LAMP技术在病原微生物检测中的应用

原料乳中金黄色葡萄球菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用李晓霞;贾淼;金君华;张红星;刘慧;谢远红【摘要】The loop-mediated isothermal amplification(LAMP) method was established and applied in the rapid de-tection of Staphylococcus aureus in raw milk according to the conserved sequence of the heat-tolerant nuclease gene(nuc). The genomic DNA of S. aureus could be detected using the four primers designed and synthesized, and the detection limit was 110. 0 fg per 25. 0μl reaction system. The method was S. aureus specific, with the detection limit of 67 CFU/ml in raw milk. This study provided a basis for further application of LAMP method in the safety detection of S.aureus in food.%为了建立原料乳中金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)在保守区域设计特异性引物,建立LAMP检测方法,并用于原料乳中金黄色葡萄球菌的快速检测.结果表明,针对金黄色葡萄球菌的基因组DNA,使用设计合成的4条引物和建立的LAMP方法能够有效检测金黄色葡萄球菌DNA,每25.0μl反应体系的灵敏度为110.0 fg,并且此方法针对金黄色葡萄球菌具有良好的特异性.针对原料乳中金黄色葡萄球菌的污染,建立的LAMP检测方法的检测限为67 CFU/ml.本研究结果为进一步将LAMP方法应用于食品中金黄色葡萄球菌的安全检测奠定了基础.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2017(033)005【总页数】5页(P1171-1175)【关键词】环介导等温扩增(LAMP);金黄色葡萄球菌;耐热核酸酶基因(nuc);灵敏度;特异性【作者】李晓霞;贾淼;金君华;张红星;刘慧;谢远红【作者单位】北京农学院食品科学与工程学院,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室/食品质量与安全北京实验室,北京 102206;北京农学院食品科学与工程学院,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室/食品质量与安全北京实验室,北京 102206;北京农学院食品科学与工程学院,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室/食品质量与安全北京实验室,北京 102206;北京农学院食品科学与工程学院,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室/食品质量与安全北京实验室,北京 102206;北京农学院食品科学与工程学院,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室/食品质量与安全北京实验室,北京 102206;北京农学院食品科学与工程学院,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室/食品质量与安全北京实验室,北京102206【正文语种】中文【中图分类】TS207.4李晓霞，贾淼，金君华，等. 原料乳中金黄色葡萄球菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用[J].江苏农业学报，2017，33(5)：1171-1175.近年来，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒是食品卫生的主要问题之一[1]。

LAMP（环介导等温扩增）技术2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩增分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。

然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。

2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。

通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。

LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。

可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。

目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。

详见：/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=11. 优缺点介绍：LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。

LAMP技术研究进展及其在动物疫病检测中的应用LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）技术是一种能够在恒温下快速、高效地进行核酸扩增的方法。

