4.人工染色体载体

第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量（kb） 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。

cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。

o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。

o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。

4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1．黏粒pJB8o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。

2．含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。

o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。

基因工程名词解释1、基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞中表达，产生人类所需的产物或新生物类型。

2、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后再转入另一个生物体（受体）内，按照人们的意愿稳定遗传并表达新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。

3、基因xx：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。

通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。

（包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。

从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

）4、限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。

5、修饰酶：体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalentmodificationregulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。

6、同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。

（同序同切酶、同序异切酶、“同功多位”等）7、同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。

8、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同切割效率。

9、星星活性：极端非标准反应条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。

10、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。

11、DNA聚合酶：以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。

DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。

人工染色体克隆载体：是一种“穿梭”载体，含有质立载体所必备的第一受体内原质立复制起始位点，还含有第二受体染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列，以及合速的选择标记基因。

固体发酵：某些微生物升长需水很上少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产。

蛋白质工程：基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰改造拼接以生产能满足人类需要的新型蛋白质技术。

DNA疫苗：是利用可隆于载体上的抗原基因直接注射机体，被细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。

人工种子：它是一种含有植物胚状体或芽营养成分激素以及其他成分的人工胶囊。

发酵工程：利用微生物生长速度快生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，再合适条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某中特定功能生产出人类所需的产品。

生物传感器：是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具。

载体：把能够承载外源基因，并将其带人受体细胞得以稳定维持的DNA分子。

胚胎移植：是由产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。

基因治疗：是利用遗传学的原理治疗人类的疾病。

细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并染色体等遗传物质重组的过程。

花药培养：经过适当的诱导，花粉囊中的花粉可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终生产花粉植株。

原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。

固定化酶：指经物理或化学的方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受限制,而又能发挥催化作用的酶制剂.基因克隆；是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。

⊙生物技术有基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程基因工程包括目的基因分离与可隆载体重组转人受体细胞筛选和鉴定可隆子。

人工染色体载体名词解释
人工染色体载体是一种带有特定功能的DNA分子，用于在实验室中携带和传递外源基因或其他遗传物质。

它是通过基因工程技术构建的，通常由一段核酸序列组成，包括宿主微生物所需的基本元素，如起始子、启动子、终止子以及复制和稳定性元件。

人工染色体载体可以在细胞中自主复制和传递，并能够稳定地继承和表达携带的外源基因。

不同类型的人工染色体载体具有不同的设计目的和特点，可以用于基因治疗、基因组编辑、产生转基因动物、研究基因组功能等领域。

名词解释：1.Gene Engineering基因工程：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。

2.HGP人类基因组计划：是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。

其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。

3.Gene Therapy 基因治疗：是指将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因，补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。

.基因诊断：是利用重组DNA 技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷。

Vector载体：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。

plasmid质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

shuttle vector穿梭载体：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。

质粒不相容性;同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性.multiple cloning sites，MCS多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。

能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

α-互补：LacZ’基因的互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。

粘性末端：指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。

并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。

基因⼯程知识结构（⽣⼯）《基因⼯程》课程知识结构第⼀章基因⼯程概述⼀、基因⼯程的内容与应⽤（⼀）基本概念通过基因操作，将⽬的基因或DNA⽚段与合适的载体连接转⼊⽬标⽣物细胞，通过复制、转录、翻译外源基因以及蛋⽩质的活性表达，使转基因⽣物获得新的遗传性状的操作。

（⼆）Technical process of genetic engineering1．Cloning of target gene2．Preparation of vectors3．Joining the target gene to vectors to produce recombinant DNA4．Introduction the recombinant DNA into host cells5．Identification and selection of the recombinant6．Propagation of the recombinant DNA in a host cell（三）Basic conditions1．Four elements: Target gene, Vectors, Enzymes, Host cells2．Three major components: Donors, Receptors, Vectors3．Three tools:Restriction endonuclease----Molecular scissorsDNA ligase------Molecular glueVectors-----Molecular Transporter（四）基因策略（五）研究⽬的和应⽤领域1．PurposeThere are many areas in which genetic manipulation is of value, including the following:(1)Production of useful protein by novel methods: 1982年，第⼀个基因⼯程菌⽣产药物----重组⼈胰岛素，在美国和英国获准使⽤，标志着医药领域进⼊⼀个新纪元。

动物转基因技术的种类
动物转基因技术有多种，包括但不限于以下几种：
1.显微注射法：这是最早的动物转基因技术，通过将外源基因直接
注射到受精卵细胞的原核内，然后将受精卵移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。

这种方法的缺点是效率低、位置效应造成的表达结果的不确定性、动物利用率低等。

2.精子介导的基因转移：这种方法是将精子作适当处理后，使其具
有携带外源基因的能力，然后给发情母畜授精。

在母畜所生的后代中，有一定比例的动物是整合外源基因的转基因动物。

3.逆转录病毒载体法：通过逆转录病毒作为载体，将外源基因插入
到宿主细胞的染色体DNA中，从而获得稳定转基因的表达。

4.胚胎干细胞介导法：通过将外源基因导入胚胎干细胞，然后将这
些干细胞注入到受体动物的胚胎中，从而获得转基因动物。

5.体细胞核移植法：首先在体外培养的体细胞中举行基因导入，筛
选获得带转基因的细胞，然后将带转基因的细胞移植到受体动物的卵母细胞内，再构建成重建胚，最后将重建胚移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。

6.人工染色体介导的基因转移法：利用人工染色体作为载体，将外
源基因插入到人工染色体中，然后将人工染色体导入到动物细胞中，从而获得转基因动物。