯酚、对硝基苯酚、二甲酚等，其中苯酚是主要的污染物质。
苯酚毒性较大，对皮肤黏膜有腐蚀作用，并破坏微生物质膜，我国以及世界发达国家都将苯酚列为优先监测环境污染物。
酚类物质对生物活体均能产生毒害，如可使蛋白质凝固，可引起中枢神经痉挛，水溶液中的苯酚可被皮肤吸收而引起中毒川。
人们长期饮用受酚类化合物污染的水会引起头昏、贫血及各种神经系统疾病；当水中酚类含量大于10 mR／L时，鱼类等水生生物不能生存。
含酚浓度高的废水如用于灌溉，将导致农作物的减产和枯死。
含酚废水在我国被列为重点解决的有害废水之一。
某种苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定一、引言近年来，环境污染问题日益突出，其中有机污染物的排放成为了一个备受关注的话题。
苯酚作为一种有机化合物，其在工业生产和生活中被广泛使用，但是其排放也给环境造成了不小的压力。
寻找一种能够高效降解苯酚的细菌成为了当下研究的热点之一。
本文将围绕某种苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定展开讨论。
二、苯酚降解细菌的分离1. 采样地点选择在开始分离苯酚降解细菌之前，首先需要明确采样地点的选择。
一般来说，苯酚的排放源比较集中，因此我们可以选择一些工业废水排放口、化工厂周围土壤和水体等地点进行采样。
2. 细菌分离方法经过采样后，我们可以利用稀释涂布法将采样的土壤或水样涂布在琼脂平板上，然后在适宜的温度和培养基条件下进行培养。
通过分离光圈和纯化培养，我们可以获得一系列有苯酚降解能力的细菌菌落。
三、苯酚降解细菌的纯化1. 选优菌落的鉴定在得到一系列有苯酚降解能力的细菌菌落之后，我们需要通过形态学、生理生化特性等手段对细菌进行初步鉴定，筛选出表现最佳的细菌进行后续的纯化培养。
2. 纯化培养方法对选优细菌进行纯化培养可以采用多次转接法，即将单一细菌菌落进行二次以上的转接，以获得单一细菌培养物。
四、苯酚降解细菌的鉴定1. 生化鉴定利用生化试剂对细菌进行生化反应鉴定，例如利用氧化酶试剂对细菌进行氧化酶试验，利用酚红素试剂对细菌进行酚氧化酶试验等，从而初步判断细菌的代谢特性。
2. 分子生物学鉴定通过16S rRNA基因测序鉴定细菌的亲缘关系，确定其属种级别的分类位置。
五、个人观点和总结苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定是一项具有挑战性的工作，需要从多个角度进行综合分析和判断。
通过本文的探讨，我们不仅仅了解了苯酚降解细菌的基本分离和纯化方法，还深入了解了细菌鉴定和分类的相关技术。
希望通过这些工作，能够为环境污染治理和资源开发提供一些有益的参考和借鉴。
苯酚是一种常见的工业化合物，在工业生产和生活中被广泛使用。
含酚焦化废水降解酚菌的分离、纯化与筛选学院环境与资源学院专业环境工程年级 2009级姓名秦江涛学号 2009333026含酚焦化废水降解酚菌的分离、纯化与筛选[摘要]经过适当采样，采用一定的技术分离、筛选出多种优良的脱酚菌，然后观察记录其平板菌落特征，并通过革兰氏染色确定菌种为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
[关键词]焦化废水降解酚菌分离纯化筛选我国80%的焦化废水因含多环芳烃及杂环芳烃，经生物处理后，二沉池出水难以达到排放标准。
这类物质对常规生物处理系统中的微生物具有生物陌生性及毒性，很少在短时间内被活性污泥中的微生物利用而进入生物循环，有时还会使处理系统出现事故，造成微生物活性降低或大量中毒死亡，导致活性污泥处理系统出水水质恶化。
我小组从含酚焦化废水、活性污泥中筛选酚降解菌，并对酚降解菌进行初步观察，记录菌种形态。
以期将筛选菌与活性污泥混合，用于处理含酚焦化废水。
1 实验材料1.1.微生物来源试验所用菌种来源于某焦化厂废水处理系统曝气池中的活性污泥和含酚废水，装于无菌塑料瓶中，带回实验室。
置于冰箱中保存备用。
1.2 培养基分离纯化用普通牛肉膏蛋白胨培养基。
筛选、驯化培养基选用液体培养液，见表1。
1.3试剂苯酚，草酸铵结晶紫染液，碘液，95％的酒精，番红复染液，表1试剂等。
1.4 其他物品无菌水、无菌培养皿、无菌移液管、显微镜等。
2 实验方案2.1倒平板法分离纯化一般微生物在含苯酚培养基上不能生长，苯酚耐受菌株的筛选，可采用含不同浓度梯度的苯酚培养基倒平板。
使大量菌种中的少数耐酚菌在平板的一定浓度苯酚的培养基上生成菌落，从而分离出耐酚菌种。
（1）采集的泥样，用无菌移液管取10ml接入事先已灭菌且内装90ml无菌水的三角瓶中振荡20分钟，目的是打散胶团，使细菌成单细胞状态分散于水中。
（2）用无菌移液管分别移取一定量苯酚，与15ml牛肉膏蛋白胨培养基倒平板。
制成含酚浓度为200 mg/L ，300 mg/L ，400 mg/L， 500 mg/L ，600 mg/L，700 mg/L的培养基。
苯酚降解菌处理含苯酚废水研究现状摘要：苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药和医药合成等行业生产的重要原料，却对生态环境和人体健康构成巨大威胁，因此应对含酚废水进行处理使其达到国家排放标准。
本文从苯酚的危害出发，对含酚废水的无害化处理方法进行简单介绍。
针对生物治理方法中的活性污泥法，对苯酚降解菌处理含酚废水进行综述，分别介绍了苯酚降解菌的分离鉴定方法、种类及功能研究、相关酶基因、代谢途径这四个方面。
并对苯酚降解菌处理含苯酚废水进行了展望。
