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猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)3′末端非翻译区中调控序列的研究

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猪繁殖与呼吸综合征的防治

猪繁殖与呼吸综合征的防治

猪繁殖与呼吸综合征的防治猪繁殖与呼吸综合征是一种常见的猪类传染病，也称为PRRS。

该病主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，可引起猪只的呼吸道疾病和繁殖系统疾病。

该病具有高度传染性和致病性，给养猪业造成了严重的经济损失。

有效的防治措施对提高猪只的健康状况和养殖效益至关重要。

一、猪繁殖与呼吸综合征的病原学特征PRRSV属于家畜病毒科病毒，是一种RNA病毒。

该病毒被分为两种亚型：欧洲亚型和北美亚型。

这两种亚型在疾病表现和临床症状上有所不同。

该病毒主要通过直接接触或通过空气传播进行传播。

受感染的猪只可从几天到数周的时间内发病，且病程可长达几个月。

病毒在猪只的呼吸道和生殖系统中复制，并直接损害相关器官。

二、猪繁殖与呼吸综合征的临床表现感染PRRSV后，猪只可表现出不同程度的临床症状。

在呼吸道感染方面，病猪可出现咳嗽、打喷嚏、流涕等症状。

在繁殖系统感染方面，母猪可出现胎儿吸收、死胎、流产等临床症状。

感染PRRSV还会导致猪只的免疫功能下降，易受其他病原微生物感染。

三、猪繁殖与呼吸综合征的防治措施1. 强化生物安全措施：合理规划养猪场的设计和布局，确保猪只之间的隔离和防护。

减少与其他养猪场、外来猪群等有可能携带PRRSV的猪只接触。

2. 良好的管理和饲养条件：保持养殖环境的清洁和卫生，减少病原微生物在环境中的存活和传播。

加强猪只的饲养管理，保持猪只的健康和免疫功能。

3. 严格的动物交通控制：对所有进入养猪场的动物进行必要的检疫和隔离，确保不带有病原微生物的猪只进入养殖场。

4. 规范用药：对于疑似或确诊感染PRRSV的猪只，及时采取相应的治疗和预防措施。

在使用抗生素和疫苗时，需按照严格的使用要求和指导进行使用，以减少药物滥用和耐药性的产生。

5. 加强疫苗接种：猪繁殖与呼吸综合征的疫苗已经开发并广泛应用于养猪业。

对于高风险的养猪场，可以采取预防性接种疫苗的措施，以提高猪只的免疫力和抵抗力。

6. 增强养猪场的自控能力：提高养猪场的自控能力，加强猪只的监测和检测工作，及早发现和诊断疾病。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白研究进展
Ｐ Ｒ Ｖ 引起 呼 吸 道 疾 病 ， 间 质 性 肺 炎 为 特 征 ， 文 主 要 从 近 几 年 研 究 的 Ｐ ＲＳ 的非 结 构 蛋 白特 性 、 疫 Ｒ Ｓ 以 论 Ｒ Ｖ 免
学功 能 、 结构蛋 白基 因的 变异等 方 面进 行分析 ， 非 阐述 非结 构蛋 白在病毒 的增殖 、 致病力产 生 的影响 ， 而为 从
Ｐ Ｒ Ｖ的 Ｏ １ Ｒ Ｓ ＲＦ 是最 大 的一个读 码框 ， 长大 约
可 能构 成半胱 氨酸 蛋 白酶 ， ｐ 诱 导 Ｎｓ ２和 Ｎ ｐ Ｎｓ ２ ｐ ｓ３
的裂 解 并 作 为 Ｎｓ４丝 氨 酸 蛋 白 酶 的 辅 因 子 。 Ｎｓ ３ ｐ ｐ
１ ｂ 约 占整 个 基 因 组 的 ８ 。ＯＲ １编 码 依 赖 ２ｋ ， ０ Ｆ ＲＮＡ 的 Ｒ ＮＡ 聚 合 酶 ， 氨 基 酸 序 列 含有 ＡＥ 和 其 Ｖ
蛋 白其 Ｎ端 和 Ｃ端较 为保守 ， 中央 区域的 同源性较 低 ， 裂 解 后 产 生 ６个 非 结 构 蛋 白分 别 为 Ｎｓ ｌ 、 经 ｐ ａ Ｎｓ ｌ 、 ｐ 、 ｐ 、 ｐ 、 ｐ ， 中 非 结 构 蛋 白 ｐ ￣ Ｎｓ ２ Ｎｓ ３ Ｎｓ ４ Ｎｓ５ 其 ｔ
Ｎｓ ｌ 、 ｐ ￣ Ｎｓ２ Ｎｓ ４ 具 有 水 解 酶 的 活 性 ， ｐ ａ Ｎｓ ｌ 、 ｐ 、 ｐ
５ 一 ＣＲ一 ＲＦ１ — Ｎ ０ ＯＲ Ｆ１ — ＲＦ２ Ｏ Ｒ Ｆ３ Ｏ ＲＦ４ Ｏ ＲＦ５ ａ Ｏ ｂ 一 一 ～ 一
Ｎｓ ２蛋 白 中央 区有 脯 氨酸 富集 区 而且 变异 最 为 显 ｐ 著 ， 蛋 白可 能具有 种属特 异性功 能 ， 有 耐受 插入 该 具 突变 、 碱基 变 异 的能 力 。Ｎｓ２及 Ｎｓ ４分 别含 有半 ｐ ｐ

猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪microRNA的初步筛选

猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪microRNA的初步筛选

猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪microRNA的初步筛选郜原;薄联锋;武小椿;孙柏;温俊歌;孙岩;徐志坤;张德礼【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2012(048)003【摘要】本试验旨在初步筛选出与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染相关的猪microRNA(miRNA).采用生物信息学方法预测可能与PRRSV 3'非编码区(3'utr)产生相互作用的猪miRNA,构建PRRSV 3'utr的双荧光素酶报告基因载体psiCHECK-utr,同时合成预测到的miRNA(ssc-miR-323、ssc-miR-105-1)及其相应的抑制物,共转染猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC),检测双荧光素酶活性.结果发现,ssc-miR-323与psiCH ECK-utr共转染后,荧光比率略有升高,ssc-miR-105-1与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率降低.初步判定ssc-miR-323对PRRSV 3'utr 没有抑制作用,而ssc-miR-105-1对PRRSV3'utr有一定的抑制作用.【总页数】4页(P21-24)【作者】郜原;薄联锋;武小椿;孙柏;温俊歌;孙岩;徐志坤;张德礼【作者单位】西北农林科技大学动物医学院兽医微生物学与病毒学课程组病毒免疫与生物信息研究室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院兽医微生物学与病毒学课程组病毒免疫与生物信息研究室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院兽医微生物学与病毒学课程组病毒免疫与生物信息研究室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院兽医微生物学与病毒学课程组病毒免疫与生物信息研究室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院兽医微生物学与病毒学课程组病毒免疫与生物信息研究室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院兽医微生物学与病毒学课程组病毒免疫与生物信息研究室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院兽医微生物学与病毒学课程组病毒免疫与生物信息研究室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院兽医微生物学与病毒学课程组病毒免疫与生物信息研究室,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.6【相关文献】1.魁北克省多日龄猪接种FLEX系列茵格发(R)猪圆环病毒疫苗预防猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的初步结果 [J], Robert Desrosiers;Edward (Ted) Clark;Dorine Tremblay;Robert Tremblay;Dale Polson;黄念2.猪增生性与坏死性肺炎病例中猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型和猪流感病毒的检出率 [J], 乔宏兴3.猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒2型共感染猪组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的分布 [J], 李燕华;郭鑫;杨汉春;盖新娜;陈艳红;查振林4.猪流感病毒与繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、圆环病毒、伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌混合感染的情况调查 [J], 覃绍敏;梁安莉;王仰杰;向晖;黄红梅;陈凤莲;马玲;吴健敏5.“猪Ⅱ型圆环病毒”专栏七(与猪Ⅱ型圆环病毒相关的最新研究成果):受或未受PMWS影响的猪群猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)的血清转换图谱 [J], 陶莉;K.Podgórska;T.Stadejek因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪繁殖与呼吸综合征病毒3’非编码区结构与功能解析

猪繁殖与呼吸综合征病毒3’非编码区结构与功能解析

猪繁殖与呼吸综合征病毒3’非编码区结构与功能解析猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是一种可以引起以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统症状为特征的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病毒,对养猪业危害严重。

