新城疫病毒(NDV)核酸检测试剂盒(RT-PCR 荧光探针法) 使用说明

RT-PCR 鉴别鸡新城疫病毒强弱毒株检测方法的建立摘要：本文探究了RT-PCR 技术在鸡新城疫强弱毒株检测中的应用。

通过优化RNA 抽提、逆转录反应和PCR 扩增条件，建立了一种有效的RT- PCR 检测方法，可快速鉴别新城疫病毒强弱毒株。

实验结果表明，该方法具有高灵敏度和特异性，能够在基因水平对新城疫病毒进行准确鉴别。

关键词：RT-PCR，新城疫病毒，强弱毒株，鉴别一、引言新城疫是一种由新城疫病毒引起的急性传染病，严重影响了家禽养殖业的发展。

目前，防治新城疫的有效措施之一是根据病毒的毒力进行分级，以便采取相应的控制措施。

因此，快速鉴别新城疫病毒强弱毒株对于精确防控新城疫具有重要作用。

传统的新城疫病毒鉴别方法主要是依靠细胞培养、血清学等技术。

但这些方法消耗时间长、操作繁琐，且存在滞后性和灵敏度低等不足之处。

最近几年，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR 技术具有快速、准确、高效、灵敏的特点，在新城疫病毒的检测鉴别中得到广泛应用。

本文旨在探究利用RT-PCR 技术建立新城疫病毒强弱毒株检测方法，以提高疾病的诊断速度和准确度，为家禽养殖业的健康发展提供保障。

二、材料与方法2.1材料（1）新城疫病毒强毒株和弱毒株；（2）RNA 纯化试剂盒、逆转录试剂盒、PCR 试剂盒；（3）双向引物（强毒株：F 5'-TGGCCCACAGCTTATCGCGC-3'，R5'-CGCGTAACCGCGACCCAACT-3'；弱毒株：F 5'- CGCCGAGCTCGTCCTTCAAG-3'，R 5'-CGACGGACCTCAGGGAACTG-3'）。