关键词：苯酚降解菌含酚废水无害化处理方法分离鉴定相关酶基因1 苯酚的结构及危害1.1苯酚的结构在苯酚分子中，酚羟基上的氧原子处于sp2杂化状态，氧上两对孤对电子，一对占据sp2杂化轨道，另一对占据未参与杂化的p轨道，p电子云正好能与苯的大π键电子云发生侧面重叠，形成p-π共轭体系，从而增加了苯环上的电子云密度，增强了羟基上氢的解离能力。
1.2苯酚的危害苯酚是有机合成的重要原料，是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药和医药合成等行业生产的原料或中间体，大量用于制造酚醛树脂以及其他高分子材料、药物、燃料和炸药等。
随着树脂、化工和高分子材料等企业对苯酚需求量的日益增加，各企业所排放的含苯酚废水量也日益增加。
由于苯酚是一种原型质毒物，具有很强的毒性，对生态环境和人体健康构成巨大威胁。
在许多国家，苯酚已被环保部门列入优先控制污染物的黑名单之中。
1.3对生态环境的危害苯酚排放到环境中不仅毒害水生生物，而且进一步与水中的氯作用产生一种毒性更强的有机污染物氯代酚，从而破坏水生生态系统。
水中含酚量>10mg/L,鱼类等水生生物不能生存；含酚量>100mg/L，若用于灌溉,将导致农作物减产和枯死。
1.4对人体健康的危害苯酚对人体任何组织都有显著腐蚀作用，可通过黏膜、皮肤的接触、吸入和误服而侵入人体内部。
接触眼后，能引起角膜严重损害，甚至失明；接触皮肤后，不引起疼痛，但在暴露部位最初呈现白色，如不迅速冲洗清除，能引起严重灼伤和全身性中毒；吸入后，可致头痛、头晕、乏力，视物模糊，肺水肿等，但较少见；误服后，引起消化道灼伤，出现烧灼痛，呼吸气带酚气味，呕吐物或大便可带血液，有胃肠穿孔的可能。
高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究引言石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。
未经净化的含酚废水可导致水源被污染，致使鱼类死亡，危害农作物，最终威胁人类的健康。
许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。
目前，国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。
其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物，处理方法无2次污染且安全、经济。
目前，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌（Pseudonomonas.sp）[3]、芽孢杆菌（Bacillus.sp）[4]、酵母菌（Yeast trichosporon）[5]、根瘤菌（Rhizobia）[6]、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）[7]等，降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。
本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选，得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株，进一步测定苯酚降解的影响因素。
对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。
1 实验材料和方法1.1 菌株来源采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口处污泥进行菌株筛选。
1.2 培养基基础培养基：NaCl 5.0g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15～20g/L，酵母浸膏5.0g/L，调节pH为7.0。
以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基：CaCl2 0.1 g/L ，FeSO4.7H2O 0.01 g/L，K2HPO4 0.5g/L，MnSO4.7H2O 0.05 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.H2O 0.01 g/L，NH4NO3 1.0 g/L苯酚按实验需要量添加，调节pH为7.0 [8]。
富集培养基：葡萄糖10.0g/L，营养琼脂33.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，调节pH为7.5。
1.3 研究内容与方法1.3.1 菌株和的驯化和分离在超净工作台中，将10mL含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿，取10 g污泥加90mL蒸馏水搅拌15min，静置5min后取上层清液为菌原液[8]。
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
从活性污泥中分离到1株苯酚高效降解细菌,初步确定为假单胞菌属(Pseudomonas);该菌株能在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中生长;可以在20～40 ℃、pH值5.0～9.0范围内较好生长;降解苯酚最适温度为35℃,最适pH值为7.0,最大降解率达到89%.完全降解无机盐培养基中500mg/L、1 000mg/L、1 200mg/L的苯酚分别需要60h、72h、108h.