PRRSV的基因组为一条长约15kb的单股正链RNA,包括5’端帽结构、5’非编码区、10个开放阅读框、3’非编码区(3’UTR)和3’ Poly (A)。

该病毒有两个基因型：Ⅰ型(欧洲型)和Ⅱ型(北美型)。

关于PRRSV病毒基因组RNA的复制、亚基因组mRNA的合成和蛋白的翻译、病毒颗粒组装以及病毒致病机理等许多问题目前尚未解决。

大量研究已经证明,单股正链RNA病毒的3’非编码区(3’UTR)对病毒复制具有至关重要的作用,但是目前对于PRRSV的3’UTR的调控功能还知之甚少。

本研究旨在采用反向遗传学(RGS)技术,利用实验室构建的Ⅱ型PRRSV全长感染性克隆,构建一系列3’UTR突变体,通过一系列在细胞水平上的体外试验,解析PRRSV 3’ UTR的结构与功能的关系,为进一步剖析病毒致病机理和人工控制病毒奠定基础。

现将研究内容简述如下：1. PRRSV 3’ UTR 5’端序列缺失对病毒复制的影响在Ⅱ型PRRSV全长感染性克隆pAPRRS的基础上,利用突变PCR技术成功构建病毒基因组3’UTR系列缺失的全长突变质粒,将这些突变体转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和RT-PCR的方法分别鉴定缺失区域对蛋白翻译、亚基因组及负链基因组合成的影响。

随后用转染上清感染MARC-145细胞,通过观察细胞病变检测上清中是否含有具有感染性的病毒,并通过空斑形态、生长曲线鉴定缺失区域对病毒在MARC-145细胞上复制效率的影响,以及通过RT-PCR检测拯救病毒基因组序列变化。

结果显示病毒3’UTR 5’端前66个碱基是病毒感染性非必需的,但是缺失会降低病毒在MARC-145细胞上的复制效率；缺失67个碱基的突变体会降低亚基因组的合成丰度,并且不能拯救病毒；缺失67个碱基以上的突变体无拯救病毒产生同时也检测不到亚基因组,证明多于66个碱基的缺失会影响病毒感染性和亚基因组合成。

猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学研究进展作者：于忠良，温书香，安利民来源：《畜牧兽医科学》 2018年第1期摘要：本文主要对猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学特点进行详细叙述，以期为相关研究人员对此病毒有更深入的了解。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒病；理化性质；基因组结构中图分类号：S858. 28文献标识码：BDOI：10. 3969/j．issn．2096-3637. 2018. 01. 0101猪繁殖与呼吸综合征病毒分类和结构猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)隶属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。

在电子显微镜下，猪繁殖与呼吸综合征病毒呈椭圆形或者类似球型。

病毒粒子的直径在48到83nm，核衣壳的直径在25到30nm，囊膜表面有纤突。

PRRSV病毒的遗传物质为单链RNA。

2猪繁殖与呼吸综合征病毒的理化性质1992年Benfield等人报道称猪繁殖与呼吸综合征病毒在氯化铯中的密度在1.13到1.19g/cm3。

PRRSV病毒对热源比较敏感，在高温条件下可以迅速死亡。

在低温条件下，较长时间也可以灭活。

如在37℃或者56℃不超过th均可以灭活。

PRRSV能够在血清中维持活力，在-70℃的条件下仍然保持感染性，在4℃的条件下至少存活1个月。

PRRSV在潮湿的环境中活性和感染力都比较强，而在干燥的环境中活性非常低，容易失活。

PRRSV是有囊莫病毒，根据相似相容原理，该病毒对有机溶剂比较敏感。

3猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组结构猪繁殖与呼吸综合征病毒的全基因组序列已经全部测完，根据不同地区分离到的PRRSV病毒核酸的序列差异，Allende等人在1999年将猪繁殖与呼吸综合征病毒分为2个基因型，即欧洲型和美洲型。

1995年，我国养猪场爆发流行猪繁殖与呼吸综合征病，经过测序发现我国流行株是美洲型。

2007童光志等人报道，在2006年我国爆发流行的猪繁殖与呼吸综合征病病毒仍然是美洲型。

PRRSV基因组病毒与其它动脉炎病毒科的病毒类似。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)协同感染细菌性疾病的分析研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)协同感染细菌性疾病的分析研究

