第五章透射电子显微镜生物样品制备技术[可修改版ppt]

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《透射电子显微镜》课件

光阑
限制照明区域，减小成像的视场，提高成像的分辨率。
光路调节器
调节光路中的光束方向和大小，确保光束正确投射到样品上。
成像系统
Hale Waihona Puke 物镜将样品上的图像第一次放大并投影到中间镜上。
中间镜
将物镜放大的图像进一步放大并投影到投影镜上。
投影镜
将中间镜放大的图像最终放大并投影到荧光屏或成
像设备上。
真空系统
谢谢您的聆听
THANKS
透射电子显微镜技术不断改进，分辨率和放大倍数得到显著提高。
透射电子显微镜技术不断创新，出现了许多新型的透射电子显微镜，如高分辨透射电子显微镜、冷冻透射电子显微镜等。
透射电子显微镜的应用领域
生物学
观察细胞、蛋白质、核酸等生物大分子的结构和功能。
医学
研究病毒、细菌、癌症等疾病的发生、发展和治疗。
真空泵
01
通过抽气作用维持透射电子显微镜内部的高真空状态。
真空阀门
02
控制真空泵的工作时间和进气流量，以保持透射电子显微镜内
部真空度的稳定。
真空检测器
03
监测透射电子显微镜内部的真空度，当真空度不足时提醒操作
人员进行处理。
03
透射电子显微镜的操作与维护
透射电子显微镜的操作步骤
打开电源
确保实验室电源稳定，打开透射电子显微镜的电源开关。
记录
对透射电子显微镜的使用和维护情况进行记录，方便日后追踪和管理。
04
透射电子显微镜的样品制备技术
金属样品的制备技术
电解抛光
通过电解抛光液对金属样品进行抛光，去除表面杂质和氧化层，使样品表面光滑、平整。
离子减薄

透射电子显微镜的工作原理及标本制课件-文档资料

固定方法—戊二醛-锇酸双固定
双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。先用2.5%戊二醛固定2h以上。缓冲液多次清洗（pH7.4 0.2mol/L磷酸缓冲液洗三次，15min/ 次）。
1%锇酸固定2h。
3脱水
透射电镜的结构透射电镜主要由电子光学系统、真空系统和供电系统三部分组成。其中电子光学系统通常称为镜筒，是透射电子显微镜的核心，它又可以分为照明系统、成像系统和观察记录系统。
TEM
电子光学系统（镜筒）供电系统真空系统
照明部分
成像放大部分
显像部分
电子枪：TEM电子源
物镜、中间镜、投影镜
理想固定剂
1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化 2）稳定细胞成分和结构，以保证后续的各种处理中物质不溶解、不丢失 3）对细胞超微结构没有损伤，保证电镜图像的真实性 4）能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定 5）最好提供一定的反差 ,并有防腐作用
切片操作步骤：装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片
切片厚度的判断
颜色暗灰色铅灰色银灰或银白米黄、金黄紫色(蓝) 厚度(Å) <400Å 400~500 500~700 700~1000 1000以上切片厚度太薄较薄适中较厚不能用分辨率高高好低反差小小好好
常用固定剂
1）锇酸（OsO4)
优点： ⑴ 几乎和细胞内所有成分发生化学结合 ⑵ 对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良好 ⑶ 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物 ⑷ Z=76，增加膜的反差 ⑸ 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好锇酸缺点： ⑴ 不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差 ⑵ 酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究 ⑶ 分子量大,渗透能力差，要求组织块小 ⑷ 固定时间不宜过长 ⑸ 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积

透射电镜样品制备 PPT

(1)超声切片; (2)研磨; (3)挖坑; (4)离子减薄。
薄膜样品制备
薄膜样品制备
General Steps in TEM Spec、 Prep
1、
Disk Cutting
3、 Dimple Grinding
500 µm
Not to scale
<5 µm
2、 Disk Grinding
70-100 µm
用对电子束透明得薄膜(碳、塑料、氧化物薄膜)把材料表面或断口得形貌复制下来得一种间接样品制备方法。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
12
复型法
复型材料与支持膜材料相同。表面显微组织浮雕得复型膜,只能进行形貌
观察与研究,不能研究试样得成分分布与内部结构。
在材料研究中,复型法常用以下几种: (1) 塑料一级复型、(2) 碳一级复型 (3) 塑料-碳二级复型、(4)萃取复型
薄膜样品制备
1) 原理:将样品接正极、电解液接负极。电解液从两侧喷向样品,当样品穿孔后,自动停机,获得中间薄,边缘厚,呈面窝状得 TEM薄膜样品。
2) 影响因素:电解液、温度、电压、电流。
3) 特点:减薄条件易控制,操作方便, 重复性好,制样时间短,成功率较高, 但只能用于金属试样得制备。
复型法
2、2、4 薄膜样品制备
从大块试样上,通过各种特殊方法,制备出能使电子穿过得薄区。
薄膜样品制备方法要求:
(1)不引起材料组织得变化; (2)足够薄,否则将引起薄膜内不同层次图象得重迭,干扰分析; (3)薄膜应具有一定得强度,具有
较大面积得透明区域; (4)制备过程应易于控制,有一定得重复性, 可靠性。