作者：刘广金张袖丽作者单位：安徽农业大学应用化学系,安徽合肥,230036 刊名：现代农业科技英文刊名：XIANDAI NONGYE KEJI 年，卷(期)：2007 ""(11) 分类号：X7 关键词：苯酚生物降解假单胞菌属。
苯酚降解菌2,3-邻苯二酚双加氧酶基因克隆和序列分析一．摘要：环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污染，通常含酚废水中又以苯酚和甲酚的含量最高。
目前环境监测常以苯酚和甲酚等挥发性酚作为污染指标。
苯酚广泛存在于石油、化工、煤气、焦化、钢铁及酚类生产厂排放的废水中。
含酚废水的排放导致水源污染,毒死鱼虾,危害农作物,并严重威胁人类的健康,在我国水污染控制中已被列为重点解决的有害废水之一。
含酚有机物的毒性还在于其只能被少数微生物所分解。
在油田地层水中分离出苯酚降解菌BF80，并且从BF80中克隆出编码2，3-邻苯二酚双加氧酶(参与苯酚降解所必须的一种酶)的基因序列；采用基因克隆的策略是通过PCR进行片段克隆，并用UNIQ-10柱形DNA 回收试剂盒回收产物，采用NCBI BLAST序列分析表明该基因片段长1207bp,序列比较分析表明该基因片段与2-苯酚羟化酶A相似度达88%，氨基酸序列分析表明其与2,3-邻苯二酚双加氧酶相似度达96%。
本实验研究编码降解苯酚的2,3-邻苯二酚双加氧酶的基因克隆及序列分析，为构建高效降解苯酚的基因工程菌奠定了基础。
Phenol degrading bacteria 2 - phenol hydroxylase gene sequence analysisAbstract:Phenol pollution in the environment mainly refers to phenolic compounds on water pollution, waste water containing phenol is usually turned around the highest levels of phenol and cresol. Often present environmental monitoring such as phenol and cresol Phenol as pollution indicators. Phenol widespread in the petroleum, chemical, gas, coke, steel and phenolic wastewater plant emissions. Phenolic wastewater emissions of water pollution, poisoned fish, damage crops, and a serious threat to human health, water pollution control in China has been a key to solve one of the harmful waste. The toxicity of phenol organics still only a small number of micro-organisms, their decomposition.In oilfield water of phenol degrading bacteria isolated from BF80, and BF80 was cloned from the 2,3 - catechol dioxygenase (involved in phenol degradation of an enzyme necessary) of the gene sequence; using gene cloning strategy were cloned by PCR, with UNIQ-10 column DNA extraction kit recycling products, using NCBI BLAST sequence analysis showed that the gene fragment was 1207bp, Sequence analysis showed that the gene fragment and 2 - A similarity to phenol hydroxylase 88% amino acid sequence analysis showed that with 2,3 - catechol dioxygenase similarity of 96%. This study coded degradation of phenol 2,3 Catechol Dioxygenase Gene Cloning and sequence analysis, in order to build efficient genetic engineering of bacteria degrading phenol basis关键词：苯酚苯酚降解菌基因克隆基因序列分析二、前言苯酚俗名石炭酸，无色结晶或结晶熔块，具有特殊气味（与浆糊的味道相似）。
