酵母人工染色体载体

人造染色体载体是什么？对一些大型染色体组的序列分析往往需要克隆具有数十万甚至上百万个碱基对的DNA片段，为了满足克隆大片段外源基因的需要，科研工作者构建了人造染色体载体，如酵母人工染色体克隆载体、细菌人工染色体克隆载体等。

酵母人工染色载体(YAC)是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。

酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90min。

YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒(TEL)。

YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因。

细菌人工染色体载体(BAC)是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。

每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子(致育因子)的严谨型控制的复制子oriS，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶。

BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。

新型的BAC载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆DNA的Not工酶切位点和用于克隆DNA测序的Sp6启动子、T7启动子。

Not Ⅰ识别序列，位点十分稀少。

重组子通过Not Ⅰ消化后，可以得到完整的插入片段。

Sp6、T7是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。

P1人工染色体载体(PAC)结合了P1载体和BAC载体的最佳特性，包括阳性选择标记sacB及噬菌体P1的质粒复制子和裂解性复制子。

然而除了将连接产物包装进λ噬菌体颗粒以及在cre—loxP位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组PAC也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持。

基于PAC的人类基因组文库插入片段的大小在60～150kb之间。

第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量（kb） 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。

cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。

o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。

o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。

4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1．黏粒pJB8o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。