果 显 示 ，１Ｏ份 临床 样 品 中有 ５份 检 测 到 美 洲 型 变 异 ＰＲＲＳＶ，病 原 阳性 率 为 ５ｏ 。ＯＲＦ５全 基 因序 列 分 析 表 明 ，
２个 流 行 毒 株 间 的核 苷 酸 同 源 性 为 ９９．７％ ，与 以 ＴＪＭ Ｆ９２、ＪＸＡ１ Ｒ、ＨｕＮ４一Ｆ１１２等 为 代 表 的 高 致 病 性 致 弱 疫 苗 毒
ＰＲＲＳＶ）流 行 毒 株 的遗 传 变 异 和 临 床感 染情 况 ，试 验 采 集 １Ｏ份 疑似 ＰＲＲＳ发 病 仔 猪 的 肺 脏 、淋 巴结 等 临 床 样 品 ，应
用 ＲＴ～ＰＣＲ方 法 扩 增 ＰＲＲＳＶ 的 Ｎｓｐ２部 分 基 因 用 于 定 性 检 测 分 析 ，并 对 扩 号 ：￥８５２．６５ ９．６
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７１—７２３６（２０１８）０３—０７８１—０９
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｃｏ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ａ ｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒ ｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍ ｅ Ｖｉｒｕｓ （ＰＲＲＳＶ） ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
（１．湖 北 省 农业 科 学 院 畜 牧 兽 医研 究 所 ，湖 北 省 动 物 胚 胎 工 程 及 分 子 育 种 湖 北 省 重 点 实 验 室 ，武 汉 ４３０２０９； ２．华 中农 业 大 学 动 物 医学 院 ，武 汉 ４３００７０）
摘 要 ：为 了解 湖 北 某 养 殖 场 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 （ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，
保 育 猪 的 发 病 病 原 ，并从 分 子 水 平 明 确 了临 床 ＰＲＲＳＶ 与 不 同疫 苗 毒 株 的亲 缘 关 系 ，为 弱 毒疫 苗 的合 理 选 择 使 用 和 综 合 防 控 ＰＲＲＳ提 供 了实 践 依 据 。

猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫抑制研究进展


期 时或随 后 即表 现 出严 重 的 母 猪 繁殖 障 碍症 状 ， 如
弱胎 、 死胎 、 木乃 伊胎 及断 奶前仔 猪高 死亡 率等 口 。 ］
Ｐ ＲＳ Ｒ Ｖ株 间 的遗 传 、 原性 及致 病性 等在 疾病 抗
ｎ ｐ １能 以 不 同 的 强 度 抑 制 干 扰 素 （ｎｅｆｒｎ ｓｌ ｉｔｒ ｏ ， ｅ
动物 医学进 展 ，０ ２ ３ （ ０ ：５７ ２ １ ，３ １ ） ７ —８
Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
猪 繁 殖 与 呼 吸综 合 征 病 毒 免 疫 抑 制研 究 进 展
敬 晓 棋 孟 建 斌 高晓 阳 冯 平 闰 海龙 刘 生耀 于 鸿 浩 胡 军 和 屈 雷 ， ， ， ， ， ， ， ，
ｔ ｅａ ｄｒｓ ｉ ｔｒ ｙ ｄｏ ， ＲＲ ） 由 猪 繁 殖 ｉ ｎ ｅｐｒ ｏ ｙ ｓｎ ｒｍｅ Ｐ Ｓ 是 ｖ ａ
１ Ｐ ＲＳ 的 生 物学 特性 Ｒ Ｖ
Ｐ Ｒ Ｖ 属 于动脉 炎病毒 科 、 Ｒ ｓ 动脉炎 病毒 属 的单 与呼 吸 障 碍 综 合 征 病 毒 （ ｏｃｎ ｅ ｒｄ ｃｉｅ ａ ｄ 链 、 Ｐ ｒｉｅ ｒｐ ｏ ｕ ｔ ｎ ｖ 正链 Ｒ ＮＡ 囊 膜 病 毒［ 。Ｐ Ｒ Ｖ 分 为 欧洲 株 和 ４ Ｒ Ｓ ］ ｒｓ ｉ ｔｒ ｙ ｄ ｏ ｉ ｓ Ｐ Ｓ 引起 的以母 猪 ｅｐｒ ｏ ｙｓｎ ｒ ｍｅｖｒ ， ＲＲ Ｖ） ａ ｕ 北 美 株 ２个 类 型 ， 者在 抗 原 性 和 遗 传 性 等方 面 都 二 繁殖 障碍和各 年龄 段猪 呼吸 系统 障碍 为 特征 的传 染 存 在较 大差 异 ， 能 引 起 同样 的疾 病 症状 。Ｐ Ｓ 但 ＲＲ Ｖ 病ｎ 。２ ］ ０世纪 ８ ０年代 ， Ｒ Ｓ在北美 洲 和 欧洲 先后 Ｐ Ｒ 基 因组约 ｌ ｂ 包 含 ５非 翻 译 区 （ ｎｒｎ ｌｔｄ ｒ－ ５ｋ ， ｕ ｔ ｓ ｅ ｅ ａ ａ 出现 ， 目前 已在 全 世 界范 围 内 流行 。Ｐ ＲＳ在 世 界 ｇｉ ｎ，ＵＴＲ ）， ＯＲＦｌ ＯＲＦ１ ＯＲＦ２ Ｒ ｏ ａ、 ｂ、 ａ、ＯＲＦ２ ｂ、 范 围内 的 频 繁 爆 发 造 成 了 巨 大 的 经 济 损 失 ， 如 Ｐ ＲＳ 突 变株 在 中 国和 越 南 引起 的 “ 无 名 高 热 Ｒ Ｖ 猪

猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组分子遗传特征分析

息。
病毒基因组变异 可能导致疫苗免 疫效果降低
病毒基因组变异 可能导致疫苗免 疫效果持续时间 缩短
病毒基因组变异 可能导致疫苗免 疫效果产生耐药 性
病毒基因组变异 可能导致疫苗免 疫效果产生副作 用
基因组测序技术：二代测序、三代测序 等
基因组组装：利用生物信息学方法进行 基因组组装
基因变异分析：通过比对基因组序列， 分析基因变异
抗病毒药物的研发和应用，还可以为猪繁殖 与呼吸综合征病毒的预防和治疗提供新的手 段和方法，提高猪场的生产效益。
汇报人：
猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因组遗传标记的定义和
作用
猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因组遗传标记的分类和
特点
猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因组遗传标记的检测方
法和技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因组遗传标记在疾病诊
断和研究中的应用
抗原性变异的定义：病毒 表面抗原发生变异，导致
免疫系统无法识别
抗原性变异的原因：病毒 基因突变、重组、插入、
基因功能预测：利用生物信息学方法预 测基因功能
基因组进化分析：通过比较不同物种 的基因组，分析基因组的进化关系
基因组数据可视化：利用生物信息学软 件，可视化基因组数据
基因测序：通过DNA测序技术，确定基因序列 基因分型：通过基因分型技术，确定基因型 基因突变检测：通过基因突变检测技术，确定基因突变 基因表达分析：通过基因表达分析技术，确定基因表达情况
病毒免疫逃逸：抗原变 异、免疫抑制等
病毒与宿主相互作用： 病毒感染、免疫应答、 免疫调节等
病毒基因组变 异：的能
力
变异与致病力 的关系：变异 可能导致致病 力的增强或减
弱
研究意义：为 疫苗研发和疾 病防控提供依

猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）非结构蛋白7α（nsp7α）三维结构..

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白7α (NSP7α)三维结构的解析和其功能的初步研究摘要猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一种正链单股RNA病毒，它引起的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是全世界养猪产业中最有危害性的疾病之一。

研究表明PRRSV的非结构蛋白7(NSP7)参与到了体液免疫反应中并与PRRSV感染的猪血清有强烈的反应。

NSP7有一个内部的蛋白酶酶切位点，可使其在蛋白酶的作用下被剪切成NSP7α和NSP7β。

本研究应用抗NSP7α和NSP7β的抗血清检测了这两种非结构蛋白在病毒感染的细胞中的表达情况；应用核磁共振(NMR)解析了溶液中PRRSV NSP7α的结构，并将该结构与其同源蛋白EA V NSP7a的结构进行了比对分析；确定了NSP7α和PRRSV的RNA依赖性RNA聚合酶(NSP9)之间的互作关系，并在NSP7α三维结构的基础上预测并鉴定了位于NSP7α上与NSP9互作的关键氨基酸。

