液相色谱在中药分析中的应用

1 / 71 / 7 液相色谱在中药分析中的应用

摘要

液相色谱法的发展非常迅猛，许许多多的新方法不断涌现，它具有分离效率高，选择性好，分析速度快，操作自动化和应用范围广的特点。本文主要简单介绍液相色谱的知识及其在药物分析中的广泛应用，通过实例描述了液相色谱法的优点。

液相色谱(HPLC)是结合经典液相色谱及气相色谱的分离原理。由于与气相色谱法相比，液相色谱法具有下列主要优点：①不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广②可选用不同性质的各种溶剂作为流动相，而且流动相对分离的选择性有很大作用，因此分离选择性高；③一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。因而广泛应用于生物化学，生物医学，石油化工，合成化学，环境监测，食品卫生，以及商检，法检和质检等许多分析检验部门。液相色谱不仅仅是一种有力的分析工具，而且越益成为分离制备和纯化的手段。

液相色谱在国内和国外已被广泛地应用于药物分析，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。中国药典1985年版才规定使用，该版只有8个品种规定使用HPLC方法检测，到了1995版达到113个品种，2000版药典的应用达到了282种，2005版仅药典一部的应用达到了479种，涉及518项；药典二部中采用液相色谱法的品种有848种，较2000年版增加了566次，其中复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用液相色谱法。2010年药典则更多的用液相色谱法取代了某些药物含量测定的薄层法，并引入了各式各样的检测器。由此可见，我国液相色谱法在药物分析中的重要性。

关键词 ：液相色谱；气相色谱；药物分析

1液相色谱的简介

液相色谱简称HPLC，又称高速或高压液相色谱。该法吸收了普通液相层析和气相色谱的优点，经过适当改进发展起来的，既有普通液相层析的功能，又有气相色谱的特点（即高压，高速，高分辨和高灵敏度）。HPLC是近年来迅速发2 / 72 / 7 展起来的一项新颖的分离技术，不仅适用于很多不易挥发，难热分解物质（如蛋白质，肽类，氨基酸及其衍生物等）的定性定量分析，而且也适用于上述物质的制备和分离。HPLC法由于兼备液相和气相两种色谱分析方法的优点，近年来在食品检测和分析上应用并飞速发展。

1.1HPLC与气相柱色谱法(GC)相比较，主要有以下几点优势：

(1) GC的分析对象仅限于蒸汽压低、沸点低的样品(仅占有机物总数的20%)，不适于分析高沸点有机物、高分子化合物、热稳定性差的有机物及生物活性物质。而HPLC不受此限制，能对80%的有机物进行分离与分析。

(2)GC流动相为惰性气体，不能与待测组分发生作用。HPLC流动相选择余地大，可与待测组分发生作用，而且通过改变流动相的组成，可改善分离的选择性(相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数)。

(3)GC通常在高温下进行，HPLC可以室温下进行分离与分析。 (4)非破坏性检测器在HPLC中的使用，可使样品回收(特别是少量珍贵样品)或样品的纯化制备成为可能。 1.2HPLC的特点

(1)分离效能高。由于微粒固定相的使用，使理论塔板数可达到103～104块/m，远远高于GC的103左右(填充柱)。

(2)选择性高。因为流动相可与样品组分发生相互作用，所以，通过改变流动相的组成，可以达到控制和改善分离过程选择性的目的。因此，HPLC不仅可以分析不同类型的有机物及其同分异构体，而且已在合成药物和生化药物的生产与控制分析中发挥了重要作用。

(3)检测灵敏度高。HPLC中应用的检测器大多数都有较高的灵敏度。高压输

液泵的使用，使HPLC分析一个样品仅需几分钟至几十分钟。［2］

1.3HPLC的局限性

(1)在HPLC中，所用流动相不止一种(多种)，因此其分析成本高，且易起环境污染；当进行“梯度洗脱”操作时(相当于GC中的程序升温技术)，比GC的程度升温操作要复杂的多；

(2)HPLC目前还缺少像GC中的通用型检测器(如TCD、FID);

(3)HPLC不能替代GC。当要求柱效高达10万块理论塔板数以上时，只能用GC中的毛细管色谱柱； 3 / 73 / 7 (4)在200kPa～1Mpa柱压下易分解、变性的生物活性的生化样品，不易用HPLC分析。

1.4液相色谱仪

HPLC仪器的工作过程为：高压泵将贮液器(或槽、罐)中的流动相溶剂经进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出(通常要回收)。当注入待测样品时，流经进样器的流动相将样品各组分带入色谱柱中进行分离，分离后的各组分依一定的顺序进入检测器，检测器产生的信号由记录仪记录下来，最后形成液相色谱图。

1.4.1高压输液泵

这是HPLC仪器中的着急部件之一。它一般由贮液器、高压输液泵、过滤器等组成。高压输液泵应该具备密封性好、输出流量恒定、压力平稳、可调范围宽、便于更换溶剂及耐腐蚀等条件。常用的输液泵有恒流泵和恒压泵两种，而恒流泵用的较多(因为它的输出流量能始终保持恒定，与色谱柱引起的阻力大小无关)，而恒压泵用的较少。恒流泵又分为机械注射泵和机械往复泵，后者用的最多。

1.4.2进样系统

由于HPLC色谱柱比GC色谱柱短的多(约5～30cm)，所以，引起色谱峰峰形变宽的因素以柱外因素为主(即：进样系统、连接管道及检测器中存在的死体积)。而柱外展宽(色谱柱外因素引起的峰形变宽)又分柱前和柱后展宽，以进样系统所引起的柱前展宽为主要因素