2．含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。

o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。

三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。

2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。

不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。

3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。

不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。

4.质粒的转移性：质粒具转移性。

它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。

它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。

5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。

这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。

它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。

6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。

α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。

8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。

9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。

yac构建基因文库的原理基因文库是DNA片段的集合，其中每个片段都包含来自基因组的某个部分。

这些片段可以来自不同的染色体区域，并且可能包含整个基因或其部分。

YAC（酵母人工染色体）是一种用于构建基因文库的载体，它允许研究人员在酵母细胞中克隆和表达大片段的基因组DNA。

下面将详细介绍YAC构建基因文库的原理，主要包含以下几个方面：1. 构建构建YAC载体的第一步是制备适合克隆大片段DNA的载体。

通常，YAC载体包含一个选择标记（如抗性基因），允许在含有特定抗生素的培养基上筛选和识别含有YAC的克隆。

此外，YAC载体还应包含一个多克隆位点，用于插入感兴趣的基因组DNA片段。

2. 转化一旦制备了YAC载体，就可以将其转化到酵母细胞中。

转化过程通常涉及将酵母细胞与YAC载体共孵育，以使载体与酵母细胞的DNA结合。

然后，通过加入选择标记来筛选和识别成功转化的细胞。

3. 克隆化在成功转化后，研究人员需要筛选和识别含有重组YAC载体的细胞克隆。

通常，这可以通过多轮筛选和鉴定来完成。

首先，研究人员可以使用特定抗生素来筛选含有选择标记的细胞。

然后，他们可以使用 Southern 印迹分析或 PCR 等技术来鉴定含有重组YAC载体的克隆。

4. 筛选筛选是YAC构建基因文库的关键步骤之一。

通过筛选，研究人员可以识别包含所需基因组区域的有效克隆。

这通常涉及对重组YAC进行分子遗传分析，以确定其包含的基因组区域。

通过比较筛选结果和基因组图谱，研究人员可以选择正确的克隆用于进一步研究。

5. 鉴定一旦筛选出正确的克隆，研究人员需要对其进行进一步鉴定。

这可以通过一系列技术来完成，包括 Southern 印迹分析、PCR、测序和功能分析等。

通过这些技术，研究人员可以确定重组YAC中的基因组区域是否包含所需的目标基因或DNA片段。

此外，他们还可以验证克隆的可靠性和稳定性，以确保其可以用于进一步实验和研究。

总之，YAC构建基因文库是一个复杂的过程，涉及多个步骤和关键环节。

酵母人工染色体名词解释酵母人工染色体是不同于野生型酿酒酵母的一种自组装的染色体，它包含了多个拟合于自身的人工功能模块。

该技术是一种基因工程的手段，它可以在细胞中稳定地表达外源基因，因此被广泛用于大量生产特定蛋白质等的生物工艺。

酵母人工染色体不仅可以用于蛋白生产，还可以用于碾磨药品的筛选、生物传感器等。

酵母人工染色体的名称中包括许多专业术语，下面我们来具体解释一下它的相关名词。

1. YAC(酵母人工染色体)YAC全称酵母人工染色体，是通过重组技术在自然含有酿酒酵母基因的端粒进行构建的。

在YAC中，长段DNA 可以被合成，然后以任意组合方式安置在酵母人工染色体上，这使得YAC成为了一个在酿酒酵母中稳定存在的人工染色体。

2. BAC（大肠杆菌人工染色体）BAC全称大肠杆菌人工染色体，一类完整的人工DNA 载体，可用于将大约300kb的DNA片段插入到大肠杆菌中。

其主要应用是研究基因的调控及表达模式，并用于生物工艺学、纯化重组蛋白以及创建高密度点图(系)等领域。

3. P1人工染色体P1人工染色体是另一种人工染色体，通常被设计成具有特定检测基因或特定功能的细胞向其直接植入特定基因。

它们也可以被用作高效的向线性染色体上整合基因的系统，作为染色体极配合体体内重组验系统，可用于测定基因，以及其他展示DNA片段的多米戈螺旋(曲线)系统。

4. 人工染色体人工染色体是指由人工合成的DNA序列组成的染色体，其中包括人工元件、核心染色体区域以及端粒等，满足构建染色体的基本要求。

目前，人工染色体经常用于从植物或动物细胞中扩增大长的DNA组件，再将其转移到另一个预先准备好的动植物中，从而扩展细胞学研究和治疗学应用领域的范围。

总的来说，酵母人工染色体是一种理解基因在不同层次上作用的途径。

它为我们提供了一个构建高度复杂的基因组的框架，对于我们理解基因的调控、维持、功能和遗传机理有着重要的意义，在医学、农业生产、食品工业等方面都具有重要的应用潜力。

细胞工程酵母人工染色体一、酵母人工染色体（YAC）的基本元件酵母染色体DNA自主复制序列（ARS）酵母染色体的着丝粒序列（CEN）酵母染色体的端粒序列（TEL）选择标记：用于重组克隆的筛选如：pYAC4是一个大肠杆菌穿梭质粒，含有Amp大肠杆菌筛选标记。

二、YAC克隆系统的特点YAC作为可提供大片段DNA的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程（200～500kb，甚至1000kb）。

用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的YAC 变成一个大的YAC。

酵母作为一种真核生物，为其它真核的DNA提供了更合适的环境。

三、YAC的构建酵母人工染色体的构建程序完整的染色体DNA的提取基因组DNA酶切大片段的获取✓用于脉冲电泳（PFGE）的高分子量标记的制备✓目的DNA的酶切最适条件（控制内切酶量实现）✓最适DNA大片段回收YAC载体臂的制备YAC臂与目的DNA大片段的连接YAC重组体对酵母的转化YAC基因库的保存YAC基因库的鉴定随机挑取100个YAC转化子，制备完整DNA，脉冲电泳分离，Southern转移，标记探针，预杂交。

目的基因YAC克隆的筛选PCR法对YAC克隆进行筛选，菌落原位杂交作为辅助手段进行筛选目的基因YAC克隆的鉴定用目的基因的序列、pBR322和PCR产物微探针进行杂交鉴定四、YAC的主要用途◆YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架。

◆用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。

◆在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都可采用YAC克隆系统。

五、YAC的缺点◆插入片段大，稳定性较差，不易操作；◆插入的大片段常发生缺失，使文库不完整；◆YAC与酵母天然染色体分子结构相似，分离时难与天然染色体分开；◆文库中的嵌合现象严重；◆因插入片段大，往往发生序列重排，造成序列错乱。

思考题1. 酵母人工染色体有什么作用？2. 酵母人工染色体的构建程序是什么？3. 酵母人工染色体有什么优缺点？。

酵母人工染色体的构建程序酵母人工染色体的构建程序染色体是生物体内的重要基因载体，包含了细胞遗传信息。

酵母人工染色体（YEAC）是通过人工手段构建的酵母基因组片段，具有重要的生物学和应用价值。

构建YEAC的程序是一个复杂而精密的过程，需要一系列步骤的有序进行。

首先，构建YEAC的第一步是设计合成目标染色体序列。

科研人员根据特定的研究目的和需求，选择需要构建的酵母人工染色体片段并进行基因序列的设计。

在设计过程中，要考虑到染色体稳定性、重要基因的完整性、引导序列的合理性等因素。

接下来，进行合成目标染色体序列的基因片段。

合成染色体片段的方法有多种，包括PCR扩增、化学合成、酶切连接等。

科研人员根据设计的基因序列，选择相应的合成方法进行基因片段合成。

在此过程中，需要考虑到合成效率、准确度以及避免合成错误的可能性。

完成基因片段的合成后，接下来进行染色体片段的组装。

这个过程需要将不同的基因片段按照设计顺序进行连接，并通过特定的酶切位点进行连接。

科研人员需根据设计的顺序和连接方式，进行准确而有效的组装操作。

构建YEAC的下一步是将组装好的染色体片段导入到酵母细胞中。

这个过程需要利用化学变性剂或电穿孔等方法，将染色体片段导入到酵母细胞中。

科研人员需要选择合适的导入方式，并进行适当的操作条件控制。

导入染色体片段后，需要进行筛选和鉴定工作。

这个过程是为了筛选出携带目标染色体片段的酵母细胞，并通过PCR扩增、序列测定等方法，进行目标染色体片段的确认。

科研人员需要仔细进行筛选和鉴定，确保所构建的YEAC是正确和稳定的。

最后，进行YEAC的研究和应用。

构建好的YEAC可以应用于基因组调控、基因功能研究、新药筛选等方面。

科研人员可以根据研究目的，设计相应的实验和应用方案，进一步探索和利用YEAC的潜力。

总之，酵母人工染色体的构建是一个复杂而精密的过程，需要经过设计、合成、组装、导入、筛选和鉴定等步骤，才能成功构建出目标染色体片段。

2009-08-04 22:22人类人工染色体HAC人类人工染色体研究进展人类人工染色体研究进展摘要：本文主要介绍了人类人工染色体（HAC）的结构、构建及其在基因治疗、转基因动物等方面的应用，对HAC的最新研究进展作了简要介绍，同时总结了当前HAC研究面临的问题。