酚降解菌株的分离、鉴定和在含酚废水生物处理中的应用任河山,王颖,赵化冰,蔡宝立3(南开大学微生物学系生物活性材料教育部重点实验室,天津 300071)摘要:从石油化工厂的活性污泥和废水混合物中分离到10个降解酚的细菌菌株,经16S rRNA 基因序列分析,5个菌株(PD1、PD2、PD6、PD7和PD39)被鉴定为假单胞菌(P seudomonas sp.),4个菌株(PD4、PD5、PD8和PD9)为不动杆菌(Acinetobacter sp.),1个菌株(PD3)为丛毛单胞菌(Comamonas sp.).对假单胞菌(P seudomonas sp.)PD39菌株的酚降解特性、最适生长条件、降解底物的范围、儿茶酚1,22双加氧酶(C12O )和儿茶酚2,32双加氧酶(C23O )活性、含酚废水的生物处理等,进行了详细研究.结果表明,PD39菌株的最适生长和降解条件是,培养基的起始pH 为710,培养温度为30℃,酚浓度为800mg ΠL ,对酚的最大降解浓度为1200mg ΠL.酚浓度为637mg ΠL 的工业废水经72h 处理酚的去除率达到99196%.PD39菌株有很好的应用潜力来作含酚废水活性污泥处理系统的强化菌株.关键词:酚;生物降解;假单胞菌PD39;废水;生物处理中图分类号:X172;X703 文献标识码:A 文章编号:025023301(2008)022*******收稿日期:2007203228;修订日期:2007206212作者简介:任河山(1981～),男,硕士研究生,主要研究方向为生物降解与环境生物技术,E 2mail :heshanren2000@ 3通讯联系人,E 2mail :caibaoli @Isolation and Identification of Phenol 2degrading Strains and the Application in Biotreatment of Phenol 2Containing W aste w aterRE N He 2shan ,W ANG Y ing ,ZH AO Hua 2bing ,C AI Bao 2li(K ey Laboratory of Bioactive Materials ,M inistry of Education ,Department of M icrobiology ,Nankai University ,T ianjin 300071,China )Abstract :T en phenol 2degrading bacterial strains were is olated from mixture of activated sludge and wastewater of a petroleum chemical plant.The five is olates (PD1、PD2、PD6、PD7and PD39)were identified as P seudomonas sp.,the four (PD4、PD5、PD8and PD9)as Acinetobacter sp.,and the one (PD3)as Comamonas sp.by 16S rDNA sequence.Biodegradation characteristics of phenol ,optimal conditions for growth ,substrate range ,activities of catechol 1,22dioxygenase and catechol 2,32dioxygenase ,and biotreatment of phenol 2containing wastewater of P seudomonas sp.PD39were investigated in detail.The results indicated that the optimal conditions for growth and degradation of strain PD39are beginning pH of medium 710,growth tem perature 30℃,concentration of phenol 800mg ΠL.PD39was capable of metabolizing phenol at concentrations up to 1200mg ΠL and rem oving 637mg ΠL in industrial wastewater by 99196%in 72h.This strain possesses a g ood application potential as a bioaugmentation strain in the activated sludge system for treatment of phenol 2containing wastewater.K ey w ords :phenol ;biodegradation ;P seudomonas sp.PD39;wastewater ;biotreatment 苯酚(酚)是炼焦、炼油、制药、塑料、造纸和纺织等工业废水中一种常见的单环芳香烃污染物,已被我国列入环境优先污染物名单.用微生物降解法清除工业废水中的酚,不仅经济、安全,而且残留少,无二次污染,其应用前景被看好.目前,在含酚工业废水的生物处理中主要用活性污泥法,将经过酚驯化的活性污泥投放到生化处理池中,在好氧条件下污泥中的微生物对酚进行氧化分解.