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免疫标记技术及分析应用课件

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《标记免疫技术》课件

《标记免疫技术》课件
抗原或抗体的含量。
荧光物质具有高灵敏度、高特异性和可 定量检测等优点，使得荧光免疫技术成 为一种高灵敏度、高特异性的检测方法
。
荧光物质可以通过不同的激发光波长和 发射光波长进行选择，从而实现多组分
的同时检测。
荧光免疫技术的应用
荧光免疫技术在医学领域中广泛应用于感染性疾病、肿瘤标志物、激素、细胞因子 等的检测。
该技术的基本原理是利用酶标记的抗 体或抗原，与相应的抗原或抗体结合 ，形成酶-抗原-抗体的复合物。
酶联免疫技术的应用
酶联免疫技术广泛应用于医学、生物 学、化学等领域，如诊断试剂、药物 筛选、食品安全检测等。
在生物学领域，酶联免疫技术用于研 究生物分子相互作用、蛋白质表达和 细胞信号转导等方面。
在医学领域，酶联免疫技术被用于检 测各种传染病、肿瘤标志物、自身抗 体等，为疾病的早期诊断和治疗提供 了有力支持。
化学发光免疫技术的优缺点
优点
化学发光免疫技术具有高灵敏度 、高特异性和低检测限等优点， 能够实现快速、准确地定量分析 目标物质。
缺点
该技术的缺点是标记物的制备较 为复杂，且某些化学发光物质具 有一定的毒性，需要谨慎处理。
THANKS
感谢观看
REPORTING
环境监测
用于检测环境中的有害物 质、污染物等，评估环境 质量。
标记免疫技术的发展历程
19世纪末
免疫学基础理论建立，为标记免疫技术发 展奠定了基础。
21世纪初
随着生物技术的不断发展，新型标记免疫 技术不断涌现，如量子点标记免疫技术、 纳米材料标记免疫技术等。
20世纪初
放射免疫技术诞生，实现了对生物样本中 微量物质的定量分析。
20世纪90年代
荧光免疫技术和化学发光免疫技术得到广 泛应用，进一步提高了检测的灵敏度和自 动化程度。

第六章免疫标记技术ppt课件

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84
１ ．SPA通用系统
（1）SPA的发现 （2）颗粒SPA的应用 （3）SPA的标记和应用
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85
（1）SPA的发现
1940 年 Verwey 发 现 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 某 些菌株，可与人正常血清在双相免疫扩 散试验中出现沉淀线。
1958 年 Jensen 用 离 子 交 换 树 脂 分 析 证 明 ， 该成分是一种细菌胞壁上不含糖的蛋白 质，命名为金黄色葡萄球菌A蛋白 (Staphylococcal Protein A，SPA)
开创了生物活性物质微量测定 技术的新时代，是微量分析方法学 上的一个突破。
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5
放射免疫技术
优点：
① 特异性强，即抗原抗体的特异性反应；
② 灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g；
③ 操作流程简单易行，加样程序简单，测量和
数据处理自动化；
④ 样品用量少、一般无需复杂的提纯步骤；
(direct labeling)
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direct ELISA—for Ag
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67
direct ELISA—for Ab
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返回 68
（2）间接标记法
（indirect labeling）
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69
返回
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（3）夹心法 （sandwich assay）
⑤ 应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。
缺点：
需要昂贵的检测仪精选器课件；ppt 同位素污染。
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放射免疫技术的原理
是建立在标记抗原（或配体） 和待测抗原（或配体）对有限量的 特异性抗体（或受体）的竞争性抑 制反应基础上的，最终形成的放射 性标记复合物与被测配体（或抗原） 呈负相关，因而亦称竞争性放射免 疫技术。