关键词：HAC 基因治疗转基因动物酵母人工染色体（YAC）[1,2]、细菌人工染色体(BAC)等人工染色体相继构建成功以后，1997年，科学家成功构建了第一条人类人工染色体（Human Artificial Chromosome，HAC）[3]。

与YAC、BAC等相比，HAC不整合到细胞的基因组中,而是以一个独立的功能性染色体单位而存在，可以同细胞中正常的染色体一样复制、分裂、稳定遗传，并且不会对受体产生毒害，这使得HAC有可能解决基因治疗中的一些难题[3,4]。

HAC具有容量大、不容易导致基因沉默、可随细胞周期表达或关闭等优点，开创了人工染色体研究的新纪元，其研究受到广泛关注。

1. HAC的基本结构HAC包含构成人工染色体的所有基本结构，即端粒（TEL）、复制起点（Origin）及着丝粒（CEN）。

1.1 端粒端粒是人工染色体中了解得比较清楚的一个基本功能单位。

端粒是DNA-蛋白质复合物，能阻止染色体末端相互连接，并防止染色体复制时DNA丢失[5]。

端粒DNA由长5-20kb的(TTAGGG)n重复的排列串组成；将长度超过1 kb的(TTAGGG)n重复序列导入体外培养的人类细胞后,可在70%的转染细胞中发挥端粒功能[6]。

Farr将克隆的端粒DNA导入人-鼠杂种细胞，证明端粒DNA可以形成具有完整功能的端粒[7 ]。

1.2 复制起点人基因组DNA中约每50-300kb为一个复制子，每个复制子有一个独立的复制起始点以启动DNA合成[8]。

一些基因位点的复制起始点已被定位，如β-球蛋白基因、二氢叶酸还原酶基因等，但将这些位点的DNA片段转入细胞后就失去了复制起始点的功能。

酵母人工染色体的三个基本构件酵母人工染色体（YAC）是一种由人工合成的DNA分子，可以在酵母细胞中稳定存在，并且可以传递给下一代。

YAC的构建涉及到多个基本构件，包括载体、选择标记和目标基因。

一、载体载体是YAC的基本构件之一，用于将目标基因插入到酵母细胞中。

常用的YAC载体包括pYAC系列和pCG系列。

pYAC系列是最早开发出来的YAC载体，其主要特点是含有多个限制酶切位点和大片段DNA插入位点，可用于插入较大的DNA片段。

而pCG系列则是在pYAC系列基础上进行改进而得到的，在其上加入了更多的限制酶切位点和选择标记。

二、选择标记选择标记是指在转化酵母细胞时，能够筛选出带有目标基因的细胞。

常用的选择标记包括抗生素耐药基因和色素合成基因等。

其中抗生素耐药基因包括AMP（氨苄青霉素）、KAN（卡那霉素）和HIS3（组氨酸合成酶）等，这些基因可以使带有YAC的酵母细胞在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有YAC的细胞则无法生长。

色素合成基因则包括URA3（尿嘧啶合成酶）和TRP1（色氨酸合成酶）等，这些基因可以使带有YAC的酵母细胞在含有特定色素前体的培养基上生长。

三、目标基因目标基因是指要被插入到YAC载体中并在酵母细胞中表达的DNA片段。

常用的目标基因包括人类疾病相关基因、植物、动物和微生物等各种类型的DNA片段。

插入目标基因时需要注意其大小和稳定性，以确保能够稳定存在于酵母细胞中并且能够正确表达。

总结：酵母人工染色体的构建涉及到多个关键构件，包括载体、选择标记和目标基因。

载体是将目标基因插入到酵母细胞中所必需的重要构件，常用的载体包括pYAC系列和pCG系列。

选择标记是筛选带有目标基因的细胞所必需的构件，常用的选择标记包括抗生素耐药基因和色素合成基因等。

目标基因是要被插入到YAC载体中并在酵母细胞中表达的DNA片段，其大小和稳定性是构建YAC所需要关注的重点。

通过对这些关键构件的了解和掌握，可以有效地构建出稳定存在于酵母细胞中并且能够正确表达目标基因的YAC。

人工染色体载体第五节人工染色体载体一、酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes YACs）YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。

酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为 90 分钟；含16 条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有14×106 bp；具真核mRNA 的加工活性。

1．YAC人工染色体载体的复制元件和标记基因在YAC 载体中最常用的是pYAC4 。

由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。

但是，为了方便制备YAC载体，YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。

YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomously replicating sequence，ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（centromere , CEN）和两个端粒（TEL）。

YAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件：·端粒重复序列（telomeric repeat ，TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

·着丝粒（centromere ，CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。

在YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。

如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。

·自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。