活性污泥法的优点是它含有多种微生物,除了能降解酚以外,还能去除其它有机物.其缺点是微生物对酚的耐受性和降解能力不是很高,所以酚浓度较大的废水需要稀释后才能进行处理,而且处理时间较长,成本较高.为了克服这些缺点,可以采用生物强化法,向活性污泥处理系统中投放高效酚降解菌,提高对酚的耐受浓度和酚的去除率,以及缩短处理时间[1,2].为此,分离高效酚降解菌株引起广泛重视.到目前为止,已经从10多个细菌属中分离到降酚菌株,如Acinetobacter [3],Alcaligens 、Arthrobacter 和K lebsiella [4],Azoarcus [5],Bacillus [6],Burkholderia [7],G eobacillus [8],Ochrobactrum [9],P seudomonas [10],Ralstonia [11],Rhodococcus [12],Trichosporon [13],Variovorax[14].最常见的酚降解菌是假单胞菌(P seudomonas )和不动杆菌(Acinetobacter ),它们对酚的最大降解浓度一般在1200mg ΠL 以下[8,10,12].本研究从石油化工厂的活性污泥和废水混合物中分离并鉴定了10个降解酚的细菌菌株,并对其中的假单胞菌(P seudomonas sp.)PD39菌株的降解特性和含酚废第29卷第2期2008年2月环 境 科 学E NVIRONME NT A L SCIE NCEV ol.29,N o.2Feb.,2008水的生物处理进行了详细分析.1 材料与方法111 培养基用于酚降解菌分离和培养的无机盐(M M)培养基(gΠL):K H2PO4019,Na2HPO4・12H2O615,MgS O4・7H2O012,(NH4)2S O4014,微量元素1m L[15],121℃高压灭菌15min,冷却至室温后加入酚至终浓度为500mgΠL1112 酚降解菌的分离用富集培养法分离酚降解菌株.将10g天津石油化工厂的活性污泥和废水混合物加入到50m L液体M M培养基中,30℃振荡培养2d,取10m L培养液接种新的50m L液体M M培养基,30℃振荡培养2 d,然后重复接种和培养3次,每次酚浓度提高100 mgΠL,最后1次达到800mgΠL.选择浊度最大的培养液稀释后涂酚平板,30℃培养2d,长出的单菌落在酚平板上划线纯化2次,得到纯培养菌株.113 菌株鉴定用PCR方法扩增分离菌株的16S rRNA基因,插入pUCm2T载体(上海生工公司),转化E.coli DH5α,送北京三博志远公司测序,所得序列与G enBank的16S rRNA基因序列进行blast比对,初步确定其属名.所用PCR引物:27F,5′2AG AG TTTG AT C MTGG CT C AG23′;1492R,5′2CGGY T ACCTTG TT ACG AC TT23′.PCR反应条件见文献[16].114 酚浓度测定酚在酸性或中性溶液中于270nm波长处有最大吸收峰而且比较稳定,并且在10～50mg・L-1浓度范围内有良好的线性关系,所以本研究采用紫外分光光度法在波长270nm处直接测定酚含量.先制备酚浓度为10～50mg・L-1的标准曲线,将菌液离心除去菌体,加水稀释,控制酚浓度在50mg・L-1以下,测定D270,通过标准曲线计算酚浓度[17].115 酚羟化酶大亚基基因的克隆和序列分析用下列PCR引物扩增PD39菌株酚羟化酶大亚基基因的中心区:Phe1,5′2AGG C AT C AAG AT C ACC G ACTG23′;Phe2,5′2CG CC AG AACC ATTT AT CG AT C2 3′[18].PCR反应条件:94℃预变性3min,94℃变性1 min,54℃退火40s,72℃延伸40s,30个循环,最后72℃延伸10min.PCR产物经纯化后插入pUCm2T载体,转化E.coli DH5α,送北京三博志远公司测序,所得序列与G enBank中的类似序列进行blast比对. 116 最适生长条件筛选以及生长和降解曲线绘制通过测定培养液的D600来确定生长条件的好坏,D600值越高,表明生长条件越好.在确定最适温度实验中,培养基的pH为710,酚浓度为800mgΠL;在确定最适pH实验中,培养温度为30℃,酚浓度为800mgΠL;在确定最适酚浓度实验中,培养基的pH 为710,培养温度为30℃;在试验盐浓度对酚降解的影响时,培养基pH为710,培养温度为30℃,酚浓度为800mgΠL.在最适生长条件下培养细菌,定时取样,测定D600和酚残留率,以时间(h)为横坐标,D600和酚残留率(%)为纵坐标,绘制生长和降解曲线1上述实验都使用250m L三角瓶,装80m L含酚液体培养基,菌株接种量为2%(体积分数),摇床转速为180rΠmin.117 降解底物筛选用其它单环芳香烃(苯甲酸、苯乙酸、对羟基苯甲酸等)代替酚作为细菌的唯一碳源,制备液体培养基,按2%(体积分数)接种量接种,振荡培养2d,观察菌株是否生长,测定D600,以时间(h)为横坐标, D600为纵坐标,绘制生长曲线.118 儿茶酚1,22双加氧酶(C12O)和儿茶酚2,32双加氧酶(C23O)活力测定测定方法见文献[3,7].1个酶活单位定义为每min产生1μm ol产物所需要的酶量.