·论著·文章编号:1007-8738(2009)12-1146-03从噬菌体抗体库中筛选抗Cry1Ac 蛋白单链抗体王 耘1,2,刘 媛2,王 祥3,钱亚萍3,刘贤进23(1南京农业大学植保院,江苏南京210095;2江苏省农业科学院食品质量安全检测研究所,江苏南京210014;3扬州大学,江苏扬州225009)收稿日期:2009-02-19; 接受日期:2009-03-23基金项目:国家自然科学基金资助项目(30871658);国家高技术研究发展计划(863)资助项目(2006AA06Z411)作者简介:王 耘(1985-),女,江苏南京人,硕士生Tel:025*********;E 2mail:yuebaiheapp le@sina .com3Corres ponding author,E 2mail:jaasliu@jaas .ac .cnScreen i n g of an ti 2Cry1Ac scFv fro m Aphage d ispl ay an ti body li braryWAN G Yun1,2,L IU Yuan 2,WAN G X iang 3,Q IAN Ya 2ping 3,L IU X ian 2jin231College of Plant Pr otecti on,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095;2I nstitute of Food Quality Safety and Detecti on,J iangsu Acade my of Agricultural Sciences,Nanjing 210014;3Yangzhou University,Yangzhou 225009,China[Abstract] A I M :To c l o ne hum a n an ti 2C ry1Ac si ng l e 2cha i n an ti bo d i e s (scFv )fr om Tom li n so n J p hage an ti bo dy li b ra ry .M ETHOD S:A hum a n l a rge p ha ge a n ti bo dy li b ra ry w a s p anned fo r fo u r r o und s o f “adhe si o n 2e l u ti o n 2am p li fi ca 2ti o n ”.The sp e c i fi c ity o f the an ti gen b i nd i ng ac ti vity o f the se l ec te d c l o ne s w a s i den ti fi e d by EL I SA a nd the va ri ab l e gene s w e re ana l yze d and i den ti fi e d.RESUL TS:Afte r the p ann i ng,2po s iti ve c l o ne s w e re o b ta i ned,w h i ch co u l d b i nd C ry1Ac sp e c i fi ca ll y .DNA se quence a na l ysis show ed tha t the y had d i ffe ren t a n ti bo dy V reg i o n e nco d i ng gene s .CO N 2CL US I O N:B y 2p a s si ng i m m un i za ti o n,the sp ec i fi c hum an a n ti 2C ry1Ac scFv a lso can be p rep a re d by u s i ng p ha ge a n ti 2bo dy li b ra ry .[Keywords]p ha ge an ti bo dy li b ra ry;C ry1Ac;s i ng l e 2cha i n a n ti bo d i e s[摘要] 目的:从Tom lins on J 噬菌体抗体库中筛选人源化抗Cry1Ac 蛋白单链抗体(scFv )并进行鉴定。
方法:以Cry1Ac 蛋白为抗原包被固相,经4轮“吸附2洗脱2扩增”过程后,挑取单克隆,用E L I S A 法测定特异性结合活性,并对其进行基因序列测定。
结果:经过4轮筛选,获得了2株能与Cry1Ac 蛋白特异性结合的阳性克隆。
结论:利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Cry1Ac 蛋白scFv,为Cry1Ac 毒素蛋白检测提供了条件。
[关键词]噬菌体抗体库;Cry1Ac 蛋白;单链抗体[中图分类号]Q78 [文献标识码]A 苏云金芽孢杆菌(B acillus thuringiensis ,B t )是一种革兰氏阳性(G +)细菌,它在形成芽孢的同时能产生伴孢晶体,又称杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal p r oteins,I CPs ),其对鳞翅目、双翅目和鞘翅目等昆虫有杀伤活性。
