《基因工程原理与技术》实验教学大纲
课程名称：基因工程原理与技术
课程编号：0321011
课程性质：非独立设课课程属性：专业课
学时学分：总学时40，总学分2，实验学时10
应开实验学期：三年级第六学期
适应专业：生物工程、生物技术
先修课程：分子遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学等
大纲主撰人：王新卫大纲审核人：张玉龙张书松
一、实验课程简介
基因工程又称遗传工程、DNA重组技术、分子克隆等。它是上个世纪七十年代在分子生物学发展的基础上形成的新学科。所谓的基因工程，就是在分子水平上，用人工的方法提取或者合成某一生物的遗传物质，在体外切割，拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制和表达。按照人们的意愿创造生物新性状，使之稳定的遗传给下一代。所以基因工程具有广阔的应用前景，既能为工农业生产和医药保健等开拓新途径，又能为生物的细胞分化，生长发育，肿瘤发生等基础研究提供有效的实验手段。目前，基因工程实验技术已经成为生物学领域许多实验室的常用技术，也可以说是生物技术的核心技术，是生物技术专业学生必须掌握的内容。本课程通过对一些基本的基因工程实验技术的操作，使学生得到初步的锻炼，为以后从事生物工程领域的相关科研、教学及生产工作奠定基础。
二、本课程实验教学目的与基本要求
通过实验教学，使学生重点掌握质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定、目的基因的获得和重组载体的构建、感受态细胞的制备和转化及筛选鉴定、目的基因在原核细胞中表达与SDS-PAGE鉴定等技术，最终达到掌握基本实验技能和培养学生创新能力的目的。
要求学生有强烈的事业心，热爱生物技术专业、动物医学专业，理论和实践相结合，更深入的理解和掌握基因工程原理与技术。实验中要认真、仔细，爱护公共财产，并能严格遵守课堂纪律，以保证顺利完成每次实验。
四、实验方式与基本要求
实验方式：实验前要求学生预习实验内容。实验课上指导教师讲述实验的基本原理、方法及仪器的使用，并指导学生独立完成具体实验步骤，解决实验中出现问题，分析实验结果。完成实验报告。
要求：严格按操作规程、步骤进行，遵守实验室纪律。
五、考核方式与成绩评定
本课程要求学生对每次实验进行详细观察和记录，实验结束后形成完整实验资料，在此基础上撰写实验报告，作为实验考核的主要依据；同时，每次实验由指导老师对操作环节进行等级评定。最后的实验成绩按照操作成绩和报告成绩综合评分。
实验成绩占整个成绩的20%。
六、参考书目
楼士林等编著.基因工程.科学出版社.2002年第一版.
吴乃虎.基因工程原理.科学出版社.2002年第二版.
J．萨姆布鲁克等.分子克隆实验指南. 科学出版社.1993年第二版.
J.M.沃克等编，谭天伟等译.分子生物学与生物技术.化学工业出版社.2003年第一版.
七、实验内容安排
实验一、质粒DNA的提取
一、实验学时：3学时
二、实验目的：熟练掌握抽提细菌质粒DNA的一般方法。
三、实验内容：
1．实验准备：各种溶液的配制与器材处理。
2．操作步骤：
（1）菌种接种与培养。
（2）菌液离心沉淀。
（3）碱裂解法提取细菌质粒DNA。
四、实验要求：试验时安静，小心；结束后，清洗仪器，撰写实验报告。
五、实验用品与仪器：
1．器材：超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
2．试剂：质粒载体菌,LB培养基，葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS 溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer （pH8.0）。
实验二、DNA的酶切、电泳鉴定
一、实验学时：3学时
二、实验目的：掌握限制性内切酶切割质粒DNA的原理与操作步骤；掌握DNA琼脂糖凝胶电泳技术；学会DNA琼脂糖凝胶电泳回收技术。
三、实验内容：
1．实验准备，溶液配制。
2．操作步骤：
（1）、取上述制备的DNA置于离心管内。
（2）、加入缓冲液，然后加入限制性内切酶，
（3）、37度进行酶切。
（4）、琼脂糖凝胶电泳鉴定。
（5）、质粒回收。
四、实验要求：
1．限制性内切酶取出后，放冰盒内操作，用完后立即把内切酶原液送回冰柜。
2．清理桌面垃圾，清洗实验仪器。
3．写出实验报告，并在每步操作之后标明该步骤常发生的问题。
五、实验用品与仪器：
1．器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，l微量离心管，恒温水浴锅。
2．试剂：质粒，EcoR I，内切酶缓冲液，电泳加样缓冲液。
实验三、目的基因的PCR扩增
一、实验学时：2学时
二、实验目的：了解PCR扩增DNA的原理，掌握PCR技术的操作步骤。
三、实验内容：
1．缓冲液配制，引物设计。
2．在反应管内加入反应试剂。
3．执行反应程序，PCR扩增。
4．PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测。
四、实验要求：
1．学会引物的设计方法，注意PCR反应的条件。
2．打扫卫生，整理实验室。
3．写出实验报告，叙述PCR反应原理。
五、实验用品与仪器：
1．器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，PCR微量管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，恒温水浴。
2．试剂： Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP，引物，模板质粒，无菌dd water。
实验四、DNA片断的体外连接
一、实验学时：2学时
二、实验目的：熟悉DNA体外连接的原理，掌握连接的步骤。
三、实验内容：
PCR产物与载体的连接。
四、实验要求：
1．了解T4DNA连接酶的工作原理。
2．注意连接酶工作的影响因素。
3．清洁实验室，写出实验报告，分析影响连接的因素。
五、实验用品与仪器：
1．器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，微量离心管，台式离心机，干式恒温气浴等。
2．试剂：酶切载体，插入片断，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water。
实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备
一、实验学时：3学时
二、实验目的：了解CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理，掌握制备方法。
三、实验内容：
1．准备培养基。