这些结果为在后续实验中探究NSP7α的功能及PRRSV侵染细胞的机制提供了新的思路。

本论文包括以下几个方面的内容：1．以原核表达的蛋白NSP7α和NSP7β分别免疫家兔制作多克隆抗体，并通过Western blot分别检测了两个蛋白在感染PRRSV后不同时间点的MARC-145细胞及PRRSV的天然宿主细胞猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中的表达。

随后以感染PRRSV MARC-145细胞为样品，通过免疫荧光技术检测了NSP7α和NSP7β及其前体蛋白在细胞中的分布情况。

在Western blot实验中抗NSP7α的抗血清检测到了与NSP7α大小相近的条带和若干与NSP7的前体蛋白大小相近的条带。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)3′末端非翻译区中调控序列的研究

调控 机制 。
（ｕｌ ｔ ｅｎ） 右 端 ３Ｕ Ｒ长 １０～１０ｎ。像其 它 ｎ ｃ ０ ｄ ，ｔ ； ｅｉ Ｔ １ ５ ｔ
正链 Ｒ Ａ病 毒 一样 ， 脉炎病 毒 的 ３Ｕ Ｒ对 病 毒 的 Ｎ 动 Ｔ
整个复 制过程 起 着重要 的 调控作 用ｂ 。黄病 毒科 和 冠状病 毒科 的病 毒 ３Ｕ Ｒ较 长 ， 够 独 立 的 构 成病 Ｔ 能
毒颗 粒组 装 的精 细调控 机 制 ， 以及病 毒 的致病 机理 ，
进 而确 定病 毒复 制 的调控 元件 。本 研究 利用 前期 构 建 的 Ｐ Ｒ Ｖ感 染性 克 隆 ， ＲＳ 在其 ３Ｕ Ｒ的 ５端 进行 了 Ｔ
一
１ｋ ， ５ ｂ 其基 因组 结构 为不 分节段 、 ５端帽 状 结构 和 有
３ ｐｌ Ａ）尾 的 正 义 Ｒ Ａ 左 端 ５ ｏ ｙ（ Ｎ 。 非 编 码 区 （ ｎｒ ｓ ｔ ｅｉ ， Ｔ 长 为 １０～２ ０个 核 苷 酸 Ｕ ｔ ｎｌ ｅ ｒ ｏ Ｕ Ｒ） ａ ａｄ ｇｎ ９ ２
系列 的缺 失与 插 入 突变 ， 以期 鉴 定 ３Ｕ Ｒ核 苷 酸 Ｔ
序列 中对病 毒转 录复 制 的 调 控序 列 与 结 构 ， 而 确 从 定病 毒 复 制 、 录 的 启 动 子 ， 转 以便 了解 Ｐ Ｒ Ｖ复 制 ＲＳ
（ ｉｏｉ ｌ ） 动脉 炎病 毒科 （ ｒ ｒ ｉｄｅ 的成 员 。 Ｎｄｖ ａ ｓ ， ｒｅ Ａｔ ｉ ｒ ａ ） ｅｖ ｉ 动脉 炎病 毒是一 种 有囊 膜 、 衣壳 为正 二 十面 体对 核 称 的单 股 正 链 Ｒ Ａ 病 毒 。Ｐ Ｒ Ｖ 全 基 因组 长 约 Ｎ ＲＳ
病毒 的感 染性 克 隆 ， 在此 基 础 上 进 行 反 向 遗传 学 操 作 ， 讨 Ｒ Ａ病 毒 复制 过程 的侵 入 、 探 Ｎ 复制 、 录 及病 转
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猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 （ !""#$） %& 末端 非翻译区中调控序列的研究
$ 孙 志&， ， 王金勇& ， 张建武& ， 秦爱健$ ， 袁世山& （& 中国农业科学院上海兽医研究所 中国动物卫生与流行病学中心上海分中心 农业部动物寄生虫病重点实验室 （ 扬州大学兽医学院
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上海
$%%$0$）
扬州
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稀 释 待 检 的 病 毒， 稀释好的病毒液感染细胞 再快速的将 +99 $‘ 孔。将 1 孔 板 置 /][ 孵 育 .L， " 然后加入到 1 +C92 琼脂糖与 + _ :;: 以 . a . 混合， 孔板中， -H$‘ 孔。室温凝固后， /][ ， -2 %(+ 恒温箱 用 -2 的结晶紫 倒置培养 - X 1O。小心的除去凝胶， 染色， 染色 .9 X .+H@A， 洗去多余的染色液， 观察空斑 的形态并拍照。 !", !","! -./012/3 45.0 检测 )&&67 亚基因组转录 细 胞 总 QN& 的 提 取： 拯救后的突变病毒
