基因工程实验
教学方案
湖南人文科技学院生命科学系生物技术教研室
指导教师：吴娟
实验一重组质粒的提取及转化表达型菌株
Ⅰ质粒DNA的提取
实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。
实验原理
1．碱变性法基本原理是，在Ph12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。
2．设计构建体外重组DNA分子
构建体外重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源DNA基因。构建体外重组DNA分子，最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解，产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率高，也易于筛选处重组子。
附表达载体pGEX-6P-1-mreB的构建图：
仪器材料与试剂
（一）仪器
1．恒温摇床
2．台式离心机
3．漩涡混合仪
（二）材料与试剂
1．含pGEX-mreB质粒的大肠杆菌DH5α
2．含pGEX质粒的大肠杆菌DH5α
3．液体LB培养基
4．100mg/mL氨苄青霉素Amp
5．新捷质粒提取试剂盒
实验步骤
分为两组：一组提取质粒pGEX-mreB，另一组提取质粒pGEX。
1）12000rmp 离心30秒收集1-5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入250ul 已加入Rnase A的Buffer Ⅰ, 充分悬浮细菌沉淀。
2）加入250ul Buffer Ⅱ, 温和并充分地翻转离心管4-6次。
3）加入350ul Buffer Ⅲ,温和并充分地翻转离心管4-6次。
4）13000 rmp 离心10分钟。
5）将核酸纯化柱置于2ml 离心管中，转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rmp离心30秒。
6）弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ul Buffer W2,盖上管盖，12000rmp离心30秒。
7）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化住置回到2ml离心管中，14000 rmp离心1分钟。
8）弃2ml离心管，将核酸纯化住置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50-100ul Buffer TE ,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rmp离心30秒。
9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-20℃。
实验结果
实验安排
3个小时
Ⅱ质粒DNA的转化
实验目的
通过本实验，掌握大肠杆菌转化的方法与技术。
实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。转化是指质粒DNA或以其为载体构
低渗溶液中，菌细建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃、CaCl
2
胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸DNA复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Amp r等）得到表达，然后将此细胞培养物涂在选择性培养基上。
E.coli DH5α是一种用于质粒克隆的菌株。
E.coli BL21是一种适合于外源蛋白表达的菌株，其内源性的蛋白酶基因缺失。仪器材料与试剂
（一）仪器
1.超净工作台
2.恒温摇床
3.制冰机
4.高压灭菌锅
(二) 材料与试剂
1.大肠杆菌Bl21感受态细胞
2.质粒DNA： pGEX-mreB、pGEX。
3．固体LB培养基平板（含Amp 120ug/ml）
实验步骤
分为两组：一组加入质粒pGEX-mreB，另一组加入质粒pGEX。