蛋白质测定方法见文献[19].119 含酚废水的生物处理将取自石家庄某制药厂的含酚废水分别加入10%、20%、30%、40%和50%的去离子水,然后加入1Π10体积的5倍浓度无酚M M培养基,调解pH到615～710,接种1Π10体积的PD39菌株过夜培养物, 30℃振荡培养72h,测定酚残留量.2 结果与讨论211 酚降解菌株的分离和鉴定用富集培养法,从天津石油化工厂的活性污泥和废水混合物中分离到40个酚降解菌株,对其中降解活力较高且稳定的10个菌株(PD1～PD9和PD39)进行了16S rRNA基因鉴定,并对降解性能最好的PD39菌株进行了最适生长条件、底物范围、耐盐程度、C12O和C23O活力、工业废水处理等进行了详细研究.16S rRNA基因鉴定结果表明,PD1、PD2、PD6、PD7和PD39的16S rRNA基因序列与G enBank中多个假单胞菌(P seudomonas)的16S rRNA 基因序列的同源性在99%以上,所以它们被鉴定为3842期任河山等:酚降解菌株的分离、鉴定和在含酚废水生物处理中的应用P seudomonas sp..图1是这5个菌株及相关菌株的基于16S rRNA 基因的系统进化树.PD4、PD5、PD8和PD9的16S rRNA 基因序列与G enBank 中多个不动杆菌(Acinetobacter )的16S rRNA 基因序列的同源性在97%以上,所以它们被鉴定为Acinetobacter sp..PD3的16S rRNA 基因序列与G enBank 中的丛毛单胞菌(Comamonas )W AB1945的16S rRNA 基因序列有9918%的同源性,所以它被鉴定为Comamonassp..在丛毛单胞菌属中发现酚降解菌,本研究为首次报道.上述10个菌株(PD1～PD9和PD39)的16S rRNA 基因序列G enBank 注册号分别是EF392658、EF412968、EF373535、EF412969、EF412970、EF412974、EF412971、EF412972、EF412973和DQ836052.PD39的酚降解能力最强,最大降解浓度为1200mg ΠL.降解能力最差的是PD3,最大降解浓度为800mg ΠL.其它8个菌株在酚浓度为1000mg ΠL 时,能正常生长和降解.图1 PD39和其它相关菌株基于16S rDNA 序列的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence ofPD39and its related strains212 酚羟化酶大亚基基因的中心区序列酚降解途径的第1步反应是在酚羟化酶的催化下,将酚氧化成儿茶酚,然后通过间位或邻位开环进一步降解.大多数酚降解菌的酚羟化酶由6个亚基组成,在P seudomonas sp.CF600菌株中,该酶的编码基因是dmp K LMNOP ,其中dmp N 编码由517个氨基酸残基组成的酚羟化酶大亚基[20].研究表明,从环境中分离的各种酚降解菌的酚羟化酶大亚基具有很高的保守性[18].用Phe1和Phe2引物扩增的PD39菌株的酚羟化酶大亚基基因中心区的大小为684bp ,G enBank 注册号为DQ852625.与G enBank 中相同基因的序列比对表明,PD39的酚羟化酶大亚基基因中心区的核苷酸序列与其它假单胞菌相比,同源性都在80%以上,其中与P seudomonas sp.CF600菌株的同源性最高,为9917%.但是,与非假单胞菌来源的酚羟化酶大亚基基因相比,其中心区序列的同源性较低,例如,与Acinetobacter sp.PD12菌株的酚羟化酶大亚基基因(G enBank 注册号:AY 673995)相比,同源性只有73%(表1).表1 假单胞菌PD39和其它菌株酚羟化酶大亚基基因的同源性T able 1 H om ology of phenol hydroxylase alpha subunit ofP seudomonas sp.PD39and its related strainsG enBank 注册号微生物来源同源性M60276P .putida CF60099%AY 686639P .putida K L3399%X80765P .putida H 98%AY 875729P .mendocina PC998%AY 875738Acinetobacter sp.PC1998%AY 504972P .aeruginosa J I10498%AY 875746P .fluorescens PC3694%AB016858P .putida P 2685%AB051726P seudomonas B 23685%DQ387868P .fluorescens P6981%AY 504973P .putida A1w4′81%AY 205602P .stutzeri OX181%AB051710Variovorax sp.HAB 22281%AY 504974P .veronii A1Y B22480%AB051713Variovorax sp.HAB 22779%AB031996Ralstonia sp.K N177%AY 673995Acinetobacter sp.PD1273%213 PD39菌株最适生长条件筛选因为PD39菌株是以酚为唯一碳源生长,所以生长越好,表明苯酚降解也越好.温度对PD39菌株生长的影响见图2.