实验性自身免疫性重症肌无力模型的制备

实验性自身免疫性重症肌无力大鼠多肌群SNX17基因的表达张艳停;张运克;高峰;李昕;吕杰;赵雪;张迎娜;方华;李倩如;杜英;张清勇;杨俊红【摘要】目的:探讨实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠多肌群分拣微管连接蛋白17(SNX17)的表达特点.方法:采用主动免疫法构建EAMG大鼠模型(EAMG 组)并进行评估,以正常大鼠作对照(正常对照组),利用荧光定量PCR和Westernblot检测2组大鼠胸锁乳突肌、膈肌、咬肌、心肌、肋间肌、前肢肌、腓肠肌和眼肌等8组肌群中SNX17、nAChR mRNA和蛋白含量变化.结果:成功构建了EAMG大鼠模型.与正常对照组相比,EAMG组大鼠心肌、肋间肌中SNX17 mRNA 的表达升高(P<0.05),膈肌中SNX17 mRNA的表达降低(P<0.05);胸锁乳突肌、腓肠肌和眼肌中nAChR mRNA的表达降低(P<0.05),心肌中nAChR mRNA的表达升高(P<0.05);咬肌、心肌和腓肠肌中SNX17蛋白含量升高(P<0.05),胸锁乳突肌、膈肌中降低(P<0.05).EAMG组腓肠肌中SNX17 mRNA与nAChR mRNA的表达呈负相关(r=-0.773,P=0.035),而在心肌中呈正相关(r=0.947,P=0.012).结论:SNX17可能是神经肌肉接头处的关键蛋白.【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(053)006【总页数】5页(P715-719)【关键词】分拣微管连接蛋白17;主动免疫;实验性自身免疫性重症肌无力;神经肌肉接头;大鼠【作者】张艳停;张运克;高峰;李昕;吕杰;赵雪;张迎娜;方华;李倩如;杜英;张清勇;杨俊红【作者单位】郑州大学第二附属医院神经内科郑州450014;河南中医药大学康复医学院康复办公室郑州450000;郑州大学医药科学研究院神经免疫学研究室郑州450052;郑州大学第二附属医院神经内科郑州450014;郑州大学医药科学研究院神经免疫学研究室郑州450052;郑州大学医药科学研究院神经免疫学研究室郑州450052;郑州大学医药科学研究院神经免疫学研究室郑州450052;郑州大学医药科学研究院神经免疫学研究室郑州450052;郑州大学基础医学院免疫学系郑州450001;郑州大学基础医学院免疫学系郑州450001;郑州大学第二附属医院普胸外科郑州450014;河南中医药大学第一附属医院脑病科郑州450000【正文语种】中文【中图分类】R746.1重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种主要累及神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)突触后膜(终板膜)的获得性自身免疫性疾病，其特征为朝轻暮重[1]，人群患病率约50/10万[2]。

文章编号:1000-5404(2006)13-1397-04论著nAChR单克隆抗体建立重症肌无力被动转移小鼠模型的研究黄 志,徐秀娟 (重庆医科大学儿童医院神经内科,重庆400014)提 要:目的 采用乙酰胆碱受体(nACh R)单克隆抗体-mA b35建立C57BL/6幼年小鼠重症肌无力被动转移模型(passi ve transferred m yast henia grav is,PTMG),摸索成功建立动物模型的mA b35的有效剂量,为进一步探讨重症肌无力(m yast henia grav is,M G)的发病机制和免疫治疗提供实验动物模型。

方法 将实验组分为3组(E1、E2、E3),分别经腹腔注射含0.5、1.0、1.5mg/kg mAb35的R i nger s液0.2m l给B6幼年小鼠,对照组(N)注射不含mAb35的R i ng er s液0.2 m l。