1.取100ul 新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA 2ul混匀，冰上放置30min。同时做一个对照管，仅加入100ul感受态细胞，不加质粒。
2.将管放到42℃热激90s。
3.冰浴2min。
4.每管加400ul LB 液体培养基，37℃培养1h(150r/min)
5．将适当体积（200ul）的复苏细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养皿中，正置平皿30min。
6.倒置平皿37℃培养12-16h,出现菌落。
实验结果
实验安排
这整个大实验从质粒提取到转化需一天，第二天早晨观察结果。
实验二外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测
Ⅰ外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
实验目的
通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。
实验原理
将外源基因mreB克隆在含有Tac启动子的表达载体pGEX中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac
操纵子的诱导物IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE进行检测，或做蛋白质印迹，用抗体识别表达蛋白。
Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。
仪器材料和试剂
（一）仪器
2.离心机
3.超净工作台
4.分光光度计
（二）材料与试剂
1.含pGEX-6P-1-mreB表达质粒的表达菌株E.coli BL21（DE3）plysS
2. 含pGEX-6P-1表达质粒的表达菌株E.coli BL21（DE3）plysS
2.液体LB培养基
3.100mg/mL氨苄青霉素Amp
4. 1mol/L IPTG
实验步骤
1.挑取一含有pGEX-6P-1-mreB表达质粒的单菌落到1.5mL含有100μg/mLAmp
的液体LB培养基中，37度摇12小时。
2.挑取一含有pGEX-6P-1表达质粒的单菌落到1.5mL含有100μg/mLAmp的液体
LB培养基中，37度摇12小时。（这是不含目的基因仅含载体的对照）。
3.将培养的菌液1mL 接种于 200mL含有100μg/mLAmp的液体LB培养基中，37
0.6。
度摇至A
600
4.向其中一瓶加入IPTG至终浓度 0.4mmol/L ,另一瓶不加（对照），转至28
度诱导过夜。
5. 8000r/min 离心收集菌体细胞沉淀，四种类型分别做好标记，-20度保存。注（四种类型分别为： pGEX-6P-1-mreB转化菌诱导，pGEX-6P-1-mreB转化菌未诱导，不含目的基因的pGEX-6P-1转化菌诱导，pGEX-6P-1转化菌未诱导。）
Ⅱ SDS-PAGE检测表达蛋白
实验目的
通过本实验了解和掌握SDS-PAGE检测蛋白的基本原理和操作。
实验原理
SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合，把大多数蛋白质拆成亚单位，并带上阴离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异，所以SDS-PAGE消除了电荷效应，只有分子筛效应故蛋白质电泳迁移率完全取决于相对分子质量，迁移率与相对分子质量对数呈线性关系，在电场下，按相对分子质量大小在板状胶上排列。
仪器材料和试剂
（一）仪器
1.垂直板电泳槽及配套的玻璃板、封胶条、梳子
2.恒压恒流电泳仪
（二）材料与试剂
PBS缓冲液
2×LaemmLi样品缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl（pH6.8），4%SDS，0.02%溴酚蓝，20%甘油，临用前加入100μL巯基乙醇到900μL上样液中。
30%丙烯酰胺储液：丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺＝29：1 (W/W)，置于棕色瓶中于4℃，隔几月需重配。
