构建全合成人源化噬菌体表面展示抗体库筛选特异性靶向治疗药物

噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展王志文【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2015(040)001【总页数】3页(P131-133)【关键词】噬菌体;噬菌体抗体库;小分子抗体;免疫抗体库;综述【作者】王志文【作者单位】蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室,安徽蚌埠233030【正文语种】中文【中图分类】R373.9噬菌体抗体库技术是由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术。

通过噬菌体表面表达技术，将抗体分子Fab段基因或Fv基因通过与噬菌体外壳蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ基因连接以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面，从而形成噬菌体抗体。

继1988年Parmley等［1］首次阐明噬菌体表面表达技术以来，抗体分子是噬菌体表面表达的第一个具有天然蛋白质功能的蛋白质分子。

Hoogenboom等［2］将轻链基因插入噬菌体载体的左臂，重链基因插入噬菌体载体的右臂，连接后包装成噬菌体，建立了第一个噬菌体抗体文库。

随着噬菌体载体系统的改进，噬菌体抗体技术得到广泛的应用，为了提高抗体库的多样性，在CDR区随机引入核苷酸序列而构成人工合成噬菌体抗体库;在已获得的阳性克隆的基础上，在特异性抗体基因CDR区进行基因突变筛选［3］，以获得高亲和力的特异性抗体。

噬菌体表面展示技术的问世和噬菌体抗体表达筛选系统的逐渐完善，使人们可以完全跨越抗原免疫而直接获得丰富多样的特异性抗体。

本文就噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展作一综述。

1 噬菌体抗体库技术噬菌体属DNA单链病毒，长约7 000 bp。

噬菌体在细菌内滚环复制，被噬菌体感染的细菌不会裂解，但生长速度减慢，同时分泌出大量成熟的噬菌体颗粒。

噬菌体基因组共编码11种蛋白，噬菌体展示技术通常选择在信号序列和p蛋白第一结构域之间插入外源蛋白编码序列，经过噬菌体的包装加工，外源蛋白即可表达在病毒颗粒的表面［4］。

Ward等［5］采用PCR技术从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA中扩增出VH基因，测序证实了其多样性，并随后在大肠埃希菌中表达了该VH片段。

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定罗弋;庞华;李少林;曹辉;李淑杰;王树斌;樊春波【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2009(029)011【摘要】目的构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体.方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv).将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库.以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能.将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测.结果成功构建噬菌体单链抗体库.经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍.随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%.SDSPAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体.结论成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体.【总页数】6页(P1155-1160)【作者】罗弋;庞华;李少林;曹辉;李淑杰;王树斌;樊春波【作者单位】重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;重庆医科大学附属第一医院核医学科,重庆,400016;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;包头市中心医院肿瘤科,内蒙古包头,014040;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇噬菌体单链抗体库的构建与鉴定 [J], 周艳红;祭芳;丁衬衬;史建荣2.抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定 [J], 李铁军;李德全3.抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定 [J], 段朝晖;毛越苹;罗晓红;李民友;劳伟思;王英;朱振宇4.鼠源抗AFB1噬菌体单链抗体库的构建与鉴定 [J], 裴世春;孙大庆;郭德军;宋薇;蒋琛5.全人源抗结肠癌噬菌体单链抗体库的构建及筛选鉴定 [J], 谢平丽;李官成;李艳东;周国华;李跃辉;郭锋杰;王甲甲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究一、概述在生物医学领域中，脑靶向递药系统一直是研究的热点和难点。

由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效进入大脑，从而限制了其在中枢神经系统疾病治疗中的应用。

开发新型的脑靶向递药技术，对于提高药物在脑部的浓度和疗效，降低副作用具有重要意义。

噬菌体展示技术以其独特的优势在药物研发和生物医学领域得到广泛应用。

该技术通过将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。

利用噬菌体展示技术，我们可以筛选到与特定靶标具有高亲和力的多肽或蛋白，为药物研发和疾病治疗提供新的候选分子。

本研究旨在利用噬菌体展示技术筛选具有脑靶向功能的多肽，并将其修饰到纳米粒表面，构建新型的脑靶向递药系统。

通过优化筛选条件和方式，我们成功获得了多个具有脑靶向功能的多肽序列，并通过实验验证了其脑靶向性。

我们还将这些多肽以共价连接的方式修饰到聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸共聚物（PEGPLGA）纳米粒表面，以提高药物的稳定性和脑部递送效率。

本研究不仅为脑靶向递药系统的开发提供了新的思路和方法，还为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的候选药物和递送策略。

通过进一步的研究和优化，我们相信这种新型的脑靶向递药系统将在未来为更多的患者带来福音。

1. 介绍脑靶向药物递送的重要性与挑战脑靶向药物递送是神经科学领域的一个关键研究方向，对于治疗脑部疾病具有重要意义。

由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效穿透并进入脑组织，这使得脑内疾病的治疗面临着巨大的挑战。