《免疫标记技术》PPT课件_OK

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47
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• 如抗原纯度高，可直接包被固相。 • 如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用
捕获包被法。即先包被与固相抗原相应的抗体，再 加入抗原形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质， 然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
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• 捕获包被法：临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获 包被法。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体， 因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将 竞争结合固相抗原而使部份IgM抗体不能结合到固相 上。因此用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体。 此时必须先将标本用抗IgG抗体处理，以除去IgG干 扰。
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• 竞争法：是将特异性抗体吸附于固相载体表面，此 过程称为包被（coated），或叫致敏。经洗涤后分成 两组，一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；另 一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色， 这两组底物的降解量之差，即为所要测定的未知抗 原量。
30
竞争法
31
• 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。 因此，常用对小分子抗原如激素和药物类的测定。
– 应用酶标测定仪可作定量分析、敏感度可达ng水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。 这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长 时间。
22
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– 目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。 前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原，后者主要测 定可溶性抗原与抗体。
– 本法既无放射性污染又不需昂贵的测试仪器，且试剂 稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可定 性也可定量分析等，已广泛用于免疫学、微生物学、 寄生虫学、肿瘤学和细胞因子检测等领域。
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《免疫标记技术》课件

《免疫标记技术》课件

胶体金标记抗体和抗原的制备
胶体金颗粒的制备： 通过化学方法将金 离子还原为胶体金 颗粒
抗体或抗原的制备： 通过生物技术方法 制备特异性抗体或 抗原
标记反应：将胶体 金颗粒与抗体或抗 原进行标记反应， 形成胶体金标记抗 体或抗原
纯化：通过离心、 过滤等方法对胶体 金标记抗体或抗原 进行纯化，去除杂 质和未结合的胶体 金颗粒
确性
实验室安全与防护
实验室环境：保持清洁、通风 良好
实验操作：遵守操作规程，避 免交叉污染
防护设备：使用防护服、手套、 口罩等防护设备
废弃物处理：妥善处理废弃物， 避免环境污染
07
免疫标记技术的未来发 展
新技术的应用和展望
免疫标记技 术在疾病诊 断中的应用
免疫标记技 术在药物研 发中的应用
免疫标记技 术在食品安 全检测中的 应用
镜ห้องสมุดไป่ตู้察等。
04 免疫酶技术
酶标抗体和酶标抗原的制备
酶标抗体的制 备：通过免疫 反应，将酶与 抗体结合，形
成酶标抗体
酶标抗原的制 备：通过化学 方法，将酶与 抗原结合，形
成酶标抗原
酶标抗体和酶 标抗原的纯化： 通过色谱法、 电泳法等方法
进行纯化
酶标抗体和酶 标抗原的保存： 低温保存，避 免酶的活性降
交叉学科融合与创新
免疫标记技术与生物医学的融合：提高疾病诊断和治疗效果
免疫标记技术与纳米技术的融合：开发新型免疫标记材料和检测方法
免疫标记技术与人工智能的融合：实现自动化、智能化的免疫标记检测和 分析 免疫标记技术与大数据、云计算的融合：提高免疫标记数据的处理和分析 效率，为疾病预防和治疗提供更准确的信息支持。
荧光免疫标记应用： 细胞标记、蛋白质 标记、DNA标记 等

免疫标记技术课件

免疫标记技术课件
1. 它不需 ELISA 法中所要求的作用的底物和显色 剂，使操作更简便;
2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;
3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有 效期长; 4.灵敏度高，10-25IU/L。
免疫标记技术
Immunolabeling technique
免疫标记技术
用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）
进行抗原-抗体反应。 标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变 抗体或 抗原的免疫学特性，且极大的提高了反应的灵敏度，可以对 微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术 = 免疫技术+ 标记技术
常用底物： 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、 价高，故应用不如HRP普及。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性；
②酶促反应专一性，保证特异性；
③底物反应放大作用，提高敏感性； ④酶标试剂保存稳定；
⑤操作简便，安全易行。
常用方法: 酶联免疫吸附试验
一、双抗体夹心法检测HBsAg
实验材料
1.HBV诊断试剂盒； 2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。
HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb
乙肝表面抗原,存在于 HBV感染的急性期及慢 性期的血清中,为感染 指标。
HBeAg, HBeAb
HBcAb(IgG,IgM)
实验步骤
层析流方向
G：金标鼠抗人HCG单抗
T：鼠抗人HCG单抗
C：羊抗鼠IgG抗体 B：吸水纸
HCG金标试纸
滴加标本 复溶 固定
反应条带
质控条带
A
G 层析流方向