分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-Cl pH8.8
浓缩胶缓冲液：1mol/L Tris-Cl pH6.8
10%SDS(W/V)(十二烷基硫酸钠)
10％APS（W/V）（过硫酸胺）：取0.1g APS定容至1mL，少量配制，隔周新配。
电泳缓冲液：3.03g Tris-base，14.4g Glycine，1g SDS，加蒸馏水至1L。
固定液：40％乙醇，10％乙酸
Blue silver染色液：
0.12％考马斯亮蓝G-250，10％（NH
4）
2
SO
4
，10％H
3
PO
4
，20％甲醇。
实验步骤
1．(1) 按上述方法诱导的菌，离心收集菌体，用PBS悬浮菌体；
(2) 超声破碎细胞，12,000 r/min离心分离上清和沉淀；
(3) 上清和沉淀与2×上样缓冲液1:1混匀，并在100℃水浴中煮10min，取
出待用。
(4)上清和沉淀分别跑SDS-PAGE，观察目的蛋白处于哪个组分，若在上清中
则为可溶性表达，若在沉淀中则为包涵体。
（1）把玻璃板放入制胶架上，架好胶板，用琼脂封底。
（2）按如下比例配好分离胶，混匀后立即加入到两玻璃板之间，到上口大于梳子插入的长度止，再加一层异丙醇，约30min等胶自然凝聚后倾斜倒出异丙醇，并用蒸馏水洗三次，倒干净蒸馏水。
混匀后立即加到分离胶上，在两玻璃板夹缝中水平插入1.5mm的梳子，用琼脂封住梳子两端。聚合后，把玻璃板放入电泳槽中，装好电泳缓冲液后小心拔出梳子。
4.丄样、电泳：将样品和标准蛋白分别加到样品孔中开始电泳，先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120V，直至溴酚蓝走至前沿为止。
5．固定染色：电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶在固定液中固定30min,用蒸馏水洗三次，每次10min,再将凝胶在染色液中染色2h。
实验结果
实验安排
第一天晚上挑菌落预培养
第二天：诱导表达
第三天：制胶，跑SDS-PAGE电泳检测。
实验三蛋白质印迹
实验目的
通过本实验了解蛋白质印迹的方法和操作要点。
实验原理
印迹法一般由：凝胶电泳；样品的印迹和固定化；各种灵敏的检测手段如抗原抗体反应等三大实验部分组成。
1.生物大分子凝胶电泳分离:蛋白质印迹法的第一步一般是将蛋白质进行SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,使待测蛋白在电泳中按分子相对质量大小在板状胶上排列。
2.分子区带的转移和固定：第二步就是把凝胶电泳已分离的分子区带转移并固
定到一种特殊的载体上，使之形成稳定的、经得起各种处理及容易检出，即容易和各自的特异性配体结合的固定化生物大分子。现用的最多的载体材料是PVDF聚偏氟乙烯膜，它们和生物大分子是非共价结合的。
3.特异性谱带的检出：印迹在载体上的特异抗原的检出依赖于抗体抗原的亲和
反应。即将酶、荧光素或同位素标记的特异蛋白分别偶联在此特异抗体的二抗上，再分别用底物直接显色、测荧光、放射自显影等方法检测我们感兴趣的抗原，考虑到如果无合适抗体用来检测抗原时，可用一般的蛋白染料，如丽春红，检测转移到膜上的蛋白，验证转移是否成功。
Ⅰ SDS-PAGE(见实验二Ⅱ)
Ⅱ电转移
仪器材料与试剂
（一）仪器
1.电泳仪
2.半干式转移电泳槽
3.脱色摇床
4.恒温振摇器
（二）材料与试剂
1．电转缓冲液：48 mmol/L Tris-HCl，39 mmol/L GLy，0.031% SDS，20%甲醇。
2．TBS缓冲液(pH 7.5)：0.02mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl。
3．TTBS缓冲液(pH 7.5)：在TBS基础上再加入0.05%（v/v） Tween-20。
4．封闭液：含5%（W/V）脱脂奶的TTBS缓冲液。
5．PVDF膜
6．DAB染色试剂盒
7．山羊抗小鼠IgG－HRP
8．抗MreB-GST多克隆鼠抗
实验步骤
1．电泳结束后，取出凝胶，切角做标记，浸泡于电转缓冲液中。
2．剪取与凝胶等大的PVDF膜，在甲醇中浸泡10s，再转至电转缓冲液中。取6张与海绵等大的滤纸和转移装置中的海绵浸泡于电转缓冲液中备用。