开发高效的脑靶向药物递送系统成为当前研究的热点和难点。

脑靶向药物递送的重要性主要体现在以下几个方面：对于脑部疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、脑肿瘤等，有效的药物递送能够显著提高治疗效果，改善患者的生存质量。

脑靶向递送系统能够实现药物的精准定位，减少对其他组织器官的副作用。

噬菌体展示技术的原理和方法噬菌体展示技术是一种利用噬菌体表面展示特定肽段或蛋白的技术。

这项技术自20世纪80年代问世以来，已在许多领域显示出广阔的应用前景，包括药物研发、疫苗设计、蛋白质相互作用研究等。

本文将详细介绍噬菌体展示技术的原理和方法，并探讨其优缺点和发展趋势。

噬菌体展示技术利用的是噬菌体的特性，噬菌体是一种病毒，专门感染细菌等微生物。

它们由蛋白质外壳和内部遗传物质组成，其中蛋白质外壳又由多个蛋白亚基组成。

噬菌体展示技术利用噬菌体表面展示特定的肽段或蛋白，这些肽段或蛋白可以来自天然蛋白质，也可以是人工合成的。

展示在噬菌体表面的这些肽段或蛋白能够与特异性受体结合，从而实现表面展示的功能。

噬菌体展示技术的关键之一是选择合适的展示载体。

载体通常是一种丝状噬菌体，其基因组可以容纳较小的外源基因片段。

常用的载体包括M filamentous phage等。

这些载体具有一些共同的特性，如对外源蛋白质的容纳能力较强，能在体内和体外环境中稳定存在等。

在噬菌体展示技术中，需要筛选出能感染特定细菌的噬菌体。

这些噬菌体可以是自生的，也可以是通过基因工程改造得到的。

在筛选过程中，可以利用不同细菌的特性，如受体类型、细胞壁结构等，来选择合适的噬菌体。

还需要考虑噬菌体的毒性、繁殖能力等因素。

在噬菌体展示过程中，需要反复感染以积累足够数量的展示肽段或蛋白。

这个过程中，通常需要使用超滤或凝胶过滤等手段对噬菌体进行纯化，以确保得到的展示肽段或蛋白的纯度和浓度。

反复感染的过程不仅可以增加展示肽段或蛋白的数量，还能帮助排除展示过程中可能产生的突变。

克隆选择是噬菌体展示技术的另一个关键步骤。

这个过程中，通过将展示肽段或蛋白与特定配体结合，筛选出能够与配体结合的克隆。

这些克隆可以进一步扩增和纯化，从而获得高亲和力和高特异性的克隆。

噬菌体展示技术的优点在于其能够将蛋白质或多肽特异性与噬菌体的生物学特性相结合，从而实现表面展示的功能。

噬菌体展示
简介
噬菌体是一种能够感染细菌并在其中繁殖的病毒。

它被广泛用于生物学研究和生物技术应用中，特别是在基因工程和基因治疗领域。

噬菌体展示技术是一种将特定蛋白质或肽段展示在噬菌体表面的方法。

通过选择与目标蛋白质相互作用的噬菌体克隆，可以筛选出具有特定功能的蛋白质或肽段。

本文将介绍噬菌体展示技术的原理、应用和优点。

原理
噬菌体展示技术依赖于噬菌体基因组中的一个外源基因，该基因编码目标蛋白质或肽段。

这个外源基因通常被插入到噬菌体的毒力因子基因中，例如毒力因子III基因。

插入后，目标蛋白质或肽段会与细菌细胞的表面结合。

噬菌体携带的基因信息会导致细菌细胞表面展示目标蛋白质或肽段。

通过这种方式，科研人员可以通过筛选和选择的方法找到与目标蛋白质或肽段相互作用的噬菌体克隆。

应用
噬菌体展示技术在生物学研究和生物技术应用中有广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：
抗体库筛选
噬菌体展示技术可用于抗体库筛选，以寻找与特定抗原相互作用的抗体。

通过将抗原展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出具有高亲和力和特异性的抗体，用于治疗和诊断应用。

肽库筛选
噬菌体展示技术也可用于肽库筛选，以寻找具有特定功能的肽段。

通过将肽段展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出与特定靶点相互作用的肽段，用于药物开发和治疗应用。

