LAMP技术研究进展及其在动物疫病检测中的应用

LAMP技术在家禽腹泻性疾病检测中的应用董雯雯①张世栋①王春玲①艾洪新①李新华①潘力①朱伟②*李峰①*（①山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室山东省农业科学院家禽研究所山东济南250023②山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室山东畜牧兽医职业学院山东潍坊）中图分类号：S858.3 文献标识码：B 文章编号：1007-1733(2019)12-0092-05快速检测致病微生物是控制疾病暴发的有效方法之一。

目前，测病原体的传统方法耗时且劳动强度大，并且通常很容易失去最佳控制疾病的机会。

因此，迫切需要一种快速检测疾病的方法。

环介导等温扩增(LAMP)是近年来新建立的核酸恒温快速扩增技术。

它具有高灵敏度，特异性，视觉检测和对仪器的低需求。

它具有节省时间和精力等诸多优点，在分子诊断领域具有很大的潜力。

目前，LAMP已被广泛用于检测各种动物病原微生物。

本文主要综述了LAMP技术在家禽腹泻病原微生物检测中的应用以及LAMP技术的改进和优化，为快速检测家禽肠道疾病提供了参考。

目前，荧光定量、间接免疫荧光等分子生物学技术在家禽病原检测中起着关键作用，但都需要昂贵的仪器设备及一定操作技能。

一旦出现疫情，基层养殖场及实验室很难实现对病原的快速检测[1]。

针对这一现象，Notomi等[2]于2000年研发出一种新的DNA扩增技术-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LA MP)。

该方法在各项指标上优于传统的分子生物学检测技术，且不需要昂贵的仪器设备、简便、快速、灵敏，仅需在引物及BstDNA聚合酶的催化下，等温水浴30~ 60min，即可实现靶基因109倍扩增[3]，检测成本较低，适合基层地区开展病原微生物的早期诊断和筛查。

目前LAMP的检测对象已经覆盖了核酸、蛋白质、细胞等，展现出非常广阔的应用前景。

1 LAMP技术原理（1）LAMP技术是在等温(60~65℃)条件下利用BstDNA聚合酶和靶基因4条特异性引物进行反应，最后实现基因的指数型扩增，具有高度灵敏性和特异性。

《新塔拉塞维奇立克次体和山羊无形体可视化LAMP检测方法的建立与应用》篇一一、引言随着分子生物学技术的飞速发展，新型的病原体的检测成为了科研与医疗领域的重点工作。

其中，立克次体和山羊无形体等病原体的快速、准确检测对预防疾病传播和及时治疗具有重要价值。

本文旨在介绍新建立的塔拉塞维奇立克次体和山羊无形体可视化LAMP（环介导等温扩增）检测方法的建立与应用。

二、新塔拉塞维奇立克次体和山羊无形体的概述塔拉塞维奇立克次体和山羊无形体均是重要的病原微生物，其感染能导致一系列的疾病。

对这两种病原体的准确、快速检测是防控疾病传播的重要环节。

然而，传统的检测方法如PCR、荧光定量PCR等虽然有其独特优势，但仍然存在着耗时长、操作复杂等缺点。

因此，发展一种新型、高效的检测方法具有重要的实践意义。

三、可视化LAMP检测方法的建立为了满足高效、准确、快速的检测需求，本研究团队成功建立了针对新塔拉塞维奇立克次体和山羊无形体的可视化LAMP检测方法。

该检测方法通过设计特异性的引物，在等温条件下，通过LAMP反应实现目的DNA的高效扩增。

同时，结合可视化的荧光探针技术，可以在不使用昂贵的荧光仪器的情况下实现实时、准确的扩增结果观察。

四、可视化LAMP检测方法的应用（一）在临床诊断中的应用本研究建立的可视化LAMP检测方法在临床诊断中得到了广泛应用。

通过该方法，医生可以在短时间内快速、准确地确定患者是否感染了塔拉塞维奇立克次体或山羊无形体，为临床治疗提供了有力的支持。

（二）在疫情监测中的应用此外，该方法也广泛应用于疫情的监测中。

通过定期的采样检测，可以及时发现并追踪感染源，有效控制疾病的传播。

在疫情爆发初期，该方法的快速检测能力对于防控工作具有重要的指导意义。

五、结论本文成功建立了针对新塔拉塞维奇立克次体和山羊无形体的可视化LAMP检测方法。

该方法具有快速、准确、操作简便等优点，能够满足临床诊断和疫情监测的需求。

通过该方法的应用，可以有效提高病原体的检测效率，为防控疾病的传播和及时治疗提供了有力的支持。

LAMP研究中的常见问题分析及解决方法杨卓【摘要】本文通过《小反刍兽疫病毒RT-LAMP快速检测和鉴别方法的建立》研究中的相关扩增曲线和试验结论,对LAMP研究中出现的几种问题进行了初步探讨,并提出解决方案.文章从气溶胶污染、非特异性扩增、扩增效率不高和扩增曲线常见问题分析等方面,分析其产生原因并总结了相关解决办法,从而为今后的LAMP技术研究和推广做出贡献.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2016(000)007【总页数】5页(P53-57)【关键词】LAMP技术;气溶胶污染;非特异性扩增;扩增效率不高;扩增曲线【作者】杨卓【作者单位】辽宁省大连市动物疫病预防控制中心,辽宁大连116037;辽宁省大连市畜牧总站,辽宁大连116037【正文语种】中文【中图分类】S852.65环介导恒温核酸扩增技术（l oop-m edi ated i sotherm al am pl i fi cati on of DN A，LAM P）是由N otom i等于2000年发明的一种恒温、快速、高特异性和操作简便的分子生物学检测技术。