3．将3张滤纸整齐置于海绵上，再依次放上凝胶、PVDF膜、滤纸(3张)，注意赶尽气泡，边界对齐，然后用海绵、筛孔板固定，插入电转移槽中，并加入电转移缓冲液，保证凝胶在阴极方向，PVDF膜在阳极方向。100V电转1.5h。4．取下胶和膜，倒扣于滤纸上，用铅笔在膜上描出胶上点样孔位置，揭去胶，取下膜。
Ⅲ特异性普带的检出
实验步骤
1．封闭：将膜从电转槽中取出， TBS稍加漂洗，浸没于封闭液中37℃缓慢摇荡2h。
2．结合一抗：一抗用含4%脱脂奶粉的TTBS按适当比例稀释。倾去封闭液，加入一抗，室温（25℃）轻摇1h；
3．洗涤：一抗孵育结束后，用TTBS洗膜三次，每次5-10min。
4．结合二抗：二抗按1：8000用含4%脱脂奶粉的TTBS稀释，室温轻摇1h。
5．洗涤：同步骤（3）
6．用DAB显色液显色，到显色清晰时，用蒸馏水终止反应。
实验结果
实验安排
第一天：制好SDS-PAGE胶置于冰箱4℃。
第二天：SDS-PAGE,电转移，封闭
第三天：杂一抗，杂二抗，显色。
图3.融合蛋白表达纯化的SDS-PAGE分析
Fig 3.Expression Analysis of GST-tagged proteins by SDS-PAGE
M：蛋白质分子量标准
1、2：分别为pGEX-6P-1转化菌诱导前、后总蛋白；
3、4：分别为pGEX-6P-1-mreB转化菌诱导前、后总蛋白；
5、6：分别为转化菌菌体裂解物上清、沉淀；
7：割胶纯化后的GST-MreB
第2节基因工程及其应用 孝义三中高一生物组张文 一、教材内容分析 基因工程是现代四大生物工程之一。《基因工程及其应用》是人教版高中生物必修2第6章第2节内容。本节内容主要包括三个方面，分两课时讲授。第1课时简要介绍“基因工程的原理”，第2课时介绍“基因工程的应用”及“转基因生物和转基因食品安全性”。本节内容是对前面所学育种内容的补充，是即贴近生活又远离生活的微观内容。由于在选修3中还有基因工程的介绍，因此本节的要求相对简单一些。 二、学情分析 对于基因操作的工具和基本步骤，内容抽象和复杂，学生接触少，会出现掌握不好，甚至理解错误的情况。虽然经过必修1的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，尽量通过生活化打比喻的方式和模型建构活动及采用多媒体动画形象化教学，并在教师引导下适时加强学生解决问题和运用图解等生物学语言归纳结论等方面的能力。切记不可讲的太多。 三、教学目标 1、简述基因工程的基本概念； 2、简述基因工程的基本工具； 3、简述基因工程的基本操作步骤； 4、通过基因工程的简介，鼓励学生积极探索新知和科学创新，树立一分为二的辩证唯物主义思想； 四、教学重点、难点分析 教学重点：基因工程的基本原理（概念、工具、操作步骤） 教学难点：基因工程的基本原理 五、教学思路 本节课主要解决如下几个问题：1）什么是基因工程？2）基因工程的主要原理是什么？3）基因工程的操作过程如何？4）基因工程有哪些方面的应用？如何看待转基因食品？由于本节内容和前面的育种内容联系比较紧密，因此可以让学生回顾前面几种育种方法的成果，再通过情景展现传统育种方法所不能达到的地方，进而引出基因工程，通过列举生活中的转基因成果让学生知道基因工程就在我们身边。而后通过与学生们所熟知的器官移植做对比，让学生理解基因工程的本质和操作过程。通过对转基因食品的讨论让学生树立辩证唯物主义观念。 六．教学策略及教学媒体 根据激趣原则，通过展示色彩绚丽的转基因生物图片入手，引出基因工程的概念，采取“引导—互动—探究”模式，即采用师生互动探究式教学，借助老师生活化打比喻和多媒体动画并安排学生制作模型活动从而使抽象的课程内容具体化，直观化和形象化。 七、教学设计流程图第1课时“基因工程的原理”
基因工程实验 教学方案 湖南人文科技学院生命科学系生物技术教研室 指导教师：吴娟