蛋白质互作网络研究
噬菌体展示技术可以用于研究蛋白质互作网络。

通过将一种蛋白质展示在噬菌体表面，并将其用作识别其他与其相互作用的蛋白质的。

全人源化抗体制备方法嘿，你知道吗？在现代医学的神奇世界里，抗体就像是我们身体的超级战士，在对抗疾病的战场上冲锋陷阵。

那全人源化抗体呢，更是其中的精英部队。

今天呀，我就来和大家唠唠全人源化抗体制备方法这个超酷的事儿。

咱们先来说说啥是全人源化抗体吧。

简单来讲，全人源化抗体就是完全由人类的基因编码产生的抗体。

这和那些部分来自其他物种或者经过改造的抗体可不一样。

它就像是土生土长的本地战士，对我们人体这个战场更加熟悉，打起仗来也就更得心应手。

那怎么制备全人源化抗体呢？这其中有一种方法是噬菌体展示技术。

想象一下，噬菌体就像是一个小小的快递员。

科学家们先构建一个庞大的人类抗体基因库，这里面包含了各种各样的抗体基因片段，就像是一个装满各种武器的武器库。

然后把这些基因片段“装”到噬菌体这个小快递员身上。

这些噬菌体就带着这些抗体基因片段在一个特殊的环境里展示它们的“货物”。

这个特殊环境就像是一个大集市，里面有我们想要让抗体去识别和结合的抗原，就好比是集市里的特定商品。

当噬菌体带着的抗体基因片段能够很好地和抗原结合的时候，就像快递员准确地把货物送到了需要的人手上，我们就可以把这个噬菌体筛选出来。

通过不断地筛选和优化，就能得到我们想要的全人源化抗体。

我有个朋友，他在实验室里就做这个噬菌体展示技术相关的工作。

他曾经兴奋地跟我说：“你看，这噬菌体就像一个个小机灵鬼，在这个基因和抗原的大舞台上欢快地跳舞，最后把我们想要的全人源化抗体给我们变出来。

”还有一种方法是转基因动物技术。

这就更有趣了。

我们可以把人类的抗体基因导入到动物的基因组里面，比如说小鼠。

这些小鼠就不再是普通的小鼠了，它们变成了生产全人源化抗体的小工厂。

小鼠在正常的生长过程中，会受到各种抗原的刺激，就像我们人在生活中会遇到各种病菌一样。

然后它们的身体就会根据这些抗原产生全人源化的抗体。

我记得有一次参加一个学术交流活动，有个研究人员在台上分享他的转基因小鼠制备全人源化抗体的研究成果。

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;王乾宇;黄高;安传伟【摘要】目的:构建人源噬菌体展示单链抗体(ScFv)库,筛选抗结核杆菌特异性、高亲和力的ScFv.方法:从结核患者的外周血淋巴细胞中,提取RNA并通过RT-PCR扩增出VH和VL基因,并采用SOE-PCR构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载pC ANTA B5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.结果:初级库库容量为3.5×106,在大肠杆菌TG1中重组后得到2.6 ×106的次级抗体库.结论:成功构建噬菌体展示ScFv库并获得人源抗结核杆菌特异性ScFv,为进一步研制抗抗结核杆菌的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定了基础.%Aim: To construct a human phage-displayed single-chain Fv antibody (ScFv) library and screen specific ScFv against Mycobacterium Smegmatis. Methods: The total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes in patients with Mycobacterium Smegmatis, first strand cDNA synthesis was performed using a cDNA synthesis kit and an oligo ( dT) -18 primer. To human immunoglobulin H chain and L chain variable region of degenerate primers, cDNA first strand as a template, were amplified H chain and L chain variable region genes. SOE-PCR method to VH and VL fragments were assembled into ScFv fragments and then cloned into pCANTAB5E ScFv vector and transformed into competent TG 1 electric bacteria by helper phage rescue M13K07 get Mycobacterium Smegmatis single chain antibody phage display library. Results: A primary library of 3.5 X 106 and a second library of 2.6 x 106 were constructed. Conclusion: The results lay a solid foundation for preparation of human engineeringantibody to Mycobacterium Smegmatis reported herein with higher affinity.【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2011(034)005【总页数】5页(P70-74)【关键词】结核杆菌;人源噬菌体单链抗体;制备及筛选【作者】何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;王乾宇;黄高;安传伟【作者单位】贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;遵义医学院附属医院,中国遵义563003;贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;遵义医学院附属医院,中国遵义563003;贵阳中医学院,中国贵阳550002【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1结核分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)是引起结核病的病原菌，也称结核杆菌.