透射电镜样本的制备PPT课件

第10页/共39页
清洗
• 组织在固定后，应用清洗液洗去残留的固定液 • 残留的醛可与锇酸反应产物细的电子致密的还原锇。 • 锇酸可与乙醇作用生成沉淀。 • 清洗液采用与固定液同系列的缓冲液。（磷酸缓冲液，二甲砷酸钠缓冲
液）
第11页/共39页
脱水
去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备
含水样品在电镜高真空状态下观察反差极低
与CO2接触会形成不溶性碳酸铅沉淀 10min左右
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半薄切片制作
• 可进行定位，克服超薄切片盲目性，提高电镜观察的效果。 • 修块时，将切片修得大一些，切成1μm的厚片，甲苯胺蓝染色观察。
第28页/共39页
超薄切片制样程序
• 取材：处死实验动物后半分钟到1分钟内，最多15分钟取出1mm3的组织块
2.495 0.62 1.885 0.085 2.57 0.31 2.12 0.085 2.425 0.925 1.65 0.085
4.99 9.98 14.97 19.96 24.95 1.24 2.48 3.72 4.96 6.2 3.77 7.54 11.31 15.08 18.85 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85 5.14 10.28 15.42 20.56 25.7 0.62 1.24 1.86 2.48 3.1 4.24 8.48 12.72 16.96 21.2 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85 4.85 9.7 14.55 19.4 24.25 1.85 3.7 5.55 7.4 9.25 3.3 6.6 9.9 13.2 16.5 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85
固化剂：控制软度固化剂：控制硬度加速剂
第17页/共39页

五章透射电子显微镜生物样品制备技术(共53张PPT)

从动、植物体上获得所需实验材料的过程叫取材。 1、取材的方法
动物和植物的取材方法稍有不同。动物组织的取材：取动物材料时需要先处死动物，然后要在尽短的时间内（要求在１分钟之内）把所需要的组织取出放入预冷（ 40C ）的固定液中，稍加
固定后再切成适当大小的块(要求１立方毫米大小）；
植物组织的取材：植物材料可直接切成适当大小的
2、固定的方法：有物理固定法和化学固定法。 1）、物理固定法：用高温、冷冻、干燥等物理手段，
使细胞结构固定，一般不用。
2）、化学固定法：用化学物质对细胞结构进行固定，是常用的方法。
第9页，共53页。
化学固定又可分为：
（1）、单一固定法。即对样品只用一种固定剂进行固定，这种方法只是在一些特殊要求的样品制备中使用（如电镜细胞化学样品制备时），常规制样一般不使用。
（2）、双重固定法。用两种或两种以上的性质不同的固定剂对同一种样品进行固定，这种方法是最常选用的。它可以相互彌补固定剂各自的不足，使细胞内的各种结构都得到充分的固定。
（3）、原位固定法。主要用于动物深层组织取材过程中使用的方法，可以防止细胞的自溶。
（4）、灌流固定法。也是在动物组织取材时选用的一种临时固
然干燥。保护样品使其组成物质在以后的清洗、脱水和包埋过程中不至溶解和丢失，并使组织适度硬化，防止切片的变形。
B、倒口包埋法：本方法适用于单细胞、单层培养细胞和单个微小动、植物体的包埋。
如果选择的包埋剂不合适，在固化后会出现空泡或硬度和组织的硬度有差别，这样就起不到很好的支撑作用，甚至会使切片失败。
磷酸二氢钠（含1个水分子）
27.60g
(含2个水分子）
加双蒸水至
31.21g 1000ml
不同PH的0.2M 的磷酸缓冲液的配制

透射电子显微镜TEM(PPT121页)