实验一重组质粒的提取及转化表达型菌株 Ⅰ质粒DNA的提取 实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。 实验原理 1．碱变性法基本原理是，在Ph12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。 2．设计构建体外重组DNA分子 构建体外重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源DNA基因。构建体外重组DNA分子，最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解，产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率高，也易于筛选处重组子。 附表达载体pGEX-6P-1-mreB的构建图：
仪器材料与试剂 （一）仪器 1．恒温摇床 2．台式离心机 3．漩涡混合仪 （二）材料与试剂 1．含pGEX-mreB质粒的大肠杆菌DH5α 2．含pGEX质粒的大肠杆菌DH5α 3．液体LB培养基 4．100mg/mL氨苄青霉素Amp 5．新捷质粒提取试剂盒 实验步骤 分为两组：一组提取质粒pGEX-mreB，另一组提取质粒pGEX。 1）12000rmp 离心30秒收集1-5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入250ul 已加入Rnase A的Buffer Ⅰ, 充分悬浮细菌沉淀。 2）加入250ul Buffer Ⅱ, 温和并充分地翻转离心管4-6次。 3）加入350ul Buffer Ⅲ,温和并充分地翻转离心管4-6次。 4）13000 rmp 离心10分钟。 5）将核酸纯化柱置于2ml 离心管中，转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rmp离心30秒。 6）弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ul Buffer W2,盖上管盖，12000rmp离心30秒。 7）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化住置回到2ml离心管中，14000 rmp离心1分钟。 8）弃2ml离心管，将核酸纯化住置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50-100ul Buffer TE ,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rmp离心30秒。 9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-20℃。 实验结果 实验安排 3个小时
2021年-2022年最新【优化设计】2015-2016学年高中生物 1.3基因工程的应用教案新人教 版选修3 教学建议 1.本节可将教材中提供的实例列表总结,给出具体的转基因生物,指导学生整理教材中提供的信息,填写出相应的目的基因及其来源,增强学生分析、处理信息的能力。 2.将“基因工程的概念与原理”与本节内容一起学习,加强学生对基因工程概念的理解,通过一个又一个转基因生物实例,能更好理解“DNA分子水平”“定向改造生物性状”“基因重组”等基因工程这一概念中的关键词。既能学好概念,反过来又能帮助学习基因工程的实例。 3.教材中的一些难点,如关于乳腺生物反应器、工程菌、基因治疗等,可适当讲解。关于乳腺生物反应器,其基本过程与其他转基因动物操作过程相同,不同之处可单独提出,如需要使用乳腺组织中特异表达的启动子。关于工程菌,可结合基因工程操作程序以及微生物生长和代谢的特点,说明用其生产药物的优越性。关于基因治疗,可结合教材中的具体实例归纳出大致治疗过程。 参考资料 基因治疗 1.基因治疗的定义 基因治疗狭义上指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因,从而达到治疗疾病的目的。而广义上指把某些遗传物质转移到患者体内,使其在体内表达,最终达到治疗某种疾病的方法。 2.基因治疗的分类 (1)基因治疗按基因操作方式分为两类,一类为基因修正和基因置换,即将缺陷基因的异常序列进行矫正,对缺陷基因精确地原位修复,不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组即基因打靶技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组,从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强和基因失活,是不去除异常基因,而通过导入外源基因使其表达正常产物,从而补偿缺陷基因等的功能;或特异封闭某些基因的翻译或转录,以达到抑制某些异常基因表达的目的。 (2)按靶细胞类型又可分为生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗。广义的生殖细胞基因治疗以精子、卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。由于当前基因治疗技术还不成熟,以及涉及一系列伦理学问题,生殖细胞基因治疗仍属禁区。在现有的条件下,基因治疗仅限于体细胞基因治疗。 3.基因治疗的基本步骤 (1)目的基因的转移:在基因治疗中迄今所应用的目的基因转移方法可分为两大类:病毒方法和非病毒方法。基因转移的病毒方法中,RNA和DNA病毒都可用作基因转移的载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的基本过程是将目的基因重组到病毒基因组中,然后让重组病毒感染宿主细胞,以使目的基因能整合到宿主基因组内。非病毒方法有磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等。 (2)目的基因的表达:目的基因的表达是基因治疗的关键之一。为此,可运用连锁基因扩增等方法适当提高外源基因在细胞中的拷贝数。在重组病毒上连接启动子或增强子等基因表达的控制信号,使整合在宿主基因组中的新基因高效表达,产生所需的某种蛋白质。 几个重要概念 1.干扰素:是指动物或人体受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白,几乎能抵抗所有病毒引起的感染。 2.外毒素:病原体产生的代谢产物,成分是蛋白质,抗原性强,刺激人体产生抗毒素。 3.抗生素:以前称抗菌素,微生物(细菌、真菌、放线菌)产生的代谢产物,干扰其他微生物细胞生长、发育,用于治疗细菌感染。 1
《神奇的基因工程》教学设计 【教学目标】 科学探究 1．能查找资料了解人类在哪些领域利用了基因工程技术。 2．能进行关于转基因食品的调查并制成资料卡。 3．能设想基因技术新产品。 情感、态度、价值观 1．关心日常生活中的科技新产品、新事物。 2．感受科技进步给人们生活带来的方便，并激起创新的意识。 科学知识 1．知道基因是控制遗传特征的物质。 2．初步了解基因工程技术的利用情况。 【教学重、难点】 教学重点：引领学生从高新技术（基因工程）的角度来进一步了解遗传规律的应用 教学难点：能初步应用“基因”、“基因工程”、“基因重组”、“转基因食品”等科学名词正确描述相对应的事物。 【教学准备】 基因工程技术的利用（如：基因重组、抗虫棉）、转基因食品等方面的资料，转基因食品调查表等。 【教学设计】 第一课时 一、导入新课： 1、同学们，孟德尔假说中的‘遗传因子’是什么？人们现在是否已经证明它的存在？ 2、学生回答。 3、老师告诉学生：遗传特征是靠遗传物质控制的，经过很多科学家的研究，终于找到了控制遗传特征的物质——基因。
4、西红柿的味道是怎样的？牛肉的味道呢？能不能让西红柿有牛肉味道呢？假如你是一位基因工程学家，你有什么办法吗？ 二、阅读：基因工程技术的利用 1、你知道“基因工程”、“基因重组”这样的科学名词是什么意思吗？若学生不知道的话，老师予以讲解。 2、学生自由阅读书上P60页的资料。 3、通过阅读，你都知道了些什么？ 你是怎样理解基因工程技术的？ 4、补充资料： （以电子幻灯的形式以图文结合的方式讲解） 基因工程技术。 基因工程又叫重组DNA技术，重组是指在体外将分离到的或合成的目的基因（object gene）,通过与质粒、病毒等载体（vector）重组连接，然后将其导入不含该基因的受体细胞(host cell)，使受体细胞产生新的基因产物或获得新的遗传特性。基因工程的应用基因工程再种植养殖医疗保健和环境保护方面有广泛得应用，首先再农业方面我国得转基因植物是借助863计划迅速发展起来得，主要集中再品种得改良如抗虫抗逆等等，目前以上市得转基因农作物有抗除草剂基因大豆、抗虫基因玉米、抗病毒基因油菜、抗病毒土豆、还有我们刚才讲到的转抗虫基因棉花，目前种植面积最大的是转基因大豆和棉花最为多见。 