可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见.目前全球约有20亿肺结核带菌者，现症结核患者2 000万，每年有1 000万人新发病和300万人死亡.我国结核患者人数居世界第二位，全国1/3的人口曾受到结核菌的感染［1］.噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，各种小分子抗体相继产生，在疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗等多个领域有着潜在的优势.该技术具有简单易行、生产成本低、筛选容量大等优点［2］.本研究尝试利用噬菌体展示技术构建大容量天然人源性噬菌体抗体库，从中筛选出结核杆菌的人源性单链抗体(single chain Fv fragment，scFv)，为进一步研制抗结核杆菌的特异性的基因工程抗体奠定了基础.100 mL外周血来自10例康复1月的结核患者(遵义医学院附属医院检验科提供)，淋巴细胞分离液，购自上海华精生物高科技有限公司.总RNA抽提试剂盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)、逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，GIBCOBRL 公司产品;DNA Purification System，Promega，公司产品;100 bp DNA Ladder，SfiⅠ和NotⅠ限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶，购自大连宝生物公司;噬菌粒载体pCANTAB-5E、辅助噬菌体M13K07、大肠杆菌E.coli TG1、HRP/抗M13单克隆抗体，Amersham公司产品;结核杆菌抗原(批号:984010)，购自上海晶莹生物制品公司. 2.1 人源抗体VH和VL基因的PCR扩增以合成的cDNA为模板，VHf和VHr引物等物质的量混合扩增VH基因，Vκf/Vκr和Vλf/Vλr不同引物等物质的量混合液扩增VL基因.VL的PCR反应条件为:95℃预变性10 min;94℃ 60 s，66℃ 30 s，72℃30 s，共30个循环;最后72℃延伸10 min.VH的退火温度为65℃，其他反应条件同VL.PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收目的基因片段.2.2 ScFv基因的构建通过重叠延伸拼接法将VH和VL基因拼接成ScFv基因.取纯化的VH和VL基因片段经94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，10个循环后，加含有酶切位点的引物VHf(SfiⅠ)和VLr(NotⅠ)，94℃ 30 s，66℃45 s，72℃ 90 s，35个循环.PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收.2.3 噬菌体抗体库的构建将上述PCR产物ScFv纯化回收，用SfiⅠ和NotⅠ进行酶切，与经同样双酶切的表达载体pCANTAB5E用T4 DNA连接酶，电转化大肠杆菌TG1，铺SOBAG平板.用2×YTAG培养基洗脱菌落，稀释至A600=0.5，加入辅助噬菌体M13K07继续振摇1 h，离心后用2×YTAK培养基重悬后振摇过夜，次日离心收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，冰浴，离心，重悬沉淀即为噬菌体ScFv库，过滤后于4℃储存备用.2.4 抗体库的重组率测定、酶切鉴定和多样性分析取适量抗体库接种在20 mL 2×YT-ATK(含10 g/L Glucose，100 mg/L Amp及20 mg/L Tet)培养基中，37℃，振摇培养至A600=0.68，加入辅助噬菌体M13K07于37℃静置60 min;4℃，3 500×g离心15 min，沉淀重悬于20 mL2×YT-ATK(含100 mg/L Amp，20 mg/L Tet，70 mg/L Kan)中培养过夜;在4℃条件下，8 000×g离心15 min，上清用40 g/L PEG-8000和30 g/L NaCl沉淀，4℃，10 000×g离心30 min弃上清，离心管倒置除去PEG液;沉淀用适量的PBS 重悬，移入另一离心管，反复吹打混匀，10 000×g离心5 min，上清即为噬菌体抗体库，检测库容.用SB培养液将所制备的噬菌体抗体库进行10倍系列稀释，分别加入100 μL大肠杆菌TG1(A600=1)，室温下感染20 min，涂SOBAG平板(含100 mg/L Amp)，于37℃过夜培养，次日计数噬菌落形成个数，计算噬菌体抗体库的库容，4℃保存.从SOBAG平板上随机挑取15个单菌落，进行PCR扩增用琼脂糖凝胶电泳检测ScFv的重组情况;提取PCR鉴定为阳性单菌落的质粒，用SfiⅠ和NotⅠ进行双酶切，采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱;随机挑取阳性克隆，采用PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后，用BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱.2.5 噬菌体抗体库的筛选用包被液稀释结核杆菌抗原1 μg/mL包被96孔ELISA板，100 μL/孔，含30g/L BSA的PBS封闭，PBS洗涤后，加入噬菌体抗体库100 μL，37℃温育2 h;吸去噬菌体抗体液，以PBST洗涤1次(第2轮洗涤5次，第3～5轮洗涤10次)，PBST洗涤1次，加入100 μL洗脱液［含0.1 mol/L HCl(pH2)和1 g/L BSA］，于室温静置10 min;将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6 μL 2 mol/L Tris中和，加入2 mL大肠杆菌E.coli TG1，37℃静置20 min，加入20 mL SB(含氨苄西林和四环素)，37℃培养2 h;加入M13K07、卡那霉素.