人工染色体克隆载体
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第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量(kb) 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒(cosmid)是质粒的衍生物,是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点(ColE1)、抗性 标记(ampr)、cos位点,因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右,用来克隆大片段 DNA,克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1.黏粒pJB8o 大小为5.4kb,由 ampr,ColE1复制 起点(ori), cos位点,多克隆 位点组成,可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段,主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2.含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体, c2RB大小为 6.8kb,含两个 cos位点,在 cos位点之间有 Kanr(图4-3)。
o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb,含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 (neor)。
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科,其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中,常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒(Plasmid)质粒是一种环状双链DNA分子,通常存在于细菌细胞内,也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体,因其结构相对简单且易于操作,可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间,具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如,在基因克隆中,通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点,可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因,可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起,构建表达载体进入目标细胞中,使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体(Bacteriophage)噬菌体是一种寄生于细菌的病毒,是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力,因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大,可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合,在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外,噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库,通过大规模的筛选,筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体(Artificial Chromosome)人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体,在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子,通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中,将特定基因序列克隆到载体DNA上,进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用,基因克隆载体可以分为多种类型,以下是主要的几种:
1. 质粒(Plasmid):质粒是最常用的基因克隆载体之一,通常起源于细菌,具有自主复制的能力,易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体(Viral Vector):病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体,具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体(Artificial Chromosome):人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体,通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体(Prokaryotic Expression Vector):原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点,被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
基因工程一、名词解释(5*3)1、基因工程:按照人们的愿望,进行严密设计,通过体外DNA重组和转基因等技术将外源基因导入受体细胞,有目的地改造生物种性,短时内创造出更完善的新的生物类型。
2、1酶活性单位(unit或U):某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下,60 min 内完全切割 1μg λDNA所需的酶活性3、限制酶图谱(restriction map):描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱。
4、cosmid克隆载体(柯斯质粒载体):由质粒和含cos位点的λDNA片段组装成的载体,即cosmid克隆载体,又叫粘粒。
5、基因组文库:用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体,即构成了这种生物的基因组文库。
6、cDNA基因(部分)文库:某生物基因组转录的全部或部分mRNA经反转录产生的各种cDNA片段,分别与载体重组而存在于一种受体的群体7、克隆子:将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子转化子:导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子重组子:含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子8、报告基因:系指其编码产物能够被快速地测定,常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞(器官或组织)并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。
9、杂交探针——指具有一定序列的核苷酸片段,它能与互补的核酸序列复性杂交,并且通过适当标记进行检测。
10、外源基因表达系统:泛指目的基因与表达载体重组后,导入合适的受体细胞,并能在其中有效表达,产生目的基因产物(目的蛋白)。
外源基因表达系统(由基因表达载体和受体细胞组成)二、填空/选择1、基因工程流程:切、接、转、增、检2基因工程实施的四个必要条件:目的基因、载体、工具酶、受体细胞3、限制性核酸内切酶反应系统包括:酶、底物、反应缓冲液、合适的反应温度等。
4、DNA重组类型:插入重组、置换重组5、人工染色体克隆载体特点:能容纳长达1000至3000kb的外源DNA片段。
克隆载体
基因间隔区(intergenic region, IG 区)基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区,内含有复制起始位点,是实施改造、构建人工载体的重点区域。
② IG区内只有一个Bsu I 切点。
(2)加入酶切位点,在IG区内加入单一内切酶位点。
M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’(-肽序列)。
使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外,M13重组分子筛选简便,被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢,形成混浊斑,易于辨认挑选。
而且重组分子越大,混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小,只有 kb
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。
能像
-DNA那样进行体外包装,并高效转染受体细胞;能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力:45kb;具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒(cosmid)是带有 cos 序列的质粒。
cos序列是噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。
黏粒的组成包括质粒复制起点(colE1),抗性标记(amp r),cos 位点,因而能象质粒一样转化和增殖。
克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。
有的粘粒载体含有两个cos 位点,在某种程度上可提高使用效率。
质粒载体总结
λ噬菌体载体
表达载体。
人工染色体克隆载体:是一种“穿梭”载体,含有质立载体所必备的第一受体内原质立复制起始位点,还含有第二受体染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列,以及合速的选择标记基因。
固体发酵:某些微生物升长需水很上少,可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产。
蛋白质工程:基因工程的基础上,结合蛋白质结晶学计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识,通过对基因的人工定向改造等手段,从而达到对蛋白质进行修饰改造拼接以生产能满足人类需要的新型蛋白质技术。
DNA疫苗:是利用可隆于载体上的抗原基因直接注射机体,被细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原,通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。
人工种子:它是一种含有植物胚状体或芽营养成分激素以及其他成分的人工胶囊。
发酵工程:利用微生物生长速度快生长条件简单以及代谢过程特殊等特点,再合适条件下,通过现代化工程技术手段,由微生物的某中特定功能生产出人类所需的产品。
生物传感器:是用生物活性物质做敏感器件,配以适当的换能器所构成的分析工具。
载体:把能够承载外源基因,并将其带人受体细胞得以稳定维持的DNA分子。
胚胎移植:是由产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。
基因治疗:是利用遗传学的原理治疗人类的疾病。
细胞融合:两个或多个细胞相互接触后,其细胞膜发生分子重排,导致细胞合并染色体等遗传物质重组的过程。
花药培养:经过适当的诱导,花粉囊中的花粉可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织,最终生产花粉植株。
原生质的融合概念:从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。
固定化酶:指经物理或化学的方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受限制,而又能发挥催化作用的酶制剂.