2.2方法2.2.1RNA 抽提首先，提取新城疫病毒强毒株和弱毒株的RNA。

在无菌条件下，采用RNA 纯化试剂盒提取病毒RNA，按照说明书进行操作。

2.2.2逆转录反应利用逆转录试剂盒对RNA 进行逆转录反应，合成cDNA 模板。

新冠检测试剂使用说明一、前言新冠病毒的爆发给全世界带来了巨大的影响，为了更好地控制疫情，各国纷纷推出新冠病毒检测试剂。

本文将详细介绍新冠检测试剂的使用说明。

二、新冠检测试剂分类1. 核酸检测试剂盒核酸检测试剂盒是目前最常用的一种新冠病毒检测试剂。

它通过提取患者呼吸道或血液中的核酸，利用PCR技术进行扩增和分析，以判断是否感染新冠病毒。

2. 抗体检测试剂盒抗体检测试剂盒是通过检测患者血液中特定抗体（IgM和IgG）水平来诊断是否感染新冠病毒。

该方法对于早期感染不敏感，但对于后期感染和康复期有很好的诊断价值。

三、核酸检测试剂盒使用说明1. 样本采集核酸检测需要采集患者喉拭子、口腔拭子、鼻拭子或血液样本。

采集前需要让患者咳嗽或深呼吸，以使样本更充分地包含病毒。

2. 样本处理样本采集后，需要将其放入试剂盒中进行处理。

处理方法可以根据不同的试剂盒而有所不同，但一般都需要将样本加入提取液中，并在高温下进行裂解和离心等步骤，以获得纯净的核酸提取物。

3. PCR扩增核酸提取物获得后，需要进行PCR扩增。

PCR扩增是通过引物和酶的作用，在恒温下对目标DNA序列进行多轮扩增，从而获得足够的DNA量进行检测。

4. 结果判断PCR扩增完成后，可以通过荧光信号或凝胶电泳等方式判断结果。

阳性结果表明患者感染了新冠病毒，阴性结果则表明患者未感染新冠病毒。

四、抗体检测试剂盒使用说明1. 样本采集抗体检测需要采集患者血液样本。

采集前需要让患者放松身体，并在透明管内收集2-3ml静脉血。

2. 样本处理样本采集后，需要将其放入试剂盒中进行处理。

处理方法可以根据不同的试剂盒而有所不同，但一般都需要将样本加入提取液中，并在高温下进行裂解和离心等步骤，以获得纯净的血清。

3. 试剂盒操作抗体检测试剂盒使用前需要仔细阅读说明书，并按照说明书操作。

一般来说，操作流程包括加样、洗涤、添加检测荧光素和读取结果等步骤。

4. 结果判断抗体检测结果分为IgM阳性、IgG阳性、IgM/IgG双阳性和阴性四种情况。

R T-P C R试剂盒说明书-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1RT-PCR试剂盒说明书公司：TIANGENOrder:0Toll-free:800-990-6057/400-810-6057TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD版本号：KR121221TIANScript RT KitTIANScript cDNA第一链合成试剂盒目录号：KR104储存条件：-20℃保存。

产品介绍：TIANScript RT Kit（cDNA第一链合成试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly (A)+ RNA合成第一链cDNA。

与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA 片段等。

产品特点：合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒中的TIANScript M-MLV具有高效的逆转录酶活性，对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，适合于各种PCR耐热聚合酶。

注意事项：1. 用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。

有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。

2. RNA样品要避免基因组DNA污染。

3. 避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。

4. 试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。

5. cDNA产物应置于-20℃保存。

操作步骤：1. 在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1-5 μg总RNA或50-500 ng mRNA；2 μl oligo (dT)15或2 μl Random或2 pmol基因特异引物；2 μl Super Pure dNTPs mM each);补RNase-Free ddH2O定容至μl。

新城疫病毒RT-PCR一步法的建立及应用耿岗【摘要】为建立一种快速的新城疫病毒病原检测方法,根据GenBank上登录的NDV F基因序列,利用生物学软件设计合成一对特异性引物,通过反应条件的优化,建立了检测NDV的RT-PCR一步法.该方法对传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病毒的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ngRNA.临床初步应用显示该检测方法特异性强、敏感性高,可以用于新城疫病毒的临床快速检测.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)012【总页数】4页(P141-144)【关键词】新城疫病毒;逆转录-聚合酶链反应;检测【作者】耿岗【作者单位】青海省海西州乌兰县畜牧兽医工作站,青海乌兰817100【正文语种】中文【中图分类】S852.65新城疫病毒属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）中的禽腮腺炎病毒属（Avulavirus），是一种不分节段的单链、负链RNA病毒［1-2］。

由NDV引起的新城疫（Newcastle disease，ND）是一种多病型的高度接触性、急性、烈性传染病，可感染火鸡、家禽以及野禽类，具有传播速度快、发病率高、病死率高等特征，已经在世界范围内引起了4次大流行，给全球养禽业带来了巨大的经济损失［3-8］。

该病也是困扰我国养禽业的重要疫病，几十年来一直是我国养禽业坚持预防免疫控制的主要传染病之一［9-11］。

该病的存在严重制约着我国养禽业的健康发展，同时对我国禽类产品的出口、食品安全以及人类健康都存在着潜在的危害［11］。

因此，加强NDV诊断技术的研究，对预防和控制本病以及人类健康都具有十分重要的现实意义。

NDV常规的病毒分离技术和免疫血清学检测方法存在操作复杂、费时费力、检测周期较长等缺点，不能满足快速、准确诊断的需要。

鉴于此，本研究建立了一种敏感、特异、准确、简单、快速的一步法RT-PCR方法，为ND的早期诊断、流行病学调查等提供一种有效的检测技术手段。

RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。

无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA 酶和基因组 DNA的污染。

使用天为时代公司的总RNA提取系统（如目录号 DP405和DP406），所获得的RNA的纯度高，基因组DNA污染少，用于RT-PCR系统可得到满意结果。

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。

对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

RT-PCR引物的选择随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。

适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。

主要用于单一模板的RT-PCR反应。

Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA。

（原核生物的RNA、真核生物的Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。

）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

基因特异性引物：与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。

天为时性引物代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性引物连用。

一、RT-PCR原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA 作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA 为模板，用VI 型胶原蛋白的α1 链的编码序列的特异性引物进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR 使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。

rtpcr操作流程RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测RNA的技术，常用于检测病毒、细菌等微生物的存在。