转基因动物得研究也是如火如荼，首先是再小鼠中获得成功，现在研究集中在家禽家畜的品种改良方面，以期获得快速生长、品质优良得家禽和家畜，还可以利用转基因动物来生产药物和观赏，首个成功得转基因动物，小鼠转入了大鼠得生长激素基因，结果个头比一般得要大一倍多，转基因瘦肉型猪和高产得奶牛快速生长得鱼也已进入实用阶段，除了品种改良以外，转基因动物也可以用来代替发酵罐生产珍贵的蛋白质，原理就是使外源基因在乳腺细胞中表达，再从乳汁中提取所需要的蛋白质，例如一头绵羊一年可相当于一个一吨得发酵罐，还不需要水、电和一仪器起设备等等。 基因工程再医疗方面得贡献主要是生产基因工程药物和基因治疗，基因工程药物是利用基因工程技术生产的药物，很多种珍贵得药物都是用这种办法生产
《基因工程》实验指导 湖南师范大学生命科学学院 遗传与发育生物学系 2009年5月
基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。 二、实验原理 转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。 三、材料
限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品； 3. 2菌株及细胞系 DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃； 3. 3 质粒与表达载体系统 3. 3.1 pEGFP-N1载体 pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。含有人类巨细胞病毒（CMV）启 图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒 动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内
高中观察细胞的基本结构实验教学教案 SANY GROUP system office room 【SANYUA16H-
实验教学 第一单元第二章第二节 观察细胞的基本结构 济南二中王震 一、教学目标 知识目标： 1．说出观察黑藻叶绿体和观察鸡肝细胞中线粒体的原理。 2．描绘叶绿体和线粒体的形态。 3．概述细胞的基本结构。 能力目标： 运用学生分组设计实验，培养学生观察、分析的能力。 情感目标： 学生参与实验，养成团队合作意识。 二、教学重点 使用高倍镜观察叶绿体和线粒体的形态。 三、教学难点 使用高倍镜观察叶绿体和线粒体的形态。 四、教学方法 采用实验与讨论相结合的方式进行教学。 五、材料准备 略。 六、教学过程
1．实验一：观察黑藻的细胞结构以及叶绿体的形态和分布 (1)指导学生取黑藻一片幼嫩的小叶放在载玻片上的水滴中，教师提问：为什么要放在水滴中？启发学生回答如果叶绿体失水，就缩成一团，无法观察叶绿体的形态和分布。 (2)现在装片已经制成，教师提问：怎样操作显微镜才能正确观察细胞的的基本结构和叶绿体的形态与分布呢？指导学生正确使用，应使低倍镜正对通光孔，光线强时，用平面镜对准光源；光线弱时，用凹面镜对准通光孔。然后用左眼向目镜内注视，右眼睁着（以便看着绘图），当从目镜内可以看到一个明亮的圆形视野即对光完毕。 （3）请同学们通过用低倍显微镜观察黑藻叶片的细胞结构，并说出名称。 （4）教师引导学生通过换用高倍镜观察叶绿体的形态和分布。 得出结论：细胞的基本结构有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核和液泡等；叶绿体是扁平的椭球形或球形，颜色为绿色。在细胞质的基质中，叶绿体是不断流动的。 2．实验二：观察鸡肝细胞中的线粒体 （1）指导学生取材。取一小块鸡肝放在小培养皿中，用林格氏液洗净。 （2）老师启发学生，线粒体与其他细胞结构颜色是一直的，为了能更好的观察线粒体的结构，我们该怎么办？学生回答染色。是不是把鸡肝全部染色呢？学生回答不是，染一半，留一半起对照作用。 （3）继续启发学生，组成鸡肝的细胞有很多，那么在观察鸡肝细胞中线粒体的时候，如果不经过特殊处理，那么应该看到什么现象？学生回答细胞相互重叠在一起。那么怎么处理呢？通过启发学生得出在观察之前，应该把细胞相互游离出来。老师告诉同学实验室用眼科剪将肝组织剪碎，使细胞相互分离的。