进行5次反复淘洗，收集沉淀.特异性噬菌体抗体得到高度富集.2.6 ScFv的特异性鉴定将第5轮筛选后洗脱的噬菌体感染大肠杆菌TG1，涂于SOBAG平板，过夜培养后，随机挑选细菌菌落接种于4 mL含Amp和四环素的SOBAG培养基中，37℃振荡培养过夜;取200 μL，加至4 mL含相同抗生素的SOBAG中，37℃振荡培养2 h后加入40 μL M13K07，培养2 h;再加入Kan至70 mg/L，30℃振荡培养12～16 h离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，4℃保存.将待检噬菌体抗体与等量10 g/L BSA混合，室温孵育20 min，加至经抗结核抗原包被和BSA封闭的ELISA板中，于37℃温育2 h，用PBST洗板4次，PBS洗涤2次后，以HRP标记的M13噬菌体单克隆抗体进行结合反应，TMB显色.3.1 抗体重链和轻链可变区基因的PCR扩增以提取出的RNA为模板逆转录合成cDNA第一链后，再以cDNA为模板进行PCR反应分别扩增抗体基因重链和轻链可变区.产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，分别在300～400 bp间出现条带，结果见图1.3.2 单链抗体可变区片段(ScFv)的组装和全长扩增采用SOE-PCR的方法将抗体轻、重链可变区基因组装成ScFv片段，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳证实，组装后的ScFv基因在700～800 bp间出现条带 (图2).3.3 抗体库的库容、重组率测定及酶切鉴定构建的初级抗体库经(库容=涂板后生长出的噬菌斑数数目/涂板菌液量/涂板菌液稀释的倍数)计算，初级库容量为3.5×106.随机挑取20个菌落，经PCR鉴定表明，重组率为80%，故次级库的库容量为2.6×106;阳性质粒做双酶切鉴定，电泳示在700～800 bp间出现条带(图3).3.4 抗体库的多样性随机挑取的10个单克隆，经PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后，以BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析显示，抗体库中抗体分子的多样性良好，见图4.3.5 噬菌体抗体库的筛选将抗结核杆菌抗原噬菌体抗体库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选.可以看到随着洗涤次数的增加，噬菌体抗体的收获率增加，经过5轮筛选增加约110倍，表明噬菌体抗体库得到富集(见表1).3.6 噬菌体ScFv特异性的初步鉴定从第5轮筛选得到的菌落中随机挑选20个克隆，制备噬菌体抗体，经ELISA检测，阳性克隆孔中液体显色，阴性孔中液体不变色.显色后，阴性对照孔450 nm时A值为0.076，15株ELISA的A值较高，呈现阳性反应，其450 nm时A值分布于0.256～0.532之间，阳性克隆检出率约为75%.对其中12号阳性克隆的可变区DNA序列和氨基酸进行分析，结果该克隆重链可变区与GenBank中登录的免疫球蛋白IgG重链可变区VH3有92%同源性，κ可变区与V-J4有92%同源性.表明12号阳性克隆为抗结核杆菌抗原噬菌体抗体.噬菌体抗体库技术是采用PCR的方法将B细胞全套可变区基因克隆出来，与噬菌体包膜蛋白融合表达，从而展示于噬菌体表面，即可建成噬菌体抗体库.ScFv的基本结构为VH-Linker-VL或VL-Linker-VH，由于ScFv抗体分子量只有全抗体的1/6，抗体只有可变区片段，不含恒定区，免疫原性较低，故易于穿过血管壁和组织屏障，没有Fc段，所以减少了与组织的非特异性结合，同时保留了与抗原结合的特异性和亲和性，具有结构简单，易于大规模生产，成本低等优点，因此在临床、科研、工业和新药设计等领域均具有诱人的应用前景［4-6］.ScFv抗体在感染性疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗、新型药物设计等多个领域发挥着越来越重要的作用［7-13］.目前，在多种噬菌体抗体库的构建，并从其中筛选出多株具功能活性的小分子抗体，如抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbBZ和gpl20等单链抗体或Fab抗体［14-17］，有些已进入了临床I/II期试验.人源抗体的问世彻底解决了小分子抗体的人源化问题，极大地推动了人源抗体的研究及应用［18-20］.抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因由相对保守的骨架区和能够根据不同抗原做出相应变化的抗体互补决定区(CDR)组成，虽然抗体分子可变区有着数量巨大的多样性，但其骨架区的序列和前导序列相对保守，所以抗体可变区PCR引物的设计应可能考虑亲本抗体可变区序列的完整性和真实性.库容量大小影响抗体库质量的最主要因素，而基因的多样性是决定库容量大小，其直接决定了接下来筛选高亲和力的单链抗体［21］.因为淋巴细胞含目的抗体基因的mRNA是高丰度，有利于所建文库被筛选及克隆出高亲和力的抗体，所以选用淋巴细胞建库较好［3］.本研究扩增设计可变区引物时引用路艳等的工作［3］，通过提取患者康复后的外周淋巴细胞总RNA，经RT-PCR分别扩增出H链和L链可变区基因，将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体，并转化至感受态TG1菌，经辅助噬菌体M13K07拯救，获得人源抗结核杆菌噬菌体展示单链抗体库，本研究为结核病的预防、诊断、治疗等研究奠定了基础.此研究为结核临床防治研究奠定了基础.【相关文献】［1］吴虢东，王玲.抗结核中药的研究进展［J］.医学综述，2007，13(6):475-476.［2］李菁，林彤，宋帅，等.基因工程重组抗体技术的研究进展［J］.生物技术通报，2009(10):40-44.［3］路艳，韩跃武，韩亚萍，等.抗白念珠菌人源性单链抗体库的构建及筛选［J］.