观察其临床表现,并进行药理学、神经电生理学及电镜超微结构鉴定,同时检测血清中n AChRA b水平,以判断模型建立是否成功。

结果 实验组小鼠表现不同程度的M G临床症状,电生理改变、药理学特征、血清学AChRA b升高及超微结构病理改变等均符合M G的病理生理特点。

结论 利用AChR单克隆抗体-mA b35可在幼年C57BL/6小鼠成功建立PT-M G模型,其有效剂量为1.0m g/kg,该方法简便、可靠、敏感,为研究儿童M G提供了一种很好的实验动物模型。

关键词:重症肌无力;单克隆抗体;被动转移中图法分类号:R-332;R392.11;R746.1 文献标识码:AE stablish i ng ani m al m odel of passive transferred myasthenia gravis i n C57BL/6 m ice aged4to5w eeks by acetylcholine receptor monocl onal anti bodyHUANG Zh i,XU X i u-j u an(D epart m ent o f N euro logy,Chil dren s H osp ita l,Chongq i ng U n i versity of M edical Sc iences,Chongq i ng 400014,Ch i na)Abstract:Ob j e cti v e To estab lish an an i m alm odel of passi v e transferred m yasthen ia grav is(PT MG)i n C57BL/6m ice aged4to5w eeks w ith nico ti n ic acety lcho li n e receptor monoclona l antibody-mAb35so as to de-c ide the effective dose ofmAb35requ ired to induce PT MG and to supply ani m alm odel forf u rther study of thepathogenesis and i m munotherapy of hum an MG.Methods The C57BL/6m ice aged4to5w eeks i n t h e exper-i m ental group w ere divided i n to three subgroups(E1,E2,E3),i n j e cted i n traperitonea ll y(.i p.)w ith0.2m lofR i n ger s buffer solution conta i n i n g0.5,1.0or1.5m g/kg capitalm onoc l o na l antibody mAb35of acety lcho-li n e receptor respecti v e l y.The contr o l g roup(N)w ere i n jected.i p.w ith0.2m l o f R i n ger s bu ffer solution w ithout mAb35.To decide whether the m odelw as successfu l,the c li n ica l sy m pto m s,u ltrastruct u ra l changes of t h e m ice as w ell as phar m aco log ica l and electr ophysiolog ical eva l u ation were observed and the seru m levels of acety lcho li n e receptor antibody(AChRAb)w ere detected.Results A llm i c e i n the experi m ental groupsw erei n duced o f cli n ic sy mpto m s o fm yasthen i a.The fea t u res i n phar m aco l o gy,e lectrophysio l o gy,ultrastructure andi n creased level o f acety lcho li n e receptor anti b ody w ere i n accordance w ith those o fMG patients.Conc l u si o nThe m odel o f PT MG can be successfu lly i n duced i n C57BL/6m ice w ith mAb35at effective dose of1.0m g/kg.The m ethod is conven i e nt and reliable.A fi n e ani m almode l is established for experi m ental study o fm yasthenia grav is i n ch il d ren.K ey w ords:m yasthen ia gravis;m onoclonal antibody;passive transfer重症肌无力(m yasthen ia g rav is,MG)是一种典型的获得性自身免疫性疾病,儿童MG是小儿神经内科常见的疾病之一,严重影响患儿及家长的身心健康和作者简介:黄 志(1959-),男,四川省隆昌县人,硕士,主任医师,主要从事小儿神经系统疾病方面的研究。

论 著天津市社会发展科技计划基金资助项目(编号:033111411) *天津医科大学总医院神经内科博士研究生,现在山东大学附属千佛山医院神经内科(济南 250014) 通讯作者(E m ai:l cylf@l sohu .co m )天津医科大学总医院神经内科被动转移法致自身免疫性重症肌无力兔模型的建立李秀华*程焱杨丽谢炳玓梁浩翟翚王虔摘要 目的 用重症肌无力患者的免疫球蛋白(IgG )建立兔急性被动转移性实验性自身免疫性重症肌无力动物模型。