透射电子显微镜 (Transmission Electron Microscope, TEM)
TEM是以波长极短的电子束作为照明源，用电磁透镜聚焦成像的一种高分辨率、高放大倍数的电子光学仪器。可同时实现微观形貌观察、晶体结构分析和成分分析（配以能谱或波谱或能量损失谱）。
为什么采用电子束而不用自然光？
β=±25度
EM420透射电子显微镜
（日本电子）加速电压20KV、40KV、60KV、 80KV、100KV、120KV 晶格分辨率 2.04Å 点分辨率 3.4Å 最小电子束直径约2nm 倾转角度α=±60度
β=±30度
FEI Titan 80-300 kV S/TEM 世界上功能最强大的商用透射电子显微镜 (TEM)。已迅速成为全球顶级研究人员的首选 S/TEM，从而实现了 TEM 及 S/TEM 模式下的亚埃级分辨率研究及探索。
➢ 电子显微镜发展史
1898年J.J. Thomson发现电子 1924年de Broglie 提出物质粒子波动性假说和1927年实验的证实。 1926年轴对称磁场对电子束汇聚作用的提出。 1932年，1935年，透射电镜和扫描电镜相继出现，1936年，透射电
镜实现了工厂化生产。 20世纪50年代，英国剑桥大学卡文迪许实验室的Hirsch和Howie等人
主要技术参数： 1.TEM分辨率 <1 2.STEM分辨率 <1 3.能量分辨率 <0.15eV 或 <0.25eV 4.加速电压 80-300kV
内容
8.1 简介 8.2 结构原理 8.3 样品制备 8.4 透射电子显微镜的电子衍射 8.5 透射电子显微镜图像分析
8.2 透射电子显微镜结构原理
电磁透镜的分辨本领比光学玻璃透镜提高一千倍左右，可以达到2Å 的水平，使观察物质纳米级微观结构成为可能。

(完整版)第五章透射电子显微镜

半个多世纪以来电子显微学的奋斗目标主要是力求观察更微小的物体结构、更细小的实体、甚至单个原子，并获得有关试样的更多的信息，如表征非晶和微晶，成分分布，晶粒形状和尺寸，晶体的相、晶体的取向、晶界和晶体缺陷等特征，以便对材料的显微结构进行综合分析及表征研究。近来，电子显微镜(电子显微学)，包括扫描隧道显微镜、三维原子探针等，又有了长足的发展。 Characterization technology
结合样品台设计成高温台、低温台和拉伸台，透射电子显微镜还可以在加热状态、低温冷却状态和拉伸状态下观察样品动态的组织结构、成分的变化，使得透射电子显微镜的功能进一步的拓宽。
28
分析型透射电子显微镜
利用电子束与固体样品相互作用产生的物理信号开发的多种分析附件，大大拓展了透射电子显微镜的功能。由此产生了透射电子显微镜的一个分支——分析型透射电子显微镜。
3
5.2 透射电子显微镜
Transmission Electron microscope-TEM
CM200-FEG场发射枪电镜
加速电压20KV、40KV、 80KV、160KV、200KV 可连续设置加速电压热场发射枪晶格分辨率 1.4Å 点分辨率 2.4Å 最小电子束直径1nm 能量分辨率约1ev 倾转角度α=±20度
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计算机技术的应用
透射电子显微镜的发展还表现在计算机技术和微电子技术的应用。计算机技术和微电子技术的应用使透射电子显微镜的控制变得简单，自动化程度大大提高，整机性能提高。
在透射电子显微镜的观察与记录系统中增加摄像系统，使分析观察更加方便，而且能连续记录。近几年慢扫描CCD相机越来越多地取代传统的观察与记录系统，将透射电子信号（图象）传送到计算机显示器上，不仅方方便观察记录，而且与网络结合使远程观察记录成为可能。