它通过特殊的引物和酶，在简单的实验条件下可以在短时间内扩增大量目标DNA序列，并且具有高度的特异性和灵敏性。

LAMP技术最早由日本学者Notomi等人于2000年首次提出，自此以后，LAMP技术在许多领域得到了广泛的应用，尤其在动物疫病检测中。

1.快速诊断：LAMP技术可以在一个小时内进行核酸扩增反应，比传统的PCR方法要快得多。

这对于迅速确定疫病的诊断结果非常重要，可以提高动物疫病的早期预警和防控能力。

2.高度特异性：LAMP技术使用多个特异性引物，在同一个反应体系中进行扩增，可以显著提高对目标序列的特异性识别能力。

这对于区分不同疫病病原体或者同一病原体的不同亚型具有重要意义，可以帮助鉴定传染病源和病原菌的变异。

3.高灵敏性：LAMP技术不仅在快速扩增速度上具有优势，还在扩增效果上具有高灵敏性。

在初始目标DNA浓度低至10个分子时，LAMP技术仍能够进行有效扩增，这对于低浓度病原体的检测非常关键。

4.操作简便性：LAMP技术不需要复杂的设备和特殊的实验条件，只需要一个简单的恒温器就可以进行核酸扩增反应。

这极大地降低了操作门槛，使得不同实验室和场所都可以进行动物疫病的检测工作。

5.物价低廉：LAMP技术所需的试剂和设备成本相对较低，特别是与PCR技术相比较，更加经济实惠。

这对于资源有限的地区和农村地区的疫病监测和防控工作尤为适用。

目前，LAMP技术已经在许多动物疫病的检测中得到了应用。

比如，它被成功用于禽流感、猪瘟、传染性胸膜炎、家禽新城疫等重大疫病的快速检测。

通过该技术，可以快速而准确地检测出病原体的存在，为疫病的早期检测和防控提供了有力的手段。

总之，LAMP技术在动物疫病检测中具有广阔的应用前景。

随着该技术的不断进步和完善，相信将能够更好地满足动物疫病检测的需求，为动物疫病的防控提供更加可靠、快速和经济实惠的手段。

LAMP技术在微生物检测中的应用【摘要】本文以LAMP技术的优缺点为分析对象，并食源性致病徽生物和临床致病微生物检测行业的发展现状进行了阐述，结合实际情况，对LAMP技术在微生物检测中的应用进行了探讨。

【关键词】LAMP技术，微生物检测，应用一、前言LAMP技术是随着微生物检测技术发展而不断发展的，LAMP技术在微生物检测中的应用中越来越广泛。

经过几十年的迅速发展，目前LAMP技术已广泛应用于很多微生物检测当中，成为一门实用的技术。

二、LAMP技术的优缺点1、优点（一）、特异性强、灵敏度高4条引物可以严格识别靶核酸序列上的6个独立区域,反应过程不会受到反应混合物种非靶序列DNA的影响,保证了LAMP扩增的高度特异性。

在检测过程中可以根据是否扩增就能判断目标基因是否存在,可用于细菌或病毒的定性检测。

（二）、等温高效LAMP在等温条件下扩增,不会因温度改变而造成时间的损失,在1 h内可将靶序列扩增至109～1010倍。

而且受非靶序列的影响小,模板也不需要热变性。

（三）、整个扩增反应操作简便、快捷LAMP反应过程中会产生白色的焦磷酸镁沉淀,肉眼即可直接观察,是鉴定反应是否进行的最直接方法。

另外,LAMP扩增产物可以像PCR反应利用凝胶电泳结合成像系统进行鉴定,通过产生的不同梯型来区分特异性扩增和非特异性扩增。

（四）、实验装置简单,费用相对较低LAMP反应不需要进行模板的热变性、长时间的温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等,在操作过程中,仅需要普通的水浴锅或其他可以得到稳定热源的设备即可。

2、缺点（一）、LAMP技术对试验设计的要求较高需要设计的引物数目相对较多、结构复杂,需要考虑到靶序列的片段及茎环结构等因素。

在检测高度变异的病原体时,实验设计相对比较困难（二）、LAMP技术在一次反应中只能检测一个病原体LAMP技术的阳性反应并不只呈现单条带,而出现拖尾和一些低分子质量的带,一旦产生非特异性扩增,则不易鉴别。

LAMP在阪崎克罗诺杆菌检测中的研究进展王彦人1，焦敬波1，张钧森1，康青1，李萍1，杜欣军1*(1.省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津科技大学食品科学与工程学院，天津，300457)摘要：阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一类食源性致病菌，可引起新生儿脑膜炎、败血症等疾病。

环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）技术是一类新型的恒温核酸扩增技术，具有灵敏度高、耗时短、特异性强、对设备需求低等特点，可与多种检测方法结合应用于食源性致病微生物的检测。