方法 提取重症肌无力患者血中的IgG,并将其腹膜内注入长耳白兔,观察实验兔的临床症状、AChR Ab 滴度、神经肌肉接头电传导功能和病理形态学的变化。

结果 实验兔于被动转移后第2天渐出现肌无力症状,第3~5天肌无力加重。

实验组血清AChR Ab 吸光度较空白对照组和健康对照组显著性增高(P <0 01)。

重复神经电刺激实验(repetitive nerve sti m ulation ,RN S)动作电位衰减率和单纤维肌电图检查平均连续波间值差异均较空白对照组和健康对照组显著延长(P <0 01)。

实验组微小终板电位的波幅和频率较空白对照组和健康对照组均显著性降低(P <0 01)。

实验组单位面积的神经肌肉接头数较空白对照组和健康对照组显著性减少(P <0 05)。

结论 被动转移重症肌无力患者的IgG 可以诱导出重症肌无力家兔模型。

关键词 被动转移法 实验性自身免疫性重症肌无力 ACh R Ab 重复神经电刺激实验 神经肌肉接头数 中图分类号 R 746.1 文献标识码 APassive Tran sfer of E xper i m ental Autoi mmune M yasth en ia G ravis i n Rabb its w ith IgG ofM yasth en ia gravis patients .LI X iuhua ,C HEN G Yan,YAN G L i ,X IE B i ng li ,LIAN G H ao ,Z HA I H u i ,WAN G Q ian .N eurology D e p ar t m ent ,T ianjin M e d ical Uni versity G eneral H o sp ital ,154,An s han Road,H ep i ng D istri ct ,T ian ji n ,300052.T e:l 0531-********Abstract O bjective T o create exper i m enta l auto i m m une m yasthen ia grav i s (EAM G )rabbits by passi ve transfe r the IgG.M ethods Crude i m munog l obu lin fracti ons of myasthen i a gravis pati ents w ere prepared by amm on i u m su l phate precipitation at 33%saturati on and purified by chro m a t og raphy on DE A E Sephadex A 50.Expe ri m en tal an i m als w ere i n j ec ted IgG i ntraperitonea ll y (.i p)and the pheno t ype w as graded i n 4leve ls .A nti ace t y lcho line receptor anti bodies were eva l u a ted usi ng enzym e li nked i m munosorben t assay (EL ISA )and e lectrophys i o l og ica l function w as assessed by repetiti ve nerve sti m ulati on (RN S),si ng le fi bre e lec trom yog raphy (SFE M G )and m i n iat ure endplate po tential (M EPP )tests .H istolog i ca l stud ies w ere eva l uated usi ng i m munohisto l ogy .R es u ltsT he second day after the passive transfer ,a ll t he rabbits in experi m ental g roup sho w ed cli nica l signs o f fati gability and w eakness and t he weakness exacerbated on the t h ird day .C li nica l sy m pto m s cou l d be attenuated by neostig m i ne .A nti acety lcho li ne receptor anti bodies we re si gn ifi cantl y h i gher in exper i m en ta l g roup than i n the healthy contro l and contro l groups (P <0 01).A t 3,5,10H z ,the dec re m ent of co m pound musc le ac ti on potential (C M AP )and the m ean o f consecuti ve difference (M CD )of a ll the rabb its w ere sign ificantl y higher i n experi m enta l group t han i n the healthy contro l and contro l g roups (P <0 01).The amp litude and frequency ofM EPP in experi m enta l group decreased sign ificantl y compar i ng w it h healthy contro l group and contro l group (P <0 01).T he quantity of neuro m uscu lar juncti on pe r un it a rea (25mm 2)i n expe ri m ental g roup decreased si gn ifi cantl y com par i ng w it h the hea lthy contro l g roup and contro l group (P <0 05).Conc l u si on s The rabb itm ode l of E AM G can be created by passive transfe r the IgG o fm yast hen ia g rav is pati ents to rabb its .K ey words Passi ve transfer Expe ri m ental auto i m mune myasthenia grav is AChR Ab R epetiti ve nerve sti m ula ti on N euro m uscu l a r j uncti ons重症肌无力(myasthenia gr avis ,M G )是一种主要累及神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体,由乙酰胆碱受体抗体(A chR Ab)介导的细胞免疫依赖性补体参与的自身免疫性疾病[1]。