中国生物制品学杂志，2009，22(11):1063-1067.［4］HUSTON J S，LEVINSON D，MUDGET-HUNTER M，et al.Protein engineering of antibody binding sites:recovery of specificactivity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli［J］.Porc Natl Acad Sci USA，1988，85(16):5879-5883.［5］WHITLOW M，BELL B A，FENG S L，et al.An improved linker for single-chain Fv with reduced aggregation and enhanced proteolytic stability［J］.Protein Eng，1993，6(8):989-995.［6］BETTERr M，CHANG C P，ROBINSON R，et al.Escherichia coil secretion of an active chimeric antibody fragment［J］.Science，1988，240(4855):1041-1043.［7］WINTER G.Synthetic human antibodies and a strategy for protein engineering ［J］.FEBS Lett，1998，430:92-94.［8］SHAHEEN F，DUAN L，ZHU M，et al.Targeting human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase by intracellular expression of single-chain variable fragments to inhibit early stages of the viral life cycle ［J］.J Virol，1996，70(6):3392-3400.［9］ANN C，COLLIER M，ROBERT W，et al.Treatment of human immunodeficiency virus infection with saquinavir，zidovudine，and zalcitabine［J］.New Engl J Med，1996，334(16):1011-1077.［10］FINNERN R，BYE J M，DOLMAN K M，et al.Molecular characteristics of anti-self antibody fragments against neutrophil cytoplasmic antigens from human V gene phage display libraries［J］.Clin Exp Immunol，1995，102(3):566-574.［11］HUDSON P J.Recombinant antibody constructs in cancer therapy［J］.Curr Opin Immunol，1999，11(5):548-557.［12］WU A M，WILLIAMS L E，ZIERAN L，et al.Targeted gene delivery to mammalian cells by filamentous bacteriophage［J］.Tumor Targeting，1999，49(1):47-54.［13］FITZGERALD K，HOLLIGER P，WINTER G.Improved tumour targeting by disulphide stabilized diabodies expressed in pichia pastoris［J］.J Mol Biol，1999，288:203-211. ［14］ZEBEDEE S L，BARBAS C F，HOM Y L，et al.Human combinatorial antibody libraries to hepatitis B surface antigen［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89:3175-3179. ［15］CAI X，GAREN A.Anti-melanoma antibodies from melanoma patients immunized with genetically modified autologous tumor cells:selection of specific antibodies from single-chain Fv fusion phage libraries［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:6537-6541. ［16］HOOGENBOOM H R，BRUÏNE A P，HUFTON S E，et al.Antibody phage displaytechnology and its applications［J］.Immunotechnology，1998，4(1):1-20.［17］季永镛.免疫学进展学术讨论——抗体工程及其应用［J］.上海免疫学杂志，1997，17(2):126-129.［18］陈竞华，王淡，刘群英，等.人源噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选［J］.中华微生物和免疫学杂志，1995，15(3):155-162.［19］章美云，孔健.人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选［J］.生物化学与生物物理进展，1996，23(5):470-474.［20］TRISTAN J，VAUGHAN，JANE K，et al.Human antibodies by design［J］.Nat Bio Technol，1998(16):535.［21］田学军，寿成超，董志伟.人源噬菌体抗体库的构建及抗8YG抗体的初步筛选分析［J］.中国生物化学与分子生物学报，2000，16(2):200-205.。