基因克隆;是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。
⊙
生物技术有基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程
基因工程包括目的基因分离与可隆载体重组转人受体细胞筛选和鉴定可隆子。
改变蛋白质的主有方法改变蛋白质结构的核心技术是基因的人工定点突变,虽然基因人工顶点突变有很多方法,当要在一个的任何位点准确地进行定点突变,目前主要的方法有M13载体法和PCR扩增法。
可隆载体1、在可隆载体合适的位置必须含有允许外原DNA片段组入的可隆位点,并且这样的可隆位点应尽量可能的多。
2、可隆载体能携带外原DNA片段进入受体细胞,或能停留在细胞中进行自我复制。
3、可隆载体必须含有供选择转化子的标记基因,如根据转化子抗药性升降进行筛选。
4、分子量小、多复制、安全性好、易表达。
植物组织培养阶段;预备阶段诱导去分化阶段继代增殖阶段生根发芽阶段移栽成活阶段。
分批发酵;除了控制温度和pH及通气以外,不进行任何其他控制,操作简单。
但从细胞所处的环境来看,则有明显改变。
发酵初期营养物过多,可能抑制微生物的生长,而发酵的中后期又可能因为营养物减少而降低培养效率;从细胞的增殖来说,初期细胞浓度低,增长慢,后期细胞浓度虽高,但营养物浓度过低也生长不快,总的生产能力不是很高。
连续发酵;可以维持稳定的操作条件,有利于微生物的生长代谢,从而使产率和产品质量也相应保持稳定;能够更有效地实现机械化和自动化,降低劳动强度,减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会;减少设备清洗准备和灭菌等非生产占用时间,提高设备利用率;由于灭菌次数少,使测量仪器滩头的寿命得以扬长;容易对过程进行优化,有效提高发酵;容易造成杂菌污染在长期连续发酵中微生物容易发生变异,对设备和仪器控制元件的要求高,捻性丝状菌体容易附着给连续发酵带来困难。
补料分批发酵:补料分批发酵作为分批发酵向连续发酵的过度,兼有两者优点。
它可以解营养物质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。
对于好氧发酵,它可以避免在分批发酵中一次性投入糖过多造成细胞大量的生长,耗氧过多以至通风搅拌设备不能匹配的状况。
在某些情况下减少菌体生成量,提高有用产物的转化率。
可隆动物意义:1、遗传素质完全一致的可隆动物将更有利于开展对动物生长发育衰老和健康机制的研究2、有利于大量培养品质优良的家禽3、经转基因的可隆动物将能为人类提供源源不断的廉价药品保健品以及人体移植器官4、科学家将很快从目前的同种可隆技术推进到异种可隆,这将大大促进对濒临灭种动物的保护工作。
原生质体的制备:1、取材与除菌2、酶解3、分离4、洗涤5、鉴定
环境中的应用:利用新的指示生物监测评价环境;利用核酸探针和PCR技术监测评价环境;利用生物传感器,
DNA芯片及其他方法等监测评价环境。
1、基因工程与传统的育种相比有哪些突出优越性,如何合理利用基因工程技术促进农业生物的
遗传改良?
