第4章 人工染色体载体
黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体
表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性
载体
黏粒 P1 PAC BAC YAC
容量（kb） 复制子
30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS
宿主
拷贝数
重组DNA导入 宿主的方式
转导 转导 电转化 电转化 转化
筛选标记
— sacB sacB α-互补 ade2
克隆DNA 获取方法 碱抽提
大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1
脉冲场电 泳
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4.1 黏粒载体
4.1.1 黏粒的结构特征和用途
o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理
图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤
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4.1.3 黏粒克隆载体
1．黏粒pJB8
o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体
o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。
o 装载容量3346.5kb
图4-3 黏粒载体c2RB图谱
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图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤
o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。
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4.1.4 黏粒的优缺点
（1）同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性
（2）具有高容量的克隆能力
柯斯质粒的缺点
o 两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生 重组，结果使克隆的外源DNA片段重排或丢失。
o 含不同重组DNA的菌落生长速度不一。
当柯斯质 粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主 细胞作用的情况不同，结果会出现各种外源DNA 片段间的比例失调。
另外不同重组柯斯质粒的产 量相差悬殊。
o 包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装 效率不稳定。
而且，购买包装蛋白的费用较高。
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4.2 酵母人工染色体载体
o YAC (Yeast Artificial Chromosome ) 酵母人工 染色体 o 利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染 色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿 酒酵母中。
o 酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90 分钟；含16条染色体，其大小为225-1900kb，总计 有14×106bp；具真核mRNA的加工活性。
4.2.1 YAC载体的复制元件和标记基因
o 最常用的是pYAC4。
o 由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状 态也是线状的。
但是，为了方便制备YAC载体， YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠 杆菌质粒载体的复制元件和选择标记。
o YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主 复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂 功能的着丝粒（centromere, CEN）和两个端粒 （TEL）。
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YAC载体必须含有元件
①端粒重复序列（telomeric repeat， TEL），定 位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不 被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。
②着丝粒（centromere， CEN），有丝分裂过程中 纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正 确分配到子细胞中。
在YAC中起到保证一个细胞内 只有一个人工染色体的作用。
如pYAC4使用的是酵 母第四条染色体的着丝粒。
③自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌 中DNA进行双向复制所必须的信号。
YAC载体的选择标记 o 主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组 氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合 成缺陷型基因ura3等，以及赭石突变（突变为 UAA） 抑制基因sup4。
o 与YAC载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的 胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。
带有 这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落， 当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中 时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白 色菌落。
o 利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中 含有外源DNA片段插入的重组子。
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4.2.2 YAC载体的工作原理
o YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别 用来构建高等真核生物的基因组文库。
ClaI (25)
CEN4
HindIII (30) EcoRI (555)
ARS1
HindIII (9630)
Sma I (592) Sal I (944)
TRP1
XbaI (9201)
URA3
pYAC4
AP r
11454 bp
XhoI (3533)
PMB1
XhoI (6711) HindIII (6701)
HindIII (3543)
TEL
BamHI (4238)
TEL
BamHI (6006)
ClaI (4307) HindIII (5045)
HIS3
HindIII (5232)
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图4-6 pYAC4载体工作原理图
o 外源DNA片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，形成红色菌落；
4.3 细菌人工染色体载体（BAC）
o 细菌人工染色体（ Bacteria Artificial Chromosome，BAC）是基于大肠杆菌的F质粒构建 的高通量低拷贝的质粒载体。
o F质粒是一个约100kb的质粒，编码60多种参与复 制、分配和接合过程的蛋白质。
o 虽然F质粒通常以双链闭环DNA（1-2拷贝/细胞） 的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少 30个位点处进行随机整合。
o F质粒可通过性菌毛转移给受体细胞。
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4.3.1 BAC载体及其结构组成
o 约7.5kb，其本质实际上是一个质粒克隆载体。
o 复制单元的特殊性:来自F质粒，包括严谨型控 制的复制区oriS，启动DNA复制的由ATP驱动的 解旋酶（RepE）以及3个确保低拷贝质粒精确分 配至子代细胞的基因座（parA、parB和parC）。
o 低拷贝性可以减小外源基因的表达产物对宿主 细胞的毒副作用。
o 标记基因:氯霉素抗性基因
o BAC与YAC和PAC相似，没有包装限制，因此可接受 的基因组DNA大小也没有固定的限制。
o 大多数BAC文库中克隆的平均大小约120kb，个别的 BAC重组子中含有的基因组DNA最大可达300kb。
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图4-10 P1噬菌体载体构建DNA文库的流程图
图4-11 PAC载体pCYPAC1遗传结构图。
