云南普洱茶中黄酮含量的测定及槲皮素、芦丁的提取分离

普洱茶中黄酮类化合物含量的测定方法王丽;邵金良;魏茂琼;林涛;刘兴勇;汪禄祥;梅文泉;刘宏程【摘要】为了解不同加工工艺和储存年限的普洱茶中黄酮类化合物的含量,建立了同时测定普洱茶中芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、芹菜素、山奈酚6种黄酮类化合物含量的高效液相色谱检测方法。

样品经体积分数为80%甲醇水溶液涡旋超声提取、离心后,高效液相色谱法测定,采用Waters C18柱(4.6 mm×250.0 mm,5μm),以乙腈-0.5%冰乙酸(18：82,体积比)的溶液为初始流动相,梯度洗脱,流速1.2 ml/min,检测波长为354 nm。

结果显示,在最优的检测条件下,各目标化合物的加标回收率为76.26%~108.96%,相对标准偏差均不大于7.18%,6种黄酮类化合物的检出限为0.010~0.040 mg/kg,定量限为0.03~0.10 mg/kg。

普洱茶实际样品分析结果表明：不同加工工艺和储存年限的普洱茶中6种黄酮类化合物含量有显著或极显著差异,6种黄酮类化合物含量可作为普洱茶加工工艺及储存年限判别的一个评价指标。

%A method was developed for the simultaneous determination of rutin, hyperoside, kaempferol-3-O-ruti-nosid, quercetin, apigenin and kaempferol in pu-erh tea by high performance liquid chromatography ( HPLC) equipped with UV detector to understand the content of flavonoids with different processing techniques and storage period. The ana-lytes were extracted from the pu-erh tea samples by 80% methanol with ultrasonic assistance and analyzed by high perform-ance liquid chromatography. The separation was conducted byC18 column (4. 6 mmí250. 0 mm, 5 μm) with gradient elu-tion. The mobile phase consisted of acetonitrile-glacial acetic acid, and the initial composition of mobile phase started at 18 : 82 ( V/V) with flow rate of 1. 2ml/min and wavelength of 354 nm. The results revealed that the recoveries of standard ad-dition were 76. 26%-108. 96%, and the relative standard devia-tions( RSDs) were all no more than 7. 18%. The limits of detec-tion were 0. 010-0. 040 mg/kg, and the limits of quantification were 0. 03-0. 10 mg/kg for six flavonoids, respectively. The content of six flavonoids in pu-erh tea with different processing techniques and storage period has significant or extremely signifi-cant differnce, which can be used as an indicator for the identifi-cation of storage period and processing techniques of pu-erh tea products.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2016(032)006【总页数】6页(P1410-1415)【关键词】普洱茶;黄酮类化合物;高效液相色谱【作者】王丽;邵金良;魏茂琼;林涛;刘兴勇;汪禄祥;梅文泉;刘宏程【作者单位】云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量监督检验测试中心昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量监督检验测试中心昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量安全风险评估实验室昆明，云南昆明650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量安全风险评估实验室昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量监督检验测试中心昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量监督检验测试中心昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量监督检验测试中心昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量安全风险评估实验室昆明，云南昆明 650223【正文语种】中文【中图分类】TS272.5+4普洱茶是以云南西双版纳、思茅等地大叶种晒青毛茶为原料，经揉捻、杀青及固态发酵等过程加工而成的散茶和紧压茶，属于地理标示农产品[1]。

的细粉（约2.6克）中和至PH7。滤除生成的BaSO4沉淀
（可用滑石粉助滤）。滤液浓缩至约1ml。供纸层析点样 用。
展开剂
对照品 显色剂
正丁醇-醋酸-水（4:1:5上层或4:1:1）
葡萄糖、水解液鼠李糖水溶液 苯胺邻苯二甲酸盐试剂喷后，105℃烘十分 钟。显棕色或红色斑点。
三、槲皮素五甲醚的制备
取槲皮素结晶4000mg，置于150ml的三颈瓶中，加50ml无水丙酮，
克分子吸收系数的测定：根据已测定的黄酮光谱，测量吸收峰的波 长和吸收峰前后20nm的波长范围。然后取样品溶液约3ml，置于1cm长的 石英杯中，测UV，仔细测量在上述波长范围内各波长的吸收值，反复测 定三次。
思考题及记录

思考题：
（1）芦丁和槲皮素用不同展开剂系统展层将出现什么结果？为什么？
（2）芦丁和槲皮素聚酰胺薄层色谱将出现什么结果？为什么？
装上电动搅拌器，冷凝管及温度计，加热回流搅拌，每间隔一适当时 间加入无水碳酸钾0.2克和硫酸二甲酯0.2ml，大约在1.5小时左右加完 4克无水碳酸二甲酯，继续加热回流搅拌直至溶液黄色完全消退为止， 约需4~5小时，停止加热，取下烧瓶，反应液经过滤，沉淀用热丙酮洗 涤数次，合并洗、滤液、蒸馏回收部分丙酮，留存10
取上述溶液1~ 2ml，然后加10%α -茶酚乙醇溶液，摇匀，沿
管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化
二．纸色谱及薄层色谱鉴别
1. 纸色谱：
新化一号层析滤纸 样 品: 自制芦丁、槲皮素 对照品: 芦丁、槲皮素 展开剂: (1) 正丁醇-醋酸-水（4:1:5上层或4:1:1） (2) 25%醋酸水溶液 (3) 85%醋酸水溶液 显 色: (1) 可见光下观察，再在紫外光下观察 (2) 经氨气后再观察 (3) 喷三氧化铝试剂后再观察