本文旨在阐明LAMP的基本原理并归纳结合不同检测方法的LAMP技术在阪崎克罗诺杆菌快速检测中的研究进展。

关键词：阪崎克罗诺杆菌；环介导等温扩增；快速检测中图分类号：TS201.6Process of Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection inCronobacter sakazakiiWANG Yanren1，JIAO Jingbo1，ZHANG Junsen1，KANG Qing1，LI Ping1，DU Xinjun1*(1. State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, College of Food Science and Engineering, TianjinUniversity of Science and Technology, Tianjin 300457, China)Abastract:Cronobacter sakazakii is a kind of foodborne conditional pathogenic bacteria, which can cause neonatal meningitis, septicemia and other diseases. Loop-mediated isothermal amplification technique (LAMP) is a new type of isothermal nucleic acid amplification technique with high sensitivity, rapidity and low equipment requirements. It can be combined with a variety of detection methods for practical application and has been widely used in the detection of foodborne microorganisms. This paper aims to elucidate the phylogenetic taxonomy of C. sakazakii, the basic principles of LAMP, and to summarize the progress of LAMP technology combined with different detection methods in the detection of C. sakazakii.Keywords: Cronobacter sakazakii, loop-mediated isothermal amplification (LAMP), rapid detection阪崎克罗诺杆菌为克罗诺杆菌属（Cronobacter，主要种型如表1所示）中最为典型的一类食源性致病菌种，易感染全年龄段人群0，致死率高达40~80%0。

L A M P检测综述戴婷婷集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]环介导等温扩增技术的应用研究进展戴婷婷1，陆辰晨2，郑小波2（1南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏南京210037；2南京农业大学植物保护学院，江苏南京210095；）摘要：环介导等温扩增技术（Loop–mediated isothermal amplification，LAMP）采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件（60℃~65℃）下60 min左右进行核酸扩增，其扩增效率可达到109~1010个数量级，具有特异性强、灵敏度高、等温、操作简单和检测结果快速等优点，已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原物的检测中。

本文对LAMP技术原理及其在病原物检测中的应用做了简要综述。

关键词：环介导等温扩增技术；应用；检测；病原物中图分类号：文献标志码：文章编号：Application Research Progress Of Loop-Mediated IsothermalAmplificationDAI Ting-ting1; LU Chen-chen2; ZHENG Xiao-bo2(1Southern China Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry, College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037, China；2College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)Abstract：A new method of gene amplification called Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has been developed in recent years. LAMP assay possess characteristic of simpleness, fleetness and high specificity. The whole procedure is very simple and rapid which can be completed in less than 80 min under isothermal conditions employing a set of six specially designed primers of a target gene, by incubating all the reagents in a single tube. LAMP does not require a thermal cycler and can be performed simply with a heating block or water bath. Considering the advantags of rapid amplication, simple operation and easy detection, LAMP has potential applications for diagnosis as well as surveillance of infectious diseases in developing countries without requiring sophisticated equipment or skilled personnel. LAMP has been widely applied to the detection of such pathogens as virus，bacteria, parasite, fungi etc. This article summarized the principle of LAMP，and the application in detection of pathogenic microorganisms.KEY WORDS：Loop-mediated isothermal amplification; application; detection; pathogenic microorganisms核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段，核酸扩增技术主要包括常规PCR 为基础的变温扩增技术以及等温扩增技术两大类。

3随着经济的迅速发展，人们对各类食品的需求也日益增大，食品安全问题越来越受到人们的重视，微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。

然而，使用传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生长法及血清学鉴定虽然比较准确，但繁琐费时。

此外，低水平的病原菌污染，食品加工后导致菌体的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素，使得传统的检测方法受到了一定的限制，因此，急需一些灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的食品安全检测技术和方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。

科技的进步使得新的检测方法层出不穷，如ATP 荧光检测法，酶联免疫吸附法(ELISA)，生物传感器技术，基因芯片技术，以及目前被广泛应用的基于PCR 的检测技术。

ELISA 由于免疫反应特异性强，对试剂的选择性高，致使很难同时分析多种成分；对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应；分析分子量很小的化合物和很不稳定的化合物有一定的困难[1]。

生物传感器技术以生物分子特异识别为基础，而非特异性信号干扰常使其检测底限和可信度受到影响。

目前多数生物传感器制作的相对不够均一，使设置对照检测的作用降低，且多数传感器检测对象只限于一种目标物[2]。

基因芯片技术检测的灵敏度较低需要昂贵的尖端仪器，技术上也存在一些问题[3]。

PCR 方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。

2000年，日本学者Notom i 等[4]发明了一种全新的核酸扩增方法—环介导等温扩增技术(LAMP ，loop-mediated isothermal amplification)。

该法在等温条件下(6～65℃)就能完成扩增反应，它可以在以内在恒LAMP 技术在微生物检测中的应用李志强(西华大学生物工程学院，四川成都，610039)摘要LAMP (1oop-m ediated isothermal amplifica tion)技术是一种新的恒温核酸扩增技术，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。