伴胞晶体进入昆虫的消化道后,释放出的原毒素在蛋白酶的水解作用下,转型为毒性多肽分子,其与昆虫肠道上皮纹缘细胞表面的特异受体相互作用,诱导细胞膜产生一些孔道,扰乱细胞的渗透平衡,引起细胞肿胀甚至裂解而导致昆虫死亡[1]。
对苏云金芽孢杆菌毒素进行E L I S A 检测首先需要制备纯度较高的抗原和特异性高的抗体[2]。
目前检测Cry1Ac 蛋白的试剂盒中使用的多是多克隆或单克隆抗体(mAb ),王保民等利用Cry1Ac mAb 检测了转BT 基因棉的毒蛋白[3],而采用噬菌体展示技术筛选重组抗体则没有报道。
噬菌体抗体库技术将噬菌体表面表达的抗体片段的基因型与表型联系在一起,把抗原分子的结合特性同噬菌体的可扩增性统一起来,成为一种高效的筛选体系。
它从根本上改变了传统的mAb 制备流程,抗体完全可以绕过免疫系统和免疫步骤在体外制备,并且可以在体外改良抗体的特异性和进行体外亲和力成熟[4]。
本研究旨在探究利用B t HD 2171提取的B tCry1Ac 蛋白制备scFv 的方法,为研制灵敏、快速的B t 晶体蛋白检测试剂盒开辟一条新的制备路线。
1 材料和方法1.1 材料 天然噬菌体抗体库(英国Geneservice 有限公司),氨苄霉素,卡那霉素(Sig ma 公司),牛肉膏,蛋白胨,酵母粉均为生兴公司产品,辣根过氧化物酶标记的抗M13(GEHealthcare ),辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A 蛋白(博士德),大肠杆菌TG1,HB2151由本实验室保存,酶标板,I PTG,酶标仪。
1.2 方法1.2.1 Cry1Ac 抗原的制备 37℃、12h 活化菌种;按1%量接种于牛肉膏蛋白胨培养基中,30℃、230r/m in,培养30～40h (观察晶体裂解情况决定具体时间);4℃、8000r/m in 离心10m in,去上清收集菌体后用1mol/L 预冷NaCl 洗1或2次,再用用预冷的灭菌水洗1或2次;沉淀加入裂解液,调节pH值至9.5～10,同时以每升裂解液中加入30mL巯基乙醇的比例,0℃、100r/m in离心4h,12000r/m in离心20m in,取上清,加入4mol/L pH4.5Na Ac2HAc缓冲液,4℃静止过夜。
离心12000r/m in离心15m in,用预冷的无菌水洗2遍,在冰浴中摇至完全溶解,-20℃保存。
用胰蛋白酶水解毒素蛋白晶体(蛋白和胰蛋白酶质量比为40∶1),得到活性片段。
1.2.2 辅助噬菌体(hel per phage)K M13的扩增 将200μL 扩增培养至A值为0.4的大肠杆菌TG1与经过一系列稀释的K M13在37℃温育30m in,倒入上层琼脂后铺于TYE平板上,过夜。
挑一个噬菌斑与新鲜培养的TG1(A值为0.4),37℃摇床培养2h。
加入到200mL的2×TY2K(50mg/L Kana my2 cin),30℃过夜培养。
将过夜的培养液10800g离心15m in, 400mL的上清加入100mL PEG/NaCl(200mL/L聚乙二醇6000,2.5mol/L NaCl)并放置于冰上1h。
10800g离心30m in,倒掉PEG/NaCl。
用8mL P BS悬浮沉淀并加入PEG/ NaCl,混匀后置于冰上20m in。
3300g离心30m in,去掉PEG/NaCl。
最后用5mL P BS于11600g离心悬浮沉淀,即为扩增后的K M13。
1.2.3 特异性噬菌体的筛选 将4mL,100mg/L Cry1Ac包被细胞培养瓶的底部4℃过夜。
20mL/L M P BS(1L P BS中加入20g脱脂奶粉)封闭后加入噬菌体抗体库溶液,室温孵育2h;用含5mL/L T ween220的P BS溶液洗掉未结合的重组噬菌体(第1轮洗10次,第2轮洗20次,第3、4轮均洗30次),与Cry1Ac有结合活性的重组噬菌体则以Tryp sin2P BS (50μL,10g/L Tryp sin溶于450μL P BS)洗脱。
再次感染处于对数生长期的TG1细胞,取10μL稀释一定的梯度测定被洗脱出来噬菌体侵染的细菌个数cfu。
剩余的用2×YT2AG培养,经K M13超感染,2×YT2AKG培养,次日离心回收上清,沉淀,得到重组噬菌体抗体次级库并测定其滴度pfu(具体步骤同辅助噬菌体的扩增)。
再重复这一“吸附2洗脱2感染扩增”过程3次,得到富含对Cry1Ac有亲和性的重组噬菌体抗体四级库,并对每一轮筛选均测定次级库滴度并计算:产出率=产出克隆数(cfu)/投入克隆数(pfu),作为特异性噬菌体抗体富集的指标。
1.2.4 噬菌体E L I S A方法鉴定阳性重组噬菌体 将第4轮富集的重组噬菌体感染E.coli TG1细胞,37℃培养1h后涂在含TYE2AG的固体培养基上培养过夜,随机挑选300个单菌落,分别接种于200μL2×YT2AG培养基中,37℃培养至A600=0.5～0.8时,加入25μL2×YT2AG2hel per phage (109),37℃摇床250r/m in培养1h,1800g离心10m in,倒掉上清,用2×YT2AK悬浮,30℃培养过夜,次日,离心取上清做免疫学鉴定,即Monocl onal phage E L I S A:各取100μL加入到包被人工抗原的E L I S A板中反应1h,1g/L BS A和30g/L 脱脂奶粉作为阴性对照。