抗体筛选技术
抗体筛选技术是一种用于寻找具有特定结合能力的抗体分子的方法。

这些技术可以用于从一个大的抗体库中鉴定出与目标分子高亲和力结合的抗体，并在药物研发、疾病诊断和治疗等领域发挥重要作用。

常用的抗体筛选技术包括：
1. 杂交瘤筛选：将免疫细胞与肿瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，然后通过筛选方法选择出具有特定结合能力的杂交瘤细胞。

2. 单细胞技术：利用单细胞分离和扩增方法，将单个B细胞
分离并扩增，然后进行筛选。

3. 羊抗人技术：将目标抗原注射给动物，然后提取动物的抗体，通过与人类抗体结合的方式筛选出具有特异性的抗体。

4. 购买与筛选：从商业抗体库中购买抗体，然后通过实验验证筛选出具有特定结合能力的抗体分子。

5. Phage display技术：利用噬菌体表面展示抗体库，通过与目
标分子结合筛选出具有高亲和力的抗体。

6. 重组抗体技术：通过基因工程技术构建出具有特定结合能力的重组抗体，然后进行筛选。

这些筛选技术的发展使得科学家能够更高效地寻找和筛选出具有特定结合能力的抗体分子，推动了抗体研究和应用的发展。

蛋白质工程在医药领域的应用蛋白质是生命活动的主要承担者，其结构和功能的多样性决定了它们在生物体内发挥着各种各样至关重要的作用。

随着科技的不断进步，蛋白质工程作为一门新兴的交叉学科，正逐渐展现出其在医药领域的巨大潜力和应用价值。

蛋白质工程是指通过对蛋白质的结构和功能进行有目的的设计、改造和优化，以获得具有特定性质和功能的新型蛋白质的技术。

在医药领域，蛋白质工程的应用主要集中在以下几个方面：一、药物研发1、新型药物靶点的发现传统的药物研发主要依赖于对已知药物靶点的筛选和优化。

然而，通过蛋白质工程技术，科学家们可以对蛋白质的结构和功能进行深入研究，发现新的药物靶点。

例如，利用蛋白质组学和结构生物学的方法，分析疾病相关蛋白质的结构和相互作用，从而找到潜在的药物作用位点。

2、药物设计与优化蛋白质工程在药物设计和优化方面发挥着重要作用。

通过对药物分子与靶蛋白的结合位点进行分析，运用计算机模拟和分子对接技术，可以设计出更具特异性和亲和力的药物分子。

同时，对现有药物进行蛋白质工程改造，如改变药物分子的结构、增加其稳定性、改善药代动力学性质等，能够提高药物的疗效和安全性。

3、抗体药物的研发抗体作为一种重要的蛋白质药物，在肿瘤、自身免疫性疾病等治疗中发挥着关键作用。

蛋白质工程技术可以用于优化抗体的亲和力、特异性、稳定性和免疫原性。

例如，通过噬菌体展示技术、酵母展示技术等，可以筛选出高亲和力的抗体；通过人源化改造，可以降低抗体的免疫原性，减少不良反应的发生。

二、疾病诊断1、诊断试剂的开发蛋白质工程可以用于开发更加灵敏、特异的诊断试剂。

例如，通过对疾病相关蛋白质的结构和功能进行研究，设计出能够特异性识别疾病标志物的蛋白质探针或抗体。

这些诊断试剂可以用于疾病的早期诊断、监测疾病的进展和评估治疗效果。

2、生物传感器的研制利用蛋白质工程技术构建生物传感器，能够实时、快速地检测生物体内的各种物质。

例如，将酶、抗体等蛋白质固定在传感器表面，当检测目标物质存在时，会引起传感器的信号变化，从而实现对目标物质的检测。

噬菌体展示技术在生物检测中的应用摘要：噬菌体展示技术（Phage display technology，PDT）是通过将外源基因与噬菌体基因组中编码外壳蛋白的基因融合，在噬菌体侵染宿主细胞后，能够将目的基因编码的多肽展示在噬菌体表面的技术。

噬菌体展示技术已被用于药物开发、肿瘤研究以及免疫学等领域。

本文主要介绍噬菌体展示技术的基本原理以及该技术在真菌毒素、农药等生物检测上的应用。

关键词：噬菌体展示技术；生物检测；真菌毒素；农药Phage Display Technology and Its Application in BiologicalDetectionGuan Pang Academic advisor: Yongheng LiangAbstract：Phage display technology is a technology which fuses exogenous gene and phage gene encoding phage coat protein，which can display the protein encoded by target gene on phage surface after infecting the host cell. Nowadays, phage display technology has been used in the fields of drug development, cancer research and immunology. This paper mainly introduces the basic principle of phage display technology and its application in mycotoxin and pesticide detection.Key words: Phage display technology；biological detection；mycotoxin；pesticide噬菌体展示技术是最早是由美国的Smith GP创建，首次将外源基因插入丝状菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽展示在噬菌体表面[1]。

噬菌体展示技术噬菌体展示技术是一种用来展示噬菌体和揭示其结构与功能的方法。

它可以帮助科学家们更好地了解噬菌体的特性，并为相关研究提供技术支持。

本文将详细介绍噬菌体展示技术的原理、应用以及未来的发展趋势。

噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，具有特异性感染宿主细菌的能力。

噬菌体展示技术利用噬菌体的这一特性，将外源蛋白质或多肽片段连接到其表面结构上，从而使噬菌体表面显示出被展示物。

这样，科研人员可以通过研究噬菌体表面展示的蛋白质或多肽片段的结构与功能，来了解其它生物分子如何与宿主细菌进行相互作用。

噬菌体展示技术的原理主要包括三个步骤：插入、表达和展示。

首先，需要将目标蛋白质或多肽片段的编码序列导入噬菌体基因组中，形成噬菌体展示质粒。

接下来，通过转染等方式将该质粒导入宿主细菌中，并在合适的培养条件下进行表达。

最后，噬菌体表面展示质粒编码的蛋白质或多肽片段，并形成可供研究的噬菌体展示复合体。

噬菌体展示技术具有广泛的应用领域。

一方面，它可以用于抗原表位鉴定，帮助寻找新的病原体相关抗原。

另一方面，噬菌体展示技术可用于蛋白质工程和抗体库筛选等研究中。

此外，噬菌体展示技术还可以用于药物开发，如靶向肿瘤治疗等方面。

它能够为科学家们提供有力的工具和方法，从而更好地进行相关研究。

尽管噬菌体展示技术在许多领域都表现出巨大的应用潜力，但它仍然面临一些挑战和限制。

首先，噬菌体展示的蛋白质或多肽片段需要能够与宿主细菌成功表达并显示在噬菌体表面，这对于一些大型复杂蛋白质来说可能存在困难。

其次，噬菌体展示的蛋白质或多肽片段需要具有良好的稳定性和可溶性，以保证其展示效果和研究可行性。

此外，噬菌体展示技术在开发过程中需要耗费大量的时间和资源，对于科研人员来说也是一项具有挑战性的工作。

未来，随着科学技术的不断发展和进步，噬菌体展示技术有望得到进一步改进和优化。

研究人员可以利用基因编辑技术、合成生物学和高通量筛选等方法，提高噬菌体展示的效率和可行性。

利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，虽然现在有很多治疗肿瘤的方法，但是很多方法仍然存在缺点，比如副作用大、难以选择性靶向肿瘤细胞等。