收稿日期： 修回日期： $%%"7%&7$0；接收日期： $%%"7%!7%1； $%%"7%"7%#
孙
志等：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 （*QQ#K） （+99]） （-） /^末端非翻译区中调控序列的研究 b ‘ 微生物学报 "]
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染性 克 隆 !"#$%&、 !"#$’(、 !)*+,-、 !)*.,/、 !$&)/、 全长突变感染性克隆均经 !"# 酶切鉴定。 !%’)..0， ! !"# 主要试剂和仪器 细胞生长液为含有 12 胎牛血清 （ 34#， 564%( 的 :;:， 维持液为 +2 34# 的 :;:。:;: %78 .1999） 液体培养基、 胰酶 （ <=>!?@AB;’<&， 、 无钙、 镁 9C+-2 ） 的磷酸盐缓冲液 *4#、 胎牛血清 34#、 +D:;: 培养 基、 青霉素链霉素均购自 564%( 公司。化学转染试 剂 $@!EFG087AH@AG<:+999、 (*<6B:;: 购 自 6AI@8=EJGA 公司。&:K 反转录酶， L? <7M ’N& 聚合酶和 ON<*? 购自上海 <7P7Q7 公司， 限制性内切酶购自 N;4 公 司。R6&JGA K@=7S QN& :@A@ P@8 购自 R6&5;N 公司。 NE=8LG=A:7T P@8 QN&U@V P@8、 4=@JL8#87= *?E=7SGAB4@E8@A、 4=@JL8#87=4@E’G8G08 均购自 &HW@EA 公司。 !"$ 细胞的转染 将 :&Q%B.":&Q%B."- 细胞由本实验室保存， 细胞接种于 1 孔细胞培养板中， 待细胞密度为 ,92 X ,-2 时进行转染。每孔加入 +C- X J 的全长突 " 变 质 粒 和 .9 $ $@!EFG087AH@AG +999 试 剂 " ， 根据转染试剂说明书进行转染。转染 （6AI@8=EJGA）
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微 生 物 学 报 !"#$ %&"’()&(*(+&"$ ,&-&"$
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理尚 需 进 一 步 试 验 验 证。 随 着 反 向 遗 传 系 统 （H.R./>. W.@.+=*> IA>+.<， 技术的兴起， 人们开始 HWI） 通过构建 HNO 病毒基因组的 *XNO， 获得诸多 HNO 病毒的感染性克隆， 在此基础上进行反向遗传学操 作， 探讨 HNO 病毒复制过程的侵入、 复制、 转录及病 毒颗粒组装的精细调控机制， 以及病毒的致病机理， 进而确定病毒复制的调控元件。本研究利用前期构 建的 GHHIJ 感染性克隆， 在其 0LM4H 的 #L端进行了 一系列的缺失与插入突变， 以期鉴定 0LM4H 核苷酸 序列中对病毒转录复制的调控序列与结构， 从而确 定病毒复制、 转录的启动子， 以便了解 GHHIJ 复制 调控机制。
［! ’ 6 ］ 毒复制所需的顺式调控元件 ， 在马动脉炎病毒 ［0］ ［$］
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材料和方法
突变质粒的构建 （ W.@-9@S 登 录 GHHI 北 美 株 全 长 感 染 性 克 隆
（;UB=@. 9/+./=R=/B> ） 和 GHHIJ 中， 试验证明其 0L端的 编码 顺式调控元件延伸到了上游的核衣壳蛋白 （ N） ， 区 （)H8"） GHHIJ VJ 株的 0LM4H 序列与 )H8" 中的 序列互补形成调节复制的二级功能性结构。据报
（袁世山等， 未 号： O8&(!$&$） K232$ 由本研究室构建 发表） 。利用 PB=S 2?9@T. 突变 G2H 技术 （ I+/9+9T.@.） 分别构建 0LM4H 突变的全长感 和中间质粒 K34!#&，