四、芦丁的鉴定
定性反应鉴别见附录。
（一）芦丁的酸水解
称取精品芦丁2g
置500ml烧瓶中
加2%的H2SO4200ml
加热回流1小时
放冷，静置，抽滤
酸性滤液沉淀
中和冷水洗两次，干燥
用95%乙醇25 ml最后称重，计算收率。
浓缩
黄色细针状结晶
浓缩液（槲皮素）
（供糖的鉴定）
补充知识:
关于苷（gān）和甙(dài):苷类（glycosides，旧称甙）又称配糖体，是糖或糖的衍生物的半缩醛羟基与另一类非糖物质中的羟基以缩醛键（甙键）脱水缩合而成的环状缩醛衍生物，水解后能生成糖与非糖化合物。目前国际上通用“苷”如“皂苷”，而过去习惯使用的中文名称“甙”目前已不再使用如“皂甙”现统称“皂苷”。
展开剂：正丁酵-醋酸-水（BAW）（4：1：5）上层，悬挂并利用上层展开剂纸色谱分离。
显色剂：苯胺以及邻苯二甲酸混合试液，喷后105℃烘10分钟。显棕红色斑点。
注意事项:纸层析展开时可事先用铅笔在裁剪好的层析纸上画出展开起点(即点样的位置)和预制终点(即展开完毕后展开液的前沿)，这样方便进行测量计算比移值。另外由于糖液一般无色，因此点样位置也可事先用铅笔点出标记，注意如果糖液浓度过低（实验时应尽量将糖液蒸发浓缩至3毫升以内）则应多次点样以达到浓集的目的，否则展开后的点不够明显。点样时也需要注意点样液斑不易扩散太大，应控制液斑直径在3 mm以内，同时各点样点之间应尽量保持距离不可过于靠近，否则展开后可能得到较大的样班，而且不同样斑之间可能重合相互干扰而不易测量比移值。下图给出正确的纸层析法标示。
综合化学实验:芦丁的提取分离和鉴定
芦丁简介:
芦丁（Rutin）又名芸香苷化学式: C27H30O16·3H2O，是一种浅黄色针状结晶有机化合物，广泛存在于自然界植物中，是一种被人们广泛使用的有机天然产物。目前已发现含有芦丁的植物至少在70种以上，常见的如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均有不同含量。尤其以中药槐米（豆科、槐属，槐树Sophorajaponica的花蕾）和荞麦中含量最高，因此槐米可作为大量提取芦丁的天然植物原料。

2. 实验仪器及药品
SHZ-D循环水式真空泵（河南省巩义市英峪 仪器一厂），电热恒温水浴锅（上海医疗器 械五厂），烧杯（1000ml），圆底烧瓶，球 形冷凝管，漏斗，托盘天平，抽滤瓶，布氏 漏斗滤纸，试管，滴管，新华1号滤纸，铅笔， 铁架台，电炉，石棉网，橡皮管。 槐花米（2011年购于同仁堂大药房）， 95%乙醇，浓硫酸，浓盐酸，镁粉，醋酸铅 试剂，1-萘酚，正丁醇，醋酸，1%三氯化铝 乙醇溶液，无水乙醇，硼砂水，饱和石灰水。
3、 结果与分析 、
从表3可以看出，在可见光下，芦丁和槲皮素的色 斑均呈现黄色，在253.7 nm紫外灯下，芦丁呈亮绿 色，槲皮素呈亮黄色。再加入1%三氯化铝-乙醇溶 液，荧光斑点的亮度更加明显。 主要原因是因为芦丁和槲皮素的区别在于芦丁水解 后失去了糖苷，其本身的结构发生了变化，故在紫 外灯光的照射下呈现出不同的颜色。 水提法 取20 g 槐花米按水提法的流程操作，可提 取出粗产品，收率仅为5.32 %。 碱液提取法 在加入石灰水中煮沸时, 调节不同酸 度，得酸度对产品质量的影响（见表4 ）
2 .色谱鉴定 色谱鉴定
点样：取新华一号滤纸，距下端3厘米处用铅 笔划线，为起始线，隔1.5厘米处点样品。将 点好样品的滤纸挂在层析缸中饱和半小时， 在上行展开。 芦丁乙醇溶液 b. 精制槲皮素乙醇溶液 展开剂：正丁醇-醋酸-水（4:1:5，上层） 2.2.2 显色：a. 可见光下观察色斑，紫外灯 下观察荧光斑。 1%三氯化铝-乙醇溶液，在观察荧光斑点。
二、论文设计全过程
芦丁的提取 分离及鉴定
实验部分
鉴定
结果分析与 讨论
OH
一、实验部分
1.实验原理 实验原理 芦丁（Rutin） C27H30O16·3H2O，浅黄色针 状结晶，mp 174～178 ℃（含三 分子水）；188 ℃（无水物）。 难溶于冷水（1:8000～10000）， 可溶于热水（1:180～200），热 甲醇（1:10），冷甲醇 （1:100），热乙醇（1:60）， 冷乙醇（1:650）；难溶于乙醚、 三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、 丙酮，易溶于碱液。