第六节 免疫标记技术

第六节 免疫标记技术

第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。

免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。

它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。

其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。

这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。

一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。

（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。

荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。

（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。

主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。

它们受到激发光(如紫外光)照射后，可发射荧光。

可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）。

其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。

FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。

抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。

当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。

（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。

免疫标记技术PPT参考幻灯片

免疫标记技术PPT参考幻灯片
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ELISA基本的实验过程
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【实验器材】
1、AFP诊断试剂盒 2、AFP阳性对照品，阴性对照品，待检品 3、微量加样器、温箱
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【操作步骤】
1. 将包被孔编号，分别加入阳性对照、待测样品及阴性对 照各50ul
2. 在各孔内加入酶结合物1滴，37℃温育30分钟 3. 甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液1滴，摇
hCG
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【实验原理】
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【操作步骤】
1.待测样品、检测试纸和其它检测材料等恢复到 室温后检测 2.将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中， 5秒钟后取出平放，5分钟内观察结果
注意：测试纸插入尿液深度不可超过MAX标志 线
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【实验结果】
阳 阴 无性效：
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思考题
1、免疫标记技术的特点是什么？ 2、在酶免疫标记技术中，最常用的酶是
医学免疫学实验四 免疫标记技术
Immunolabeling Technique
主讲：谢永生 病原生物学与免疫学教研室
1
简介
免疫标记技术(immunolabeling technique) 是指用荧光素、酶、放射性同位素等对抗 体或抗原进行标记，然后再通过检测标记 物来观察抗原抗体反应的实验技术。
优点：特异、敏度和快速； 可定性、定量和定位
4
放射免疫技术
◆ 放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、 精密度好的优点，常用于各种激素、微量 蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的 测定，但具有放射污染的缺点。
5
免疫酶技术
◆ 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高 效催化作用有机结合的一种方法。
◆ 常用的酶： – 辣根过氧化物酶(HRP) – 碱性磷酸酶(AP)

免疫标记的应用与评价资料ppt课件

免疫标记的应用与评价资料ppt课件

CD34+、CD38-细胞在形态上缺乏分化特点，是更 幼稚、能维持长期造血的启动细胞（LTC-IC）。 LTC-IC细胞以CD34+、CD45RO+、HLA-DR-为主， 多处于G0和G1期。CD34+、CD38+细胞则大多处于 造血祖细胞阶段，可形成各系造血集落，但不 能维持长期造血。故CD38抗原是造血干细胞向 多系定向分化的标志之一，并随一定的分化过 程表达上调。鉴于CD34抗原可以识别出造血干、 祖细胞，结合其它相关分化抗原的表达可以作 为造血细胞不同发育阶段的标志。如CD34+、 CD33+细胞群为多能干细胞向髓系定向的标志。 CD34+、CD19+多为多能干细胞向B系定向的祖细 胞。而CD34+、TdT+、CD10+、CD7+则被认为是 向T系定向的祖细胞。
CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B细
胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。对中国人
而言，CDl9是特异性和敏感性最高的。CD19是一
种早期的、谱系特异的泛B细胞表面抗原，从最
早期B细胞前体细胞阶段即表达，持续存在直至B
细胞终末阶段，分化为浆细胞时丢失。CD19存在
于90％外周血、脾脏、淋巴结或扁桃体中的B细
免疫标记的应用
干细胞的确定CD34/CD38/CD90 HPC/PBSC定量分析 1.移植治疗的日益普及 2.移植门槛的降低 3.干细胞采集的确定 4.有效干细胞的确定要求(CD34、CD90、
CD38等)
CD34+的分析：
未动员前外周血中CD34+细胞1～4%， CD34+/CD38-细胞1/2500，CD34+/CD38/CD90+细胞1/10000。