重症肌无力病因病理病因重症肌无力(myasthenia gravis, MG)是一种神经一肌肉接头传递功能障碍的获得性自身免疫性疾病。

主要由于神经一肌肉接头突触后膜上乙酰胆碱受体（acetylcholine recep-tor, AChR)受损引起。

重症肌无力的发病机制与自身抗体介导的突触后膜AChR的损害有关。

主要依据有：①动物实验发现，将电级鱼放电器官提纯的AChR注入家兔，可制成重症肌无力的实验性自身免疫动物模型，其血清中可检测到AChR抗体，可与突触后膜的AChR结合。

免疫荧光发现实验动物突触后膜上的AChR的数目大量减少。

②将重症肌无力患者的血清输人小鼠可产生类重症肌无力的症状和电生理改变。

③80 % -90%的重症肌无力患者血清中可以检测到AChR抗体，并且其肌无力症状可以经血浆交换治疗得到暂时改善。

④重症肌无力患者胸腺有与其他自身免疫病相似的改变，80％患者有胸腺肥大，淋巴滤泡增生，10％-20％的患者有胸腺瘤。

胸腺切除后70％患者的临床症状可得到改善或痊愈。

⑤重症肌无力患者常合并甲状腺功能亢进、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和天疱疮等其他自身免疫性疾病。

研究表明重症肌无力是一种主要累及神经一肌肉接头突触后膜AChR的自身免疫性疾病，主要由AChR抗体介导，在细胞免疫和补体参与下突触后膜的AChR被大量破坏，不能产生足够的终板电位，导致突触后膜传递功能障碍而发生肌无力，骨骼肌烟碱型AChR 分子量为250kD，由αβγδ”4种同源亚单位构成五聚体（α2 βγδ）跨膜糖蛋白，α亚单位上有一个与ACh结合的特异结合部位，也是AChR抗体的结合位点。

AChR抗体是一种多克隆抗体，主要成分为IgG, 10％为Igm 。

在AChR抗体中，直接封闭抗体可以直接竞争性抑制Ach和AChR的结合；间接封闭抗体可以干扰ACh与AChR结合。

细胞免疫在MG的发病中也发挥一定的作用，MG患者周围血中辅助性T细胞增多，抑制性T细胞减少，造成B细胞活性增强而产生过量抗体。

实验性自身免疫性肌炎动物模型制作的研究的开题报告一、选题背景自身免疫性肌炎（idiopathic inflammatory myopathies，IIM）是一类少见但严重的自身免疫性疾病，其特征为肌肉组织的炎症和肌无力症状。

目前临床上用于治疗IIM的治疗手段主要包括皮质激素和免疫抑制剂等，但这些治疗手段不仅存在严重的不良反应，而且其疗效并不稳定，因此迫切需要寻找新的治疗方法。

与此同时，由于IIM发病机制仍然不明确，为研究其发病机制和寻找新的治疗方法提供了挑战。

二、研究目的本研究旨在建立一种实验性自身免疫性肌炎动物模型，为研究IIM的发病机制和开发新的治疗方法提供实验基础和理论依据。

三、研究方法本研究采用小鼠作为实验对象，通过免疫学和组织学方法制备自身免疫性肌炎模型。

具体方法如下：1.小鼠模型制备选用C57BL/6小鼠，按照抗合成酶抗体阳性的IIM患者的临床症状及实验室检查结果，注射抗合成酶抗体，并加以免疫佐剂刺激，制备自身免疫性肌炎小鼠模型。

2.免疫学分析采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测小鼠血清中合成酶抗体的水平，评估模型制备的成功率和抗体水平的变化。