其反应原理是：根据序列保守区域设计的一对外引物、一对内引物和一对环引物特异性识别靶序列上的六个独立区域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60 m i n内，大量合成目标DN A，同时伴随有副产物白色的焦磷酸镁沉淀产生[1]。

LAM P技术以其自身的优势，在国际上已成为了分子生物学检测技术的研究热点，也被应用于多种疾病的检测，例如小反刍兽疫病毒[2]、日本脑炎病毒[3]、口蹄疫病毒[4]、H 5N1禽流感病毒[5]和结核分枝杆菌[6]等。

对于LAM P反应的结果判定，目前有四种方式：眼观白色沉淀检测法（简称“目测法”）、荧光指示剂法、传统的琼脂糖凝胶电泳检测和浊度仪的实时浊度法。

前两种方法仅通过肉眼判定，误差较大，不适用于科学研究；第三种方法无法判定反应中是否出现污染、二聚体扩增等假阳性情况，从而得不到准确、高效的反应体系；而利用浊度仪，采用实时浊度法，能够使整个反应都在密闭条件下进行，从而最大程度地避免污染，并且能够实时监测反应过程中所产生的白色焦磷酸镁沉淀，并绘制成扩增曲线。

LAMP（环介导等温扩增）技术2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩增分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。

然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。

2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。

通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。

LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。

可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。

目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。

详见：/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=11. 优缺点介绍：LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。

LAMP技术在禽源病原菌快速检测中的应用
庄林林;唐梦君;俞燕;龚建森;戴有理;徐步;王成明;刘学贤
【期刊名称】《中国家禽》
【年(卷),期】2013(35)24
【摘要】环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技
术是一种新型恒温核酸扩增技术,在病原微生物的检测中具有特异性强、灵敏度高、设备简单、方便高效等优点。

目前该技术已被成功应用于各类病原微生物的检测。

本文综述了LAMP技术在几种主要禽源病原菌检测中的应用,并展望LAMP技术的应用前景。

【总页数】2页(P48-49)
【作者】庄林林;唐梦君;俞燕;龚建森;戴有理;徐步;王成明;刘学贤
【作者单位】扬州大学兽医学院;江苏省家禽科学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S852.612
【相关文献】
MP技术在动物源性食品安全检测中的应用
MP快速诊断技术及在基层
动物疫病检测中的应用前景3.环介导等温扩增技术(LAMP)在肉源性检测中的应用及前景展望4.新型吸管式药敏检测盒的应用及山东省禽源病原菌抗药性监测网络
的构建5.利用LAMP技术快速检测羊肉制品中的鼠源性成分
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犬细小病毒LAMP 检测方法的建立杨慧1，曲光刚2，赵元楷2，沈志强1,2*(1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600)摘要：为提高犬细小病毒(CPV)的检出率，降低检测成本，本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术，建立了一种新型敏感、特异、快速、简便、实用的检测CPV 的技术。