而目前，利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽已经成为一个新的研究方向，可以帮助我们更好地治疗肿瘤，减少副作用。

本文将从以下几个方面进行讨论：一、噬菌体展示技术的原理噬菌体是一种寄生在细菌体内的病毒，其基因组较小，只有几千个碱基对。

噬菌体展示技术指的是将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面融合，然后通过筛选找到与目标靶点高度亲和力的新型肽或蛋白质，并利用筛选的结果进行药物研发。

二、利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽的优点由于肿瘤细胞表面的分子与正常细胞不同，靶向癌细胞表面的新型肽研究成为了治疗肿瘤的一个重要方向。

利用噬菌体展示技术可以快速筛选出与癌细胞表面高度亲和的新型肽，这些新型肽可以被用于制备药物。

与传统的药物研发方法相比，噬菌体展示技术筛选出的肽具有选择性和特异性，能够减少对正常细胞的影响，从而降低治疗过程中的副作用。

三、噬菌体展示技术在靶向癌细胞表面菌素的研究中的应用通过噬菌体展示技术筛选到的肽可以被用来靶向癌细胞表面的多个分子靶点。

比如，一项研究利用噬菌体展示技术筛选出针对HER2靶向肽，将其与载药纳米粒子结合，可以明显提高抗肿瘤效果。

另一项研究发现一个靶向乳腺癌细胞表面的新型肽，可以用来诊断早期乳腺癌。

更有研究者通过噬菌体展示技术筛选出膀胱癌细胞表面的新型肽，并成功应用于临床，证明了噬菌体展示技术在肿瘤治疗中的应用前景。

四、总结随着研究的深入，噬菌体展示技术在肿瘤治疗中发挥越来越重要的作用。

利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽，不仅可以提高治疗效果，还可以降低副作用。

噬菌体展示技术在肿瘤治疗中的应用前景十分广阔，我们有理由相信，未来会有更多的新型肽在研究中发现，并成功应用于临床。

噬菌体展示技术的原理及其应用噬菌体展示技术（phage display technology）是一种重要的蛋白质工程技术，通过利用噬菌体颗粒表面显示多肽、蛋白质域或蛋白质片段，实现了蛋白质和肽段的大规模筛选与优化。

该技术以其广泛的应用领域和高效的功能改造成为生命科学研究的重要手段之一噬菌体是一种病毒，可以感染大肠杆菌等细菌。

噬菌体分为体外和体内表面展示两种形式。

体外展示通过将目标序列与噬菌体表面的一些外膜蛋白基因融合，使其在噬菌体的外膜上显示；体内展示则在噬菌体内部将目标序列与噬菌体结构蛋白基因融合，使其随着噬菌体结构蛋白的表达而自然显示在噬菌体表面。

噬菌体展示技术的原理是基于噬菌体的基因工程技术。

一般来说，噬菌体展示系统由基因插入、包装和扩增等部分构成。

在基因插入部分，需要构建融合蛋白质或多肽序列与噬菌体的表面或结构蛋白融合。

然后，该融合基因由质粒转化到细菌中，在细菌体内表达形成融合蛋白质或多肽与噬菌体结构蛋白的复合物。

该複合物装配成完整的噬菌体骨架，并在细菌体内繁殖增殖。

使用适当的分离方法，如蓝白斑筛选、免疫选择等，可获取目标蛋白质或多肽。

1.抗体工程：通过噬菌体展示技术，可以筛选出具有高亲和力和特异性的抗体。

通过适当的选择、改造和优化，可以用于疾病的诊断和治疗，以及靶向药物的研发。

2.药物筛选：噬菌体展示技术可以快速筛选出与特定靶标相互作用的多肽、蛋白质，用于药物筛选和发现。

通过融合目标肽段或蛋白质，可以在噬菌体库中筛选出具有特定活性的融合蛋白质，用于筛选新药物或开发新的药物靶标。

3.蛋白质结构与功能研究：噬菌体展示技术可以用于鉴定蛋白质的功能区域、反应底物和相互作用结构。

通过在噬菌体表面显示目标蛋白的不同片段或结构域，可以研究其功能和结构，并探究蛋白质间相互作用及其调控机制。

4.疫苗和诊断试剂开发：噬菌体展示技术可用于筛选出具有免疫原性的多肽、蛋白质，用于疫苗开发和诊断试剂的研制。

通过融合目标蛋白序列，可以获得具有特异性与免疫原性的融合蛋白质，从而用于预防一些疾病。