同时采集小鼠外周血、淋巴结和肌肉组织等样品，采用流式细胞仪分别分析其淋巴细胞亚群和分泌的细胞因子，评估模型对免疫系统的影响。

3.组织学分析采集自身免疫性肌炎小鼠的肌肉组织样品，进行组织学切片，对切片标本进行炎症程度的评估，评估模型对肌肉组织的影响。

四、预期结果通过本研究，我们将建立一种可靠的自身免疫性肌炎小鼠模型，为研究IIM的发病机制和开发新的治疗方法提供实验基础和理论依据。

同时，我们预期发现在小鼠模型中，合成酶抗体水平的变化、淋巴细胞亚群和分泌的细胞因子的变化以及肌肉组织的炎症程度，将为研究IIM的发病机制提供新的线索。

实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠腓肠肌低密度脂蛋白受体相关蛋白4表达的特点闫斌;朱明振;李卫君;霍颖浩【摘要】目的探讨实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)模型大鼠腓肠肌低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)表达的特点.方法将30只大鼠随机分为EAMG组、对照组和空白组.以小鼠乙酰胆碱受体(AChR)基因为模板合成AChR抗原,以Lewis 大鼠为免疫动物.EAMG组采取主动免疫法将AChR抗原与弗氏佐剂混合制成乳剂,注射入大鼠背部皮下.对照组在相同部位注射等量的弗氏佐剂.空白组在相同部位注射等量的生理盐水.8周后使用低频重复电刺激(RNS)检测肌电RNS衰减率.采用蛋白免疫印迹法检测腓肠肌LRP4含量.结果 EAMG组所有大鼠在8周后出现肌无力症状,对照组、空白组大鼠无肌无力症状.EAMG组大鼠RNS衰减率明显高于对照组和空白组(均P<0.05).EAMG组大鼠腓肠肌LRP4蛋白的相对含量明显低于对照组和空白组(均P<0.05).结论 EAMG大鼠中,当AChR被自身抗体破坏时,可能导致包含LRP4在内的整条信号通路受损,进而使LRP4含量减少.LRP4是神经肌肉接头信号通路完整的重要分子.%Objective To observe the express characteristics of low density lipoprotein receptor related protein 4 (LRP4) in gastrocnemius muscle in experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG) rats model.Methods Thirty rats were randomly divided into EAMG group,control group and blank group.Acetylcholine receptors (AChR) gene in mice was the template synthesis of AChR antigen,and Lewis rats were the immuned animal.The rats of EAMG group were immunized with the AChR antigen and complete Freund's adjuvant.Control group were immunized with the complete Freund's adjuvant.The rats of blank groupwere immunized with the physiological saline.The decrement percentage of repetitive never stimulation (RNS) of each group muscle after 8 weeks was detected.The content of LRP4 in gastrocnemius muscle cells was detected by Western Blot.Results The rats of EAMG group were found symptoms of muscle weakness after 8 weeks,but the control group and blank group were not found symptoms of muscle weakness in rats.The attenuation rate of RNS in EAMG group was significantly higher than those in the control group and blank group (all P<0.05).The expression of LRP4 in EAMG group was significantly lower than those in the control group and blank group (all P<0.05).Conclusions In EAMG rats,when the AChR destroyed by autoantibodies,the whole article signaling pathways is damaged,and the expression of LRP4 is decreased.LRP4 is a neuromuscular joint complete important molecules.【期刊名称】《临床神经病学杂志》【年(卷),期】2017(030)002【总页数】3页(P131-133)【关键词】低密度脂蛋白受体相关蛋白4;重症肌无力;主动免疫;乙酰胆碱受体【作者】闫斌;朱明振;李卫君;霍颖浩【作者单位】457000 河南省濮阳市人民医院神经内科;457000 河南省濮阳市人民医院神经内科;457000 河南省濮阳市人民医院神经内科;河北医科大学第二附属医院神经内科【正文语种】中文【中图分类】R746.1重症肌无力(MG)是一种主要由乙酰胆碱受体(AChR)抗体介导的发生在神经肌肉接头(NMJ)处的自身免疫性疾病[1]。

