《基因工程》-第五章

第一章基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。

构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。

亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。

PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。

但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。

第二章分子克隆工具酶限制与修饰系统？答：限制系统可以排除外来DNA。

限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。

甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。

并且能够保证自身的DNA不被降解。

使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。

如：HindIII限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。

II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。

其限制反应与甲基化反应是分开的反应。

不需要ATP的参与。

限制酶识别的序列长度？结构？答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。

回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。

但他们的切割位点有可能不同。

分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。

《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。

2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。

4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。

8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。

带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量

cccDNA在较高高的温度和PH值条件下才会变性，（较线 性和开放环结构的DNA），如果变性，由于团在一起，条 件恢复后，会很快复性，形成cccDNA，线性和环状的变 性后，复性会形成杂乱的大分子团状结构，从而从体系中 沉淀下来。
3. 质粒DNA的分子量和拷贝数：
按质粒的分子量大小，可分为量大类： 3――7kb，拷贝数多； 70－150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传 递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一 个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒， 他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。
质粒的拷贝数：分子的多与寡是决定产量的重要因素。
pBR322 拷贝数大于25个 ColE1 15个 产量0.23ug/ml 0.11 ug/ml
基因克隆尽量选择松弛型质粒，如果是严紧型要进行质粒 复制子改造。
质粒的大小：通常质粒越大，拷贝数也越少，所以我们 在进行基因重组时，首先要选择分子量小的质粒，其次 质粒分子量大的要使外源基因的片断长度合适，不要过 大。
பைடு நூலகம் 2、pUC质粒载体：
pUC质粒载体：是由美国加利福尼亚大学的专家构建 的。是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个带 有多克隆位点的LacZ’基因，而发展成为具有双功能 检测特性的质粒载体。
最常用的克隆载体，优点： 具有更小的相对分子量和更高的拷贝数。 在构建pUC质粒载体时仅留下pBR322的复制起始起 始位点和AMP抗性基因，分子大大减小，他的拷贝数 可以达到500－700个/个细胞。 适合组织化学法检测重组子。有利于检测 具有多克隆位点，便于片断的插入。
沉淀出来。
第一步：（1）在5m1含相应抗生素的LB培养基中接种 一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。（2）将1.5m1 培养物倒入Eppendorf管中，用微量离心机于4℃以 12000rpm离心30秒。 （3）吸去培养液，使细菌沉淀 尽可能干燥。（4）将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的 溶液I中（溶液Ⅰ：50mmol／L 葡萄糖， 25mmol／L Tris· (pH 8．0)， 10mmol／L CI EDTA(pH 8．0，溶菌酶4－5mg，酶作用环境由缓冲 液提供)。剧烈振荡。须使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分 散，将两个微量离心管的管底部互相接触，室温静止5 －30min，细胞壁降解。