基金项目： 国家自然科学基金 （0%#0%#(%） ； 国家重点基础研究发展规划 （1"0 项目） （$%%#23#$0$%$）
， 于 1% 年代初相继 与呼吸障碍综合征病毒 （ GHHIJ） 分离于欧洲和美国， 并迅速的成为危害养猪业的重 大 疫 病。 GHHIJ 是 新 成 立 的 套 式 病 毒 目 （N=Q,R=/95.>） ， 动脉炎病毒科 （ O/+./=R=/=Q9.） 的成员 。 动脉炎病毒是一种有囊膜、 核衣壳为正二十面体对 称的 单 股 正 链 HNO 病 毒。 GHHIJ 全 基 因 组 长 约 其基因组结构为不分节段、 有 #L端帽状结构和 &#S-， （ O ）尾 的 正 义 HNO。 左 端 #L 非 编 码 区 0L K,5A 长为 &1% ’ $$% 个 核苷酸 （M@+/9@>59+.Q /.T=,@， M4H） （@B*5.,+=Q.， ； 右端 0LM4H 长 &&% ’ &#% @+。像其它 @+） 正链 HNO 病毒一样， 动脉炎病毒的 0LM4H 对病毒的 整个复制过程起着重要的调控作用 。黄病毒科和 冠状病毒科的病毒 0LM4H 较长， 能够独立的构成病
猪繁殖与呼吸障碍综合征 （ G,/*=@. H.KI） 9@Q H.>K=/9+,/A IA@Q/,<.，
［&］ 发现于上世纪 (% 年代末 。其致病病原为猪繁殖
翻译及病毒包装的正常运转依 道， GHHIJ 的转录、
［"］ 赖着 0LM4H 精细有序地调节才能完成 ， 但这种推
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结果
)&&67 $8(9’& 突变全长克隆的构建与鉴定 突变 *%Q 构建的中间质粒 !"#$0.、!"#$O. 经
$%& ! 和 !’( ! 双酶切后获得的片段取代 !%4%+ 中 的相应区域构建感染性克隆 !"#$%&、 闭合 !"#$’(， 环结构和改变环的序列为互补序列， 成功的构建了 二级结构保守环的突变全长克隆， 构建好的全长质 粒送上海申能博彩测序证明突变正确。在本室此前 构建 了 在 /^B)<QB-^ 端 缺 失 了 ". 个 A8 （ .-/]9 X 的质粒 !%’)..0， 在此基础上又构建了 , 个 .-"..） （.-/]9 X .-".,） 和 ., 个 A8 （.-/]9 X .-"+,） 缺失的 A8 质粒 !)*.,/、 !)*+,- 和 /^B)<QB-^ 端 插 入 <Q# 等 +/A8 的质粒 !$&)/。突变克隆经 !"# ! 酶切出现了
和 I%4%+） 以低感染剂量感染单 （I$&)/、 I%’)..0、 层 :&Q%B."- 细胞， 感染 "ZL 后弃去培养基并加入 参照说明书提取细胞 QN&， 溶解到 ]C-H$ QN&U@V， +99 $ 无 QN& 酶的水中， Y ]9[ 冻存备用。 " 参照 !","# NE=8LG=A WSE8 特 异 性 探 针 的 制 备： 4=@JL8#87= *?E=7SGAB4@E8@A 试剂盒的说明书标记探针， 标记好的探针置 Y ]9[ 保存备用。设计探针参照全 基因组序列， 以 -^B)<QB-^ 端的互补序列作为探针， 序 列 如 下： #Q： %&5%<%%<5&%&&<&%&&&<5<%&&5 5%&<&5&5%%&&%&%%<&<&%5<%&<。 参照 NE=8LG=A:7T P@8 的说明书电泳并 !","$ 杂交： 杂交， +9 $ 细胞总 QN& 加入 "$ 3E=H7SOGL>OG $E7O " " 混匀后 1-[ 变性 .-H@A。"9I 电泳过夜， 转印到 ’>G， 4=@JL8#87=B*S\? 膜 上。 将 转 印 后 的 膜 移 入 预 热 的 )$<Q&L>W 杂交液中， "+[ 预杂交 /9H@A， .H$ 已预热 的 )$<Q&L>W 杂 交 液 稀 释 +9!: 探 针， "+[ 杂 交 过 夜。洗涤后将膜密封在杂交袋内， 置膜于暗盒中 DB 光胶片上成像。曝光后的第 + 天开始洗底片， 并拍 照保存。