针对CPV VP2基因保守区设计6条引物，进行LAMP 扩增，对扩增反应进行优化，并检测其敏感性、特异性。

所建立的方法最佳反应时间为60min ，具有良好的特异性，与同属的其它病毒无交叉反应。

该方法对CPV 的最低检出量为9.3×10-5ng/μL ，其敏感性是PCR 的100倍。

结果表明，该方法特异性强、敏感性高，并且操作简便、检测成本低，检测时间短，在CPV 的综合防治和早期诊断方面具有很高的实用价值。

关键词：犬细小病毒；LAMP ；检测方法中图分类号：S852.659文献标识码：A文章编号：1008-0589(2010)07-0550-04Development of loop-mediated isothermal amplification methodfor detection of Canine parvovirusYANG Hui 1,QU Guang-gang 2,ZHAO Yuan-kai 2,SHEN Zhi-qiang 1,2*(1.Shandong LvDu Bio-sciences Technology Co.,Ltd,Binzhou 256600,China;2.Shandong Binzhou Animal Sciences and Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,China)Abstract:A loop-mediated isothermal amplification (LAMP)method for detection of canine parvovirus (CPV)was developed using a set of six primers designed according to the CPV VP2gene sequence.The LAMP method had an optimal reaction time of 60min with 9.3×10-5ng/μL minimal detection and was shown 100times more sensitive than PCR.This method was an effective and low-cost procedure with high specificity and sensitivity that requires no specialized equipment,and could be easily applied to the detection of CPV infection.Key words :canine parvovirus;Loop-mediated isothermal amplification;diagnosis method收稿日期：2009-08-14基金项目：山东省自主创新成果转化重大专项计划(2008ZHZx1A1103)作者简介：杨慧(1980-)，女，山东茌平人，硕士，主要从事动物疾病诊断学研究.*通信作者：E-mail ：bzshenzq@*Corresponding author中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第32卷第7期2010年7月Vol.32，No.7Jul.2010犬细小病毒病(Canine parvovirus disease)是由犬细小病毒(CPV)引起犬的一种急性传染病，以剧烈呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少以及心肌炎为主要特征，发病率高，传染性强，死亡率高[1]，各种年龄的犬均可感染，是对养犬业危害极大的疫病之一。

中国动物保健2021.08将LAMP 方法应用于《动物疫病防控》课程的教学改革探索刘向楠，刘助红，刘贤旭，田存锋，康艳梅，刘国乾，李桂珍（广东科贸职业学院广州510430）动物疫病防控》系动物医学和畜牧兽医专业的核心课程，该课程理论性较强，同时又有较高的实践能力要求；该课程的内容对于提高学生的专业水平大有裨益，对学生在以后的工作岗位实践中将发挥重要指导作用。

多年来，为了保持课程内容的与时俱进，实训内容经过多次更新；但近年来生物技术迅猛发展，部分内容已不能满足当前畜牧业发展的实际需要，例如在生产中使用的新技术、新方法未纳入到课程当中。

为持续改善该课程的教学效果，促进教学与生产实际进一步紧密结合，本教学团队首次将环介导等温扩增技术方法引入《动物疫病防控》实验教学课堂，学生充分掌握该技术，取得了良好的教学效果。

防控、检测新技术、环介导等温扩增技术《动物疫病防控》是一门综合应用性学科，具有较强的实践性和应用性。

实验教学是《动物疫病防控》教学过程中的一个重要的必须环节，通过基本方法和技能培训，培养学生理论联系实际、发现问题及解决问题的综合能力。

目前我国农业院校开设的《动物疫病防控》课程中在疫病实验室诊断方法部分普遍存在教学内容相对陈旧，实验内容落后等问题。

例如，经典的细菌培养或病毒分离方法耗时长，主要适用于科研型实验室；荧光定量PCR 等分子生物学检测方法近年来迅速发展和应用，但对仪器设备要求较高，在基层推广较为困难。

为了学生能更好地学习《动物疫病防控》课程，从业后满足就业岗位的实际需要，本教学团队将环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification ，LAMP ）技术添加到实训课程教学中，与学生共同探讨了该方法的技术优势及在临床应用的价值，得到了较好的效果。

LAMP 技术是一种新型核酸扩增技术，其原理是采用4或6条能够识别目的基因上的6个特异区域的引物，依赖与Bst DNA 聚合酶的强链置换活性，在65℃等温条件下30min 就能扩增出约109～1010拷贝的靶序列。

L A M P检测综述戴婷婷集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]环介导等温扩增技术的应用研究进展戴婷婷1，陆辰晨2，郑小波2（1南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏南京210037；2南京农业大学植物保护学院，江苏南京210095；）摘要：环介导等温扩增技术（Loop–mediated isothermal amplification，LAMP）采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件（60℃~65℃）下60 min左右进行核酸扩增，其扩增效率可达到109~1010个数量级，具有特异性强、灵敏度高、等温、操作简单和检测结果快速等优点，已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原物的检测中。

本文对LAMP技术原理及其在病原物检测中的应用做了简要综述。

关键词：环介导等温扩增技术；应用；检测；病原物中图分类号：文献标志码：文章编号：Application Research Progress Of Loop-Mediated IsothermalAmplificationDAI Ting-ting1; LU Chen-chen2; ZHENG Xiao-bo2(1Southern China Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry, College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037, China；2College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)Abstract：A new method of gene amplification called Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has been developed in recent years. LAMP assay possess characteristic of simpleness, fleetness and high specificity. The whole procedure is very simple and rapid which can be completed in less than 80 min under isothermal conditions employing a set of six specially designed primers of a target gene, by incubating all the reagents in a single tube. LAMP does not require a thermal cycler and can be performed simply with a heating block or water bath. Considering the advantags of rapid amplication, simple operation and easy detection, LAMP has potential applications for diagnosis as well as surveillance of infectious diseases in developing countries without requiring sophisticated equipment or skilled personnel. LAMP has been widely applied to the detection of such pathogens as virus，bacteria, parasite, fungi etc. This article summarized the principle of LAMP，and the application in detection of pathogenic microorganisms.KEY WORDS：Loop-mediated isothermal amplification; application; detection; pathogenic microorganisms核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段，核酸扩增技术主要包括常规PCR 为基础的变温扩增技术以及等温扩增技术两大类。