下面将介绍RT-PCR的操作流程。

首先，准备实验所需的试剂和设备，包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、热循环仪等。

确保所有试剂和设备都处于干净、无菌状态。

第二步是提取RNA样本。

将待检测的样本（如血液、组织等）加入RNA提取试剂盒中，按照试剂盒说明书的指导进行RNA提取。

提取后的RNA样本应该是纯净的，没有受到污染。

第三步是逆转录反应。

将提取得到的RNA样本加入逆转录试剂盒中，进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。

逆转录反应的条件和时间根据试剂盒的说明进行设置。

第四步是PCR扩增。

将逆转录反应得到的cDNA加入PCR试剂盒中，进行PCR扩增反应。

PCR扩增的条件包括温度、时间和引物浓度等，需要根据试剂盒的说明进行设置。

第五步是检测PCR产物。

将PCR扩增反应得到的产物进行凝胶电泳或实时荧光定量PCR检测，确定目标基因是否存在。

通过比对标准曲线或者与阳性对照样本进行比较，可以确定目标基因的表达水平。

最后，分析结果并进行数据处理。

根据PCR检测结果，可以判断样本中是否存在目标基因，以及其表达水平。

对数据进行统计分析，得出结论并撰写实验报告。

总的来说，RT-PCR操作流程包括RNA提取、逆转录、PCR扩增、检测PCR产物和数据处理等步骤。

正确操作每一步，严格控制实验条件，可以确保实验结果的准确性和可靠性。

RT-PCR技术在医学、生物学等领域有着广泛的应用，对于疾病的诊断和研究具有重要意义。

新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用王素春1，孙亚伟2，樊擎莹2，黄保续1，康京丽1，汪　洋2，刘华雷1，张云香3，王楷宬1（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛　266032；2. 河南科技大学动物科技学院，河南洛阳　471023；3. 临朐县职业教育中心学校，山东临朐　262605）摘　要：为满足新城疫病毒高通量快速检测的需要，针对新城疫病毒M基因序列，通过基因比对分析保守区域，经同源性分析后，设计合成多条引物和探针并对其筛选，建立了一种能够快速检测新城疫病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，并对该方法的特异性、灵敏性进行了评估。

结果显示，该方法检测耗时短、特异性好，检测下限达10-4 ng/μL。

利用该方法，对480份临床采集的各类家禽咽拭子样品进行检测，共检测出25份阳性，与常规RT-PCR检测方法结果一致，κ值为1（P＜0.001）。

结果表明，该方法快速、准确，可用于新城疫病毒的快速检测。

关键词：新城疫病毒；M基因；实时荧光RT-PCR；检测方法；建立与应用中图分类号：S852.65 文献标识码：B 文章编号：1005-944X（2020）01-0074-05DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2020.01.015Establishment and Application of Real-time RT-PCR Methodfor Detecting Newcastle Disease VirusWang Suchun1，Sun Yawei2，Fan Qingying2，Huang Baoxu1，Kang Jingli1，Wang Yang2，Liu Hualei1，Zhang Yunxiang3，Wang Kaicheng1（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong　266032，China；2. College of Animal Science and Technology，Henan University of Science and Technology，Luoyang，Henan　471023，China；3. Linqu V ocational School，Linqu，Shandong　262605，China）Abstract：In order to satisfy the need of high-throughput and rapid detection of Newcastle disease virus（NDV），the conserved domains were analyzed by gene comparison based on M gene sequence of the virus，and as per the results of homology analysis，several primers and probes were designed and screened，and a real-time RT-PCR method for NDV detection was established，then its specificity and sensitivity were evaluated. The results showed that the method was characterized by short detection period and good specificity，and its detection limit was 10-4 ng/μL. Using the established method，480 samples of throat swabs collected from various poultry were tested，and 25 samples were detected NDV-positive，which was consistent with the result by common RT-PCR，the κ value was 1（P＜0.001）.In conclusion，the established method was rapid and accurate，and it could be used to rapid detection of NDV.Key words：Newcastle disease virus；M gene；real-time RT-PCR；detection；establishment and application收稿日期：2019-09-10　修回日期：2019-09-17基金项目：国家科技基础性工作专项（SQ2012FY3260033）通信作者：王楷宬742020年第37卷第1期75新城疫（Newcastle disease ，ND ）是由副黏病毒科腮腺炎病毒属的禽副黏病毒I 型引起的高度接触性禽类烈性传染病，以呼吸道症状为主要特征，同时伴发神经症状、胃肠道病变和头部肿大。