从图2可见,30℃培养的细菌生长最好,23℃和37℃次之,在40℃下细菌根本不能生长.pH 对PD39菌株生长的影响见图3.从图3可见,培养基的起始pH 为415和810时,细菌基本不能生长,pH 为510时生长也很差,pH 为710时生长最好.酚浓度对PD39菌株生长的影响见图4.从图4可见,当酚浓度为1400mg ΠL 时,细菌根本不能生长.酚浓度为1000和1200mg ΠL 时,细菌能够生长,但延迟期较长.当酚浓度为200、400和600mg ΠL 时,细胞浓度较低.酚浓度为800mg ΠL 时细菌生长快而且细胞浓度最高.从上述实验可知,PD39菌株的最适生长和苯酚降解条件是,培养基的起始pH 为710,培养温度为30℃,酚浓度为800mg ΠL.PD39菌株在这一最适条件下的生长和降解曲线见图5.从图5可484环 境 科 学29卷见,细菌的快速生长和酚降解发生在10～14h 之间,15h 后酚降解率达到95%以上.本研究分离和鉴定的P seudomonas sp.PD39能在1200mg ΠL 苯酚中正常生长,65h 的D 600达到111,说明其对酚的耐受性和降解性都相当好,有很好的应用潜力.图2 温度对PD39菌株生长的影响Fig.2 E ffect of tem perature on growth ofPD39图3 pH 对PD39菌株生长的影响Fig.3 E ffect of pH on growth of PD39214 PD39菌株的耐盐性试验因为含酚工业废水中经常含有较高的盐分,给废水的生物处理增加难度,所以本研究对PD39的耐盐性进行了试验.结果表明,随着培养基中盐浓度的增加,细菌生长的延迟期也不断加长,最大耐盐浓度是115%,当盐浓度为2%时,细菌不能生长(图6).215 PD39菌株的降解底物试验结果表明,PD39除了能降酚以外,还能降解苯甲酸、苯乙酸和对羟基苯甲酸(图7),但不能降解间羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对苯二甲酸、邻苯图4 酚浓度对PD39菌株生长的影响Fig.4 E ffect of phenol concentration on growth ofPD39图5 PD39菌株的生长和降解曲线Fig.5 Phenol 2degrading and growth curves ofPD39图6 PD39菌株对盐的耐受性Fig.6 Salt tolerance of PD39二甲酸、间苯二甲酸、邻甲酚、对硝基酚和邻硝基酚.与Acinetobacter sp.PD12菌株[3]相比,其降解底物的范围较窄.PD12可以降解苯甲酸、苯乙酸、对羟基苯5842期任河山等:酚降解菌株的分离、鉴定和在含酚废水生物处理中的应用甲酸、间羟基苯甲酸、对苯二甲酸、邻苯二甲酸和间苯二甲酸.图7 PD39菌株对苯甲酸、苯乙酸和对羟基苯甲酸的生物降解Fig.7 Biodegradation of benz oic acid ,phenylacetic acid andp 2hydroxybenz oic acid by PD39216 PD39菌株的C12O 和C23O 活力细菌的酚好氧代谢有2种途径,一种是酚被酚羟化酶氧化成儿茶酚以后经邻位开环生成生成顺,顺2粘康酸,该反应由儿茶酚1,22双加氧酶(C12O )催化,称为邻位裂解途径;另一种是酚被酚羟化酶氧化成儿茶酚以后经间位开环生成22羟基粘康酸半醛,该反应由儿茶酚2,32双加氧酶(C23O )催化,称为间位裂解途径.通过测定这2种酶的活性,可以判断细菌采用何个途径降解酚.例如,Acinetobacter sp.PD12的细胞裂解液显示C12O 活力,所以该菌株是利用邻位途径降解酚[3].P seudomonas aeruginosa AT 2菌株的细胞裂解液显示C23O 活力,所以它是利用间位途径降解酚[7].假单胞菌PD39菌株的细胞裂解液显示较高的C23O 活力(0117U ・mg -1),没有检测到C12O 活力,这表明该菌株利用间位途径降解酚.217 用PD39菌株处理含酚废水由于高浓度酚对微生物具有毒性因而抑制其生长,所以在用活性污泥法处理含酚废水时需要对废水进行稀释,一般稀释到酚浓度为200～300mg ΠL[21].直接用假单胞菌PD39菌株处理酚浓度为910mg ΠL 的制药厂废水时,由于酚浓度较高,抑制细菌的生长,另外废水中的其它有害成分也可能使细菌不能正常降解酚.试验表明,用10%和20%的水稀释上述废水,细菌仍不能生长.用30%以上的水稀释废水以后,酚的去除效果较好.用30%水稀释的含酚废水中酚浓度为637mg ΠL ,加入1Π10体积的5倍浓度M M 培养基,接种1Π10体积的PD39菌株过夜培养物,30℃振荡培养72h ,苯酚残留量为0125mg ΠL ,去除率为99196%.所以,从对酚的耐受力和降解性两方面来看,PD39有很好的潜力用做活性污泥法处理含酚废水的强化菌株.3 结论(1)从石油化工厂活性污泥和废水混合物中分离到10个能以酚为唯一碳源生长的细菌菌株,经16S rRNA 基因序列分析,5个菌株被鉴定为假单胞菌,4个菌株为不动杆菌,1个菌株为丛毛单胞菌.降解酚的丛毛单胞菌,本研究为首次报道.(2)条件试验表明,假单胞菌PD39菌株的最适生长和酚降解条件是,培养基的起始pH 为710,培养温度为30℃,酚浓度为800mg ΠL.