透射电镜的样品制备技术ppt课件

38
切片带弯曲可能原因及解决办法
可能原因梯形或矩形组织面上下边不平行刀刃锋利程度不一组织面上边或下边与刀刃不平行
解决办法用双面刀片重新休整组织切面使之平行更换新玻璃刀重新调整组织与刀刃距离，使之平行
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支持膜的制作
支持膜是一种能支持观察样品的膜，厚度约20nm。性能良好的支持膜应具备： 1.较高的透明度 2.在电镜下无可见结构 3.与所支持的各种样品不发生化学反应
无皱折、刀痕、震颤等缺陷。 • 样品反差良好，无染色沉淀。 • 支持膜厚度适中，观察时不产生漂移和破裂。
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六.电子染色
• 利用重金属盐类选择性地与生物样品中不同结构成分相结合，来提高结构成分散射电子的能力，从而增加图像反差的染色，又称为
正染色。
• 常用的染色剂: –0.5％～１％醋酸双氧铀
• 可使核酸、蛋白质、结缔组织纤维的反差增强。
❖染色步骤
复膜载网－滴样品-滴染1-2min－用滤纸吸去染液－观察
❖优点
适用于悬浮液的样品（细菌、病毒、其他微生物、大分子、分离细胞器）
操作快速、简便样品用量少图像结构反差好
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51
小结：（超薄切片） 1.取材:要求部位准确,块小,时间短,低温,器械锋利, 减小机械损伤. 2.固定:戊二醛固定时间可以适当延长,一般不要超过一周,期间要更换一次固定液,且要保持低温固定,充分清洗后再进行锇酸固定1-2小时,时间一定不要太长. 3.脱水:锇酸固定后经过充分清洗,进行酒精梯度脱水, 一般50%,70%,80%,95%,无水酒精, 4.样品侵透,包埋.一定要保持干燥,侵透彻底. 5.聚合:由室温到高温梯度升温聚合.如35度,45度,60 度顺序. 6.超薄切片:切片机性能,片厚度,捞片,载网质量都需要注意. 7.电子染色:过程中一定要避免一切污染.

透射电镜样品制备-生物技术共43页

13、遵守纪律的风气的培养，只有领导者本身在这方面以身作则才能收到成效。—— 马卡连柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅精神以及同全世界劳动者的团结一致，是取得最后胜利的保证。—— 列宁摘自名言网
15、机会是不守纪律的。——雨果
谢谢你的阅读
透射电镜样品制备-生物技术
11、战争满足了，或曾经满足过人的好斗的本能，但它同时还满足了人对掠夺，破坏以及残酷的纪律和专制力的欲望。 ——查·埃利奥特 12、不应把纪律仅仅看成教育的手段。纪律是教育过程的结果，首先是学生集体表现在一切生活领域—— 生产、日常生活、学校、文化等领域中努力的结果。— —马卡连柯(名言网)
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非