免疫标记技术及分析应用共104页文档

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免疫标记技术及分析用
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
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Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA
ELISA基本实验过程
包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到 固相载体表面，使抗原或抗体固相化
氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结
合成荧光抗体。
标记方法:
搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗
体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。
透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。
标记比较匀， 非特异染色较低。
常 用 的 荧 光 素
返 回
荧光抗体的纯化
去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过 滤 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子 交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或 固相抗原吸收
荧光检测仪
（1）荧光显微镜 （2）荧光分光光度计 （3）流式细胞仪 （4）荧光偏振光分析仪
荧光显微镜
利用一定波长的激 发光对样品进行激发， 产生一定波长的荧光， 对样品结构或其组分进 行定性、定位、定量观 察检测。
落射式
荧光显微镜的种类
透射式
荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
分色镜
汞灯
流式细胞仪
优点：可检测所有的抗原抗体系统， 具通用性；敏感性高。
缺点：操作流程长、干扰因素多、 非特异性荧光多，补体易失活、需 新鲜制备不方便。
第三节
Enzyme Immunoassay（EIA）
就是将抗原和抗体的特异性免 疫反应与酶的催化反应相结合 而建立的一种免疫检测技术。
抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光
荧光酶标仪
（1）直接荧光染色法
将荧光素标记在特异性抗体上，直接检 测抗原。 优点：简单、快速、特异性高。 缺点：敏感性差。
直接法
间接法
（2）间接荧光染色法
将荧光素标记在第二抗体（抗抗体） 上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特 异性抗体。
直接法
间接法
（3）补体荧光染色法
将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3 抗体），检测抗原抗体复合物。
速度、震板功能、温度控制、定性和定量 的软件，自动洗板、温育、加样
450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、 405nm
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免疫标记技术
放射物标记技术
酶标技术
免疫荧光技术
ELISA 酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
双位一点法
其他标记技术
金免疫技术 检测金颗粒沉淀
免疫标记技术
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提
高免疫学诊断的敏感性
放 125射I、性13同1I位素：酶：碱辣性根磷过酸氧酶化物酶、
荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄 绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹 明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA） 液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）
第二节
将抗体或抗原标记以荧光素，然 后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复 合物在一定波长光的激发下可产生荧光， 借助荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗 体。
当出现荧光时，表明标记抗体 存在，相应的抗原也存在。
抗体的荧光素标
FITC 异硫氰酸荧光素
记
标记原理：利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫
第七章 免疫标记技术及分析应用
第一节 免疫标记技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 免疫酶技术 第四节 放射免疫技术 第五节 免疫胶体金标记技术
第一节 免疫标记技术
用荧光素、放射性同位素、酶、发 光剂、胶体金或电子致密物质等作为示踪剂， 标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。
荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电 子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对 实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。
缺点：
标记反应较难掌握，在操作 过程中容易引起酶、抗原或抗体 的失活。
一、常用的酶及其底物
酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标
记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物
易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的 常影用响酶（用于均相测定的酶标底抗物原与抗体结合后
显色
辣酶根活过性氧出化现物抑酶 制或激邻苯活二）胺；、无H2害O2 ；稳定，价橙廉、 黄易色得。
三、酶标记物的纯化及鉴定 1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色
葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法
2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法
四、酶标仪（酶联免疫检测仪）
比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测
免疫标记技术
分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫
荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光 免疫测定。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位
免疫标记技术
反应类型
实验技术
结果判断
标记免疫反应 荧光免疫技术 检测荧光现象
放射免疫技术 检测放射性强度
酶免疫技术 检测酶底物显色 发光免疫技术 检测发光强度
光度计
特异、敏感 可以在µg、甚至ng水平 上对其进行定量。
将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结 合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于 固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下 催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜 色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正 比。
优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于 普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素 污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且 仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。
四甲基联苯胺、
H2O2
蓝色
碱性磷酸酶
对硝基苯磷酸酯
黄色
二、 标记方法 酶结合物
技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗 原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较 少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原 的聚合物。
戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶
改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟
基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2NH-IgG