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斑点免疫层析试验（dotimmunochromatographicassay，DICA）简称免疫层析试验（ICA），也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般。
（二）试剂和操作
免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例。
试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条，试剂条上端（A）和下端（B）分别粘贴吸水材料，免疫金复合物干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤维素膜条。
硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异抗体，参照区（R）包被有抗小鼠IgG。
测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。
若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条（T）。
过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。
反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
斑点免疫层析试验在试剂形式和操作步骤上较前述的几种免疫测定法都更为简化，只用一个试剂，只有一步操作。
斑点金免疫层析试验实验报告
实验目的:
1.了解斑点金技术的原理、方法和应用;
2.掌握斑点金免疫层析试验的实验步骤;
3.运用斑点金免疫层析试验技术检测目标物在样品中的存在。
实验步骤:
1.制备斑点金试剂盒：打开斑点金试剂盒，按照说明书中的步骤依次添加开封后的试剂，将其混合均匀。
2.制备样品：将需要检测的样品提取出来，如血清、尿等，在无菌条件下进行处理，得到干燥的样品。
3.样品制备：将制备好的样品与预处理好的探针混合均匀
4.加样：将处理好的样品滴加到斑点金试剂盒的样品口上。
5.等待反应：加完样品后，静置一段时间，待反应进行到一定程度后，可以开始观察。
6.结果判断：在结果显示窗口中，观察金颜色深浅和是否出现斑点，以判断目标物是否存在于样品中。
实验结果:
本次实验成功地检测出了目标物在样品中的存在。
在斑点金试剂盒的观察窗口中，出现了明显的金色反应，同时还出现了斑点，说明我们所测定的目标物在样品中的含量较高。
实验结论:
斑点金免疫层析试验是一种快速且准确的检测方法，可用于检测多种物质在生物样品中的存在。
该方法在医学、生化检测、环境污染等领域有广泛应用，具有很大的潜力和前景。
金免疫测定技术是指用胶体金颗粒作为标记物进行抗原抗体反应的一类免疫学测定技术，其主要技术类型有斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验。
1）斑点金免疫渗滤试验：在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上，故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的，阳性反应在膜上呈现红色斑点。
2）斑点金免疫层析试验：是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相合的以硝酸纤维素膜为载体的固相膜免疫分析技术，滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判读实验结果。
斑点免疫层析试验报告
一、实验目的
通过斑点免疫层析试验检测特定抗体的存在，判断样本中是否含有目标抗体。
二、实验原理
斑点免疫层析试验利用抗原与抗体的特异性结合性质，检测样本中是否存在与特定抗原结合的抗体。
在试验过程中，将包含目标抗原的蛋白质在膜上固定，待其干燥后滴加待检测样本，目标抗体与蛋白质结合，再加入掺杂有染色剂的检测抗体，与样本中的抗体结合后呈色，通过颜色变化来判断样本中是否含有目标抗体。
三、实验步骤
1.将含有目标抗原的蛋白质涂在膜上，在室温下静置1小时。
2.将膜表面上的蛋白质冲洗干净，并加入待检测样本。
3.样本和蛋白质在室温下结合30分钟。
4.将掺杂染色剂的检测抗体加入，与样本中含有目标抗体的检测位点结合。
5.再次冲洗样品，待染色剂充分浸染30分钟。
6.观察染料颜色的变化。
四、实验结果及分析
将待检测样品加入检测后，测定斑点颜色变化。
颜色变化为深棕色代表样品中含有目标抗体，未检测到颜色变化则代表样品中不含目标抗体。
五、实验结论
根据斑点颜色变化判断出待检测样品中存在/不存在目标抗体。
六、实验注意事项
1.斑点免疫层析试验产生的颜色变化取决于样品中的目标抗体
浓度。
如果样品中目标抗体浓度较低，则可能无法检测到颜色变化。
2.在试验过程中，一定要注意卫生和消毒，避免出现污染。
3.试剂的储存和使用必须遵从说明书的规定。
4.使用试剂前进行试剂准备，检查是否过期或损坏。
5.在试验过程中，必须严格按照实验步骤进行，避免试验失败。
金免疫技术（斑点免疫层析试验）
一、原理
金免疫技术是免疫标记技术之一，金盐被还原成原子金后形成金颗粒悬浮（胶体金），这种金颗粒呈红色，并能与蛋白质等大分子物质结合，因此，可用胶体金作为标记物来检测标本中的抗原或抗体。
典型的测定方法有斑点买免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等。
二、材料
1 、HCG金标试纸条
2、妊娠尿液正常尿液
三、方法
（一）胶体金的制备
根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。
常用来制备胶体金颗粒的方法如下。
1．枸橼酸三钠还原法
（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。
（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。
冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。
（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HA uCl4水溶液100ml，加热煮沸。
根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。
这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。
（二）胶体金标记蛋白的制备
胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1．待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 Na Cl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1 h，去除聚合物。
2．待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。
标记IgG时，调至9.0，由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
3．胶体金与蛋白质（IgG）的结合将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/ L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10
min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。
常
用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。
加入
的量：5％BSA使溶液终浓度为1％；1％聚乙二醇加至总溶液的1／10。
4．胶体金标记蛋白的纯化
超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不
同选用不同的离心速度和离心时间。
用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶
粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。
然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结
合物，14 000g，4℃离心1h。
仔细吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB
液（含0.02％NaN3），将沉淀重悬为原体积的1／10，4℃保存。
如在
结合物内加50％甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一
步用10％～30％蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶
体金与蛋白的结合物。
5．胶体金蛋白结合物的质量鉴定
（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取
金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。
或用醋酸铀复染
后观察。
计算100个金颗粒的平均直径。
（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm
之间出现最大吸收值峰。
用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1％BSA，0.02％NaN3）将胶体金蛋白试剂作1�U20稀释，OD520＝0.25左右。
一般应用
液的OD520应为0.2～0.4。
（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色
法（MF－IGSSA）。
将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝
酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间
接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异
性和敏感性进行鉴定。
6、试验验证
将白色一端插入尿液中，尿液面不超过Max线，5秒钟后取出平放，3mi
n内观察结果。
四、结果
出现一条红线者为妊娠试验阴性，出现两条红线者为妊娠试验阳性，
如无红线出现，表明试纸条失效。