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4）、如果所取样品的表面有污染物，动物材料要用冷的生理盐水洗；植物材料可用无离子水或自来水洗，但清洗的时间一定要短。
二、固定
用物理或化学的方法迅速杀死细胞的过程叫固定。
1、固定的目的：保存细胞的精细结构，防止组织细胞的自溶；保护样品使其组成物质在以后的清洗、脱水和包埋过程中不至溶解和丢失，并使组织适度硬化，防止切片的变形。
第五章透射电子显微镜生物样品制备技术
第一节透射电子显微镜
生物样品的超薄切片制备技术
透射电镜的样品制备技术，主要有超薄切片技术、负染色技术和冷冻蚀刻复型技术。
超薄切片样品制作技术，是透射电镜生物医学样品制备的最常用技术，其制作程序和石蜡切片的方法步骤基本相同，但是在所使用的某些化学试剂及切片机是完全不同的，对各技术步骤的操作要求要比石蜡切片严格很多。一个能满足透射电镜观察要求的超薄切片应具备以下几点：
3、影响固定效果的因素
1）、固定液的PH值：固定液的 PH值必须接近被固定样品的PH 值。这样可以避免蛋白质结构和性质的变化，大部分的动物组织的平均PH值为7.4，选用PH值7.2~7.4较为适宜；植物组织常用pH值6.8～7.1固定液，固定效果较好。
2）、固定液的浓度：固定液的浓度一定要合适，戊二醛的常用浓度为1～3％，锇酸一般为1～2％。
（2）、双重固定法。用两种或两种以上的性质不同的固定剂对同一种样品进行固定，这种方法是最常选用的。它可以相互彌补固定剂各自的不足，使细胞内的各种结构都得到充分的固定。
（3）、原位固定法。主要用于动物深层组织取材过程中使用的方法，可以防止细胞的自溶。
（4）、灌流固定法。也是在动物组织取材时选用的一种临时固定方法，从动脉向组织内灌注固定液，使组织在短时间内得到充分的固定，本方法适用于独立性好的器官取材时的的临时固定。
4、常用固定剂的种类及பைடு நூலகம்液的配制
1）、固定剂的选择: 一种优良的固定
剂应具备以下条件：渗透能力强；使蛋白质交联成稳定的凝胶，而蛋白质分子结构不发生明显的变化和凝集；能保存酶的一定活力和细胞内其它成分（核酸、核蛋白、糖元及脂类）；对细胞没有收缩和膨胀作用；对细胞不产生人工假象，并能提高电子反差。根据以上条件，适用于电镜样品固定的固定剂常见的有：戊二醛、锇酸、多聚甲醛、高锰酸钾等。
植物组织的取材：植物材料可直接切成适当大小的块，放入预冷的固定液中，
如果材料漂在液体上面，需抽气让组织沉到液体的底部，以便使组织得到充分的固定
游离细胞的取材：悬液培养的细胞需要离心获得细胞的沉淀物，然后再用预冷的固定液进行固定处理；贴壁培养的细胞要先想办法收集细胞团再进行固定处理。
细菌的取材：取材方法基本和培养细胞的方，法相同。悬液培养的要离心获得细菌沉淀物进行固定，平板和斜面培养的可直接获得菌团进行固定。
3）、固定液的渗透压：一般堤身固定液可使细胞膨胀，而高身固定液可使细胞收缩。固定液的渗透压可通过改变缓冲液的浓度或增加纳、钙和镁等电解质或葡萄糖、蔗糖等非电解质来调节。
4）、组织块的大小：组织块大固定的时间要长，固定效果差；组织块小，固定时间短固定效果好。
5）、固定温度：为降低酶的活性，防止细胞的自溶，固定大都在4度中进行。
（1）、戊二醛它是一种还原剂，分子量是100.12，商品是25％的水溶液。
PH为4.0～5.0 。它的穿透能力很强，是蛋白质的优良交联剂，对细胞膜系统、细胞骨架、糖元、核蛋白和细胞基质的固定效果较好。但不能保存脂类物质，不能有效地提高样品的电子反差。
（2）、锇酸是一种强氧化剂，分子量为 254.2，水溶液为中性。它对脂类物质固定效果很好，对核蛋白、蛋白质都有较好的固定效果，能有效地提高样品的电子反差。但不能保存糖类物质，对人体的粘膜组织刺激很强，毒性大。用时一定要在通风条件好的环境中进行。
是不可彌补的。
一、取材
从动、植物体上获得所需实验材料的过程叫取材。
1、取材的方法
动物和植物的取材方法稍有不同。
动物组织的取材：取动物材料时需要先处死动物，然后要在尽短的时间内（要求在１分钟之内）把所需要的组织取出放入预冷（ 40C ）的固定液中，稍加固定后再切成适当大小的块(要求１立方毫米大小）；
人体病理组织的取材：需提前做好准备，到手术室取材。
2、取材的注意事项
1）、取材的全过程要求在冷（40C ）的环境中进行，所用的液体要提前进行预冷。
2）、切割样品时要采取一刀切开的方法，不能用拉锯式切割法，尽量减少对样品的机械损伤。
3）、样品的块要小，要求是1个立方毫米。这样可使样品在较短的时间内得到充分的固定。
2、固定的方法：有物理固定法和化学固定法。 1）、物理固定法：用高温、冷冻、干燥等物理手段，使细胞结构固定，一般不用。
2）、化学固定法：用化学物质对细胞结构进行固定，是常用的方法。
化学固定又可分为：
（1）、单一固定法。即对样品只用一种固定剂进行固定，这种方法只是在一些特殊要求的样品制备中使用（如电镜细胞化学样品制备时），常规制样一般不使用。
2）、缓冲液和固定液的配制
（1）、缓冲液的配制
在电镜样品制备中。常用的有磷酸和二甲砷酸钠两种缓冲液。
A、 0.2mol磷酸缓冲液的配制
甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液
磷酸氢二钠（含2个水分子）
36.61g
(含7个水分子）
53.65g
（含12个是分子）
1、切片厚度均匀，厚度在50～70nm.
2、切片无划痕、无震颤、无人工污染。
3、耐高真空，在真空中不变形、不升华。
4、耐电子束的轰击。
根据上述要求，制作一个合格的超薄切
片需要经过以下步骤：取材、固定（双固定）、清洗、脱水、置换、浸透、包埋、聚合、修块、超薄切片、捞片、电子染色。
由于透射电镜是观察研究组织或细胞内的超微结构，也就是主要研究细胞器的内部结构，它对观察样品的要求十分严格。所以在样品的制备过程中一定要慎重的对待每一操作步骤，否则会造成实验结果的失败。因为有很多材料不能重复取材（如人的病理组织），所以一旦结果不好或失败，