升陷汤治疗实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的免疫机制研究重症肌无力的免疫学机制是现代研究的热点,尤其是针对T淋巴细胞亚群分部及其所涉及的细胞因子网络的研究更是研究的重点。

现代中医临床实践表明：以升陷汤为代表的益气升提法是现代中医治疗重症肌无力的基本治法。

导师吴颢听教授用升陷汤加减治疗重症肌无力取得较为满意的临床效果。

本研究旨在通过复制实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis, EAMG)大鼠模型,用升陷汤给药治疗,观察其治疗EAMG大鼠的效果,从而探讨其治疗EAMG的免疫学机制。

目的通过观察T淋巴细胞亚群分布及其比例变化,及乙酰胆碱受体抗体(icetylcholinergic receptor antibody, AchR-Ab)、γ干扰素(Interferon-γ, IFN-γ)、白细胞介素2(Interleukin2, IL-2)、白细胞介素4 (Interleukin4, IL-4)、白细胞介素17 (Interleukin17, IL-17)、大鼠转化生长因子β(Transforming growth factor-beta, TGF-β)等细胞因子含量的变化,探讨升陷汤治疗EAMG大鼠的免疫机制。

方法1.人工合成的鼠源AChR α亚基97-116肽段皮下注射免疫Lewis大鼠制成EAMG模型。

2.实验期间每周2次测体重,造模后采用生物信号采集系统用低频重复电(Reptitive Nerve Stimulation, RNS)刺激大鼠,检测各组大鼠肌电图,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay, ELISA)测定大鼠血清中AChR-Ab 滴度及计算P/N的值。

对模型进行评估。

3.经模型评估确定建模成功后将大鼠随机分为佐剂对照组、模型对照组,西药(强的松)对照组,升陷汤低、中、高剂量组。

实验性自身免疫性肌炎动物模型制备贾复敏;李悦;卜碧涛【摘要】目的:制备实验性自身免疫性肌炎(EAM)动物模型,观察白介素-6(IL-6)在EAM模型肌肉组织中的表达.方法:豚鼠20只,随机分为模型组12只和对照组8只,模型组采用纯化兔骨骼肌肌球蛋白+弗氏完全佐剂(CFA)免疫注射,对照组给予CFA+PBS免疫注射,2组均每周免疫1次,连续6周,并同时给予2次百日咳菌液腹腔注射.观察2组临床表现、血清肌酶水平及肌肉病理,并采用免疫组织化学方法检测IL-6在肌肉组织中的表达.结果:模型组豚鼠血清中肌酸激酶、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶水平均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).注射免疫第6周末,2组临床评分差异有统计学意义(P＜0.05),模型组血清肌酶水平与临床评分呈正相关(r=0.853,P＜0.05).模型组的肌束膜、肌内膜和坏死肌纤维处均有IL-6阳性表达,对照组肌肉标本几乎无IL-6表达.结论:EAM模型制备成功,IL-6在其发病过程中可能起重要作用.【期刊名称】《神经损伤与功能重建》【年(卷),期】2015(010)001【总页数】4页(P8-11)【关键词】实验性自身免疫性肌炎;动物模型;多发性肌炎;白介素-6【作者】贾复敏;李悦;卜碧涛【作者单位】湖北省新华医院神经内科武汉 430015;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉 430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉 430030【正文语种】中文【中图分类】R741;R746.9特发性炎性肌病是一种获得性的由自身免疫介导的慢性系统性结缔组织病，其确切的病因及发病机制尚未被完全阐明。

近年来的研究表明，免疫机制是特发性炎性肌病发生的主要机制，各种细胞因子在其中起到不可忽视的作用。

本实验采用注射免疫的方法制成实验性肌炎（experimental autoimmune myositis，EAM）动物模型，并在此基础上应用免疫组织化学技术检测淋巴细胞和细胞因子白介素-6 （interleukin-6,IL-6）在EAM动物模型肌肉组织中的表达情况，以了解其在炎性肌病发病过程中可能起到的作用。