该菌株的最大酚降解浓度是1200mg ΠL.(3)废水处理试验表明,酚浓度为910mg ΠL 的制药厂废水用30%水稀释后,经假单胞菌PD39菌株处理72h ,可使酚的去除率达到99196%,所以,该菌株有很好的潜力用做活性污泥法处理含酚废水的强化菌株.参考文献:[1]朱永光,冯栩,廖银章,等.活性污泥系统处理苯酚废水的生物强化效果[J ].应用与环境生物学报,2006,12(4):5592561.[2]Annaduraia G,Juangb R S ,Lee D J.M icrobiological degradation of phenol using m ixed liquors of P seudomonas putida and activated sludge[J ].W aste M anage ,2002,22(7):7032710.[3]W ang Y,T ian Y,Han B ,et al .Biodegradation of phenol by free and imm obilized Acinetobacter sp.strain PD12[J ].J Environ Sci 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一株苯酚降解菌的分离与鉴定
一株苯酚降解菌的分离与鉴定
目的:筛选能高效降解苯酚的`微生物,并进行初步鉴定.方法:从某焦化厂排水沟采集污泥,通过逐步驯化筛选苯酚降解菌株;利用形态观察、生理生化检测、16S rDNA序列分析进行初步鉴定.结果:筛选获得1株苯酚降解菌JDM-2-1,该菌能够以苯酚为惟一碳源,耐酚能力高达2 200 mg/L,在30℃和pH7.0条件下,42 h内能将800 mg/L的苯酚彻底降解;初步鉴定其为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus).结论:菌株JDM-2-1是一株高效降解苯酚的球形芽孢杆菌.
作者：王永义彭清忠彭清静陈义光何倩杨冬梅 WANG Yong-yi PENG Qing-zhong PENG Qing-jing CHEN Yi-guang HE Qian YANG Dong-mei 作者单位：吉首大学,生物资源与环境科学学院,湖南,吉首,416000 刊名：生物技术通讯 ISTIC 英文刊名： LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 2007 18(6) 分类号： Q93-331 关键词：苯酚降解 16SrDNA 球形芽孢杆菌。
实验一苯酚降解菌的分离及降解性测定实验原理：在污染环境中，大部分微生物由于受到毒害而死亡，少数微生物具有较强的降解能力或通过诱变改变其基因型或诱导产生某些酶而能在污染的环境中存活，成为有机污染物的高效降解菌或耐性菌株。
从污染环境中取样，通过在选择性培养基上培养，可筛选出目的性微生物。
本实验取青年湖水样作为菌种的来源，在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基进行培养，分离苯酚降解菌。
实验步骤：1. 从污染地区取样品（污水，污泥或受污染的土壤）。
2. 配制无碳源的无机盐培养基，加入苯酚储备液，使培养基中苯酚浓度达100 mg/L。
121℃灭菌20 min。
3. 吸取1 ml活性污泥，加入灭菌培养基，同时做空白对照，28℃恒温摇床培养24 h（160rmp/min）.4. 测定苯酚降解率。
苯酚降解率的测定方法：a.标准曲线的绘制分别吸取0、1、2、3、4、5mL 酚标准溶液（100 mg/L）于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释成20 mL。
加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL4％4－氨基安替比林溶液，摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min后，加蒸馏水稀释至刻度。
用722型分光光度计460nm波长处比色测定。
b.以不加酚的试剂作空白对照，以浓度为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。
c.培养液中苯酚降解率的测定吸取培养液2mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释成20 mL。
加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL 4％4－氨基安替比林溶液，摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min后，加蒸馏水稀释至刻度。
用722型分光光度计460 nm波长处比色测定。
d.根据标准曲线求出苯酚含量以分解苯酚的百分数表示酚分解作用强弱。
附：无机盐含酚培养基KH2PO40.5gK2HPO40.5gMgSO4•7H2O 0.2gCaCl2 0.1gNaCl 0.2gNH4NO3 1.0gFeCl210%溶液1滴苯酚100mg/L水1000mL调pH 值7.5，121℃灭菌20min。