答:长期以来人们不断地寻求提高重要作物的质量和产量的方法,传统的育种过程是一个缓慢而艰辛的过程,但它取得了重大的成功,例如高质量的水稻、玉米、小麦等就是从它们早先的种演变而来的。
但基因工程育种等现代生物技术方法将在农业生物的遗传改良方面发挥越来越重要的作用。
应用基因工程技术在抗病毒病、抗细菌和真菌病、抗虫、抗旱、抗寒、抗高温、抗盐以及改善植物品质、雄性不育、延缓果实成熟、改变花色和表达药用蛋白或多肽等方面选育出了一批转基因植物。
基因工程与传统育种相比突出的优越性在于打破常规育种难以突破的物种之间的界限,并且可以更精确,更具有可预测性的控制基因的引入,可以使原核生物与真核生物之间,动物与植物之间,甚至人与其他生物之间的遗传信息进行相互重组和转移。
合理利用基因工程技术首先要对于植物基因研究工作进行规范和合理约束,主要是出于生物多样性的考虑。
其次,在操作过程中要避免对环境的污染。
2、利用生物技术开发的药物有哪些?为什么基因工程药物的研究与开发具有巨大的应用潜力和
十分诱人的前景?
答:利用生物技术开发的药物主要有抗生素及其他天然药物和基因工程药物两大类。
蛋白质是生命活动最重要的物质之一,并且很多蛋白质与人类的疾病密切相关。
在DNA重组技术出现之前,大多数的人用蛋白质药品主要是从人或动物的组织或器官中提取的,成本特别高、产率产量很低,供应十分有限,且存在不安全因素。
基因工程技术可以克服传统方法生产蛋白质药物的困难。
首先,基因工程技术可以解决蛋白质药物的产量问题。
将有治疗意义的蛋白质基因克隆后,导入细菌、酵母等生长旺盛的表达系统中,使这个基因接受表达系统中强的表达元件的控制而大量表达,人们就可以很容易地得到可供临床使用的大量药物。
其次,由于细菌、酵母生长条件相对简单,容易大量培养,因而可大大降低生产成本。
再次,用基因工程生产人源的蛋白质药物将是安全、有效的,不用担心其他病原体的污染,也不用担心动物源药物的抗原性。
另外,基因工程技术不仅可以获得大量的有活性的人源药物,而且可以通过基因工程的方法对蛋白质基因的结构加以改造以改变蛋白质结构,使这种被修饰后的蛋白质药物的性质更加稳定、活性更高、副作用更低。
干细胞:是动物胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞,是重建修复病损或衰老组织器官功能的理想种子细胞。
意义:干细胞治疗与传统方法的比较1、低毒性,一次治疗有效2、不需要完全了解疾病发病的硗确机制3、用自身干细胞移植,可避免产生免疫排斥反应。
一、在windowsXP中,默认状态是无法重装IE的,如果因为文件出错故障等原因必须重装,可以使用如下方法。
插入windowsXP 安装光盘,在“开始-运行”窗口输入“rundll32.exesetupapi,lnstallHinfSectionDefaultlnstall132c:\windows\inf\ie.inf"回车后即可重装IE(假设windows安装在c:\windows中)
二、1.控制面板添加删除里卸了IE
2.控制面板添加删除添加WINDOWS组件里找到IE然后卸掉
3.C:\ProgramFiles\目录下找到InternetExplorer删除InternetExplorer
4.注册表删除
①对IE5.0的重装可按以下步骤进行:
第一步:打开“注册表编辑器”,找到[HKEY_LOCAL_MACHINE\Software\Microsoft\InternetExplorer],单击其下的VersionVector 键。
第二步:在右侧窗格中双击IE子键,将原来的“5.0002”改为“4.0”,单击“确定”后退出“注册表编辑器”。
第三步:重启后,就可以重装IE6。
0了。
②IE6.0的重装有两种方法:
方法1:打开“注册表编辑器”,找到[HKEY_LOCAL_MACHINE\SOFTWARE\Microsoft\ActiveSetup\
InstalledComponents\{89820200-ECBD-11cf-8B85-00AA005B4383}],将IsInstalled的DWORD值改为0就可以了。
但是你得先下载IE6.0SP1后,然后再卸载。