1.4.3分离系统

色谱柱是其核心部件之一。通常用φ4～5mm，5～30cm长度的不锈钢管作高压色谱柱，内装5～10μm的全多孔型微粒固定相。

1.4.4检测系统

用于HPLC仪的检测器有两类，一类是溶质型检测器，它仅对被测组分的物理或化学特性有响应，属于此类的有：紫外、荧光及电化学检测器等。另一类是总体检测器，它是对试样及洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于此类的有：

示差折光、电导等检测器。在实际工作中, 应根据具体情况来选择适宜的检测器。而在HPLC仪器的常规分析中，紫外检测器用的最多。 除了这四大部分之外，还有一些附属的(有的甚至是不可缺少的)部件，如：脱气、梯度淋洗、自动进样、4 / 74 / 7 恒温、馏分收集及数据处理等装置。 2. 液相色谱在药物分析中的应用

液相色谱在药物分析中的应用范围越来越广，液相色谱由于具有高选择性、高灵敏度，并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点，已成为医药研究的有力工具。如在中草药有效成分的分离和纯度测定、人工合成药物成分的定性和定量测定、新型手性药物中手性对映体含量的测定以及药物代谢物的测定等方面都需要用到HPLC的不同测定方法予以解决。而目前液相色谱的蒸发光散射检测器的应用更体现了它在药物分析中的重要地位。 2.1 天然药物分析

天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行分离鉴定，再测定有效成分的含量；通过指纹图谱建立识别模式，可以判定药材的质量高低。

2.2 天然药物及复方成药分析

复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用液相色谱法。增免扶正片系由当归、党参、黄芪等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心、肝、脾、肾虚、纳差、心脑血管疾病、神经衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。 由于化学药品的开发费用昂贵，而且毒副作用大，近年来人们已把目光转向自然、民族传统医药、草药、植物药等天然药物，据世界卫生组织统计，当前全世界60多亿人口中80％的人使用过天然医药。在全世界药品市场中，天然物质制成的药品已占30％，国际上植物药市场份额已达300亿美元，且每年以20％ 以上的速度增长。HPLC分析必定能为我国传统中医药实现现代化，走向世界提供强有力的技术支持。 2.3 抗生素分析

抗生素是由微生物或其他方法产生的化学物质，在高度稀释的情况下仍具有抑制或杀灭其他微生物的性能。抗生素的分离、分析和定量测定是药物分析中较困难的领域。采用较多的方法是微生物法、分光光度法和化学方法，但所需时间较长、专一性较差。

HPLC分析技术近年来在抗生素的质量控制中已广泛应用。对结构、组分等5 / 75 / 7 较清楚的药物，HPLC分析将逐步取代传统的生物测定。目前，各国药典中应用HPLC技术对抗生素进行质量控制的项目包括鉴别、组分分析、含量测定和相关物质测定等。

2.4 手性药物分析

在生物体内，几乎所有具有重要生理意义的有机生物分子都有手性(chirality)，绝大多数都是旋光性物质。两种化学组成、分子式完全相同的化合物，但因组成化合物的原子在空间取向不同，而成为镜像的化合物，称为手性化合物。由于对映体的物理、化学性质相同，实现它们的分离就比较困难，如大多数氨基酸都有右旋体和左旋体，但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物。手性药物往往呈现一种对映体具有强的生物活性和药效，而另一种却无效。近年来，对手性药物的拆分定量分析进行了广泛深入的研究。其中，对生物体液中药物对映体的分离分析，有利于了解各种对映体的药代动力学、体内代谢过程和生物利用度。因此对手性药物对映体的拆分也是HPLC分析的热点。手性HPLC拆分法是以现代HPLC技术为基础引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异而进行分离。HPLC法拆分手性药物对映体可分为直接法和间接法。前者是将不对称中心引入分子间，可分为手性流动相添加剂(CMP)法和手性固定相(CSP)法；后者又称为手性试剂衍生化(CDR)法，它是将不对称中心引入分子内。

手性试剂衍生化法是将对映体经手性试剂衍生，生成非对映异构体后，利用常规HPLC方法进行分离和测定。适用于不宜直接拆分测定的化合物如手性脂肪胺类、醇类等。该法分离效果好，分离条件简便，但对手性衍生试剂的要求较高，操作比较麻烦，多在其它方法无法实现时才采用。对生物样品中对映体拆分过程中，由于内源性物质及代谢产物的干扰，单用HPLC分析，易造成谱峰重叠，不能直接分析体内手性药物。目前，使用多柱偶联技术已成功解决了该类问题。 目前，HPLC是在手性药物拆分中应用最多的方法之一，可以预见，该方法因其具有快速、方便、精确的特点，在未来的手性药物研究中，将得到更广泛的应用。

2.5 在药物鉴别中的应用

在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,6 / 76 / 7 头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别. 2.6 在杂质检查中的应用

HPLC分离效能高,灵敏,在药物的杂质检查中应用广泛.主要用于药物中有关物质的检查.“有关物质”是指药物中存在的合成原料,中间体,副产物,降解产物等物质,这些物质的结构和性质与药物相似,含量很低,只有采用色谱的方法才能将其分离并检测.若杂质是已知的,又有杂质的对照品,可用杂质对照品做对照进行检查.若杂质是未知的,可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查.

2.7 在含量测定中的应用

用液相色谱法侧定含量可以消除药物中的杂质,制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰.中药材及其制剂组成复杂,基中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了液相色谱法. 2.8 在体内药物分析中的应用