课例研究教案 （精品教案） 基因工程及其应用 授课人： 日期：
高中生物《分子与细胞》 第6章第2节 基因工程的工具 学习者水平分析： 本节课授课对象是高二年级学生。通过上一节课的学习，学生已经学习了基因工程的概念，为本节课的学习奠定了知识的基础，但是基因工程的工具是基于分子水平上的，知识内容抽象，学生难以直接进行实践操作和直观看到操作结果，加之该部分是本节的重难点，学生理解和学习起来较为困难。 教学内容分析： 基因操作的工具是本节内容的重难点，也是在基因工程概念的学习基础之上进行的，对接下来基因工程的步骤的学习起关键的作用，基因操作的工具包括基因的剪刀—限制性核酸内切酶；基因的针线—DNA连接酶；基因的运载体。基因操作的工具细微抽象，较难理解与应用。 教学目标： 1.知识目标：1）阐明限制酶和连接酶的作用特点。 2）说出常用的运载体及其特点。 2.能力目标：运用基因工程的基本工具，培养分析、推理、归纳、总结等思维能力。 3.情感态度与价值观目标：1）参与基因工程相关热点问题的讨论。 2）养成创新思维，培养科学思考问题的能力。 教学重点： 1.阐明限制酶和连接酶的作用特点。 2.说出常用的运载体及其特点。 教学难点：阐明限制酶和连接酶的作用特点。 教学方法：讲授法，谈话法，讨论法，演示法。 教学媒体：幻灯片，教具，教学动画演示。
教学过程： 教学环节教师行为学生行为设计意图 导入新授新闻：中国农科院专家郭三堆，因 成功研制具有自主知识产权的三 系杂交转基因抗虫棉，而当选为 CCTV 2013年度科技创新人物。 想一想：将抗虫基因移植到棉花的 细胞中，使棉花具有抗虫害的作 用，这项工作是在DNA分子水平上 进行的操作。假如你作为一名研究 者来完成这一项工作，那么你会采 取什么工具呢？ 带着这些问题，我们开始本节课的 学习，第六章第2节第二课时基因 工程的工具。（板书） 通过预习，基因工程有三大基因的 工具，基因的剪刀，基因的针线， 运载体。接下来我们逐一进行学习 首先我们要把抗虫基因从苏云金 芽孢杆菌中提取出来，抗虫基因是 苏云金芽孢杆菌中的一段基因，要 获取抗虫基因是不是相当于用一 把剪刀把它从一大段基因中截取 下来呢？但是细胞是很小的，一般 直径只100nm到150nm，用剪刀剪, 显然是不现实的，那我们怎么办 呢？这就要用到基因工程的第一 结合实例，回顾相关知 识，思考问题。 思考要完成转基因抗虫 棉要用到的工具。 思考基因的剪刀—限制 性核酸内切酶的作用特 点。 结合新闻，联系旧知 识，引发对本节课内 容的思考，激起学生 好奇心。 启发学生思考。 引出基因的剪刀— 限制性核酸内切酶 的学习。
《基因工程及其应用》教学设计 一、总体设计指导思想 本节课突出对学生科学素质的培养，精心设计课堂教学，将科学探究的过程作为本节课的教学主线，以求让学生亲身参与、体验科学探究的过程，从而培养学生的科学精神和科学素养。 二、教材分析 基因工程是现代生物科技中的热点，逐渐对人类的生产和生活产生巨大的影响，所以该内容被录入了现行的高中生物必修教材中，并且在选修教材中有更详细的阐述。学习这一内容，既有助于学生对这一前沿科技的了解，也能让学生对科学、技术、社会三者的关系有更深入的理解，还能为学生的人生规划和发展提供一种新的视角。本课学习的基因工程操作的原理及教材概括的基本步骤：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的表达与检测这四个步骤，都可以在必修1和必修2中找到理论基础。但基因工程是在分子水平的操作，操作过程细微，抽象，实验现象看不见也摸不着，只凭教师讲述是很枯燥并较难讲清，学生也难以理解。教学内容的呈现还具有一定的开放性，展示了对转基因食品安全性问题认识的不同观点，引导学生对转基因生物和转基因食品的安全性问题的关注、思考和交流。 三、教学目标 （一）知识与技能 ①知道基因工程的概念 ②掌握基因工程操作的基本工具 ③理解基因工程操作的基本步骤 ④举例说出基因工程的应用 （二）过程与方法 ①通过对概念、原理、方法的理解和掌握，逐步形成分析、综合等思维能力，具备运用学到知识评价和解决实际问题的能力。 ②通过引导学生网上探究，引导学生主动参与，培养收集处理信息的能力、分析和解决问题的能力及交流与合作的能力。 （三）情感态度与价值观 ①形成结构与功能相统一的基本观点。 ②培养理论联系实际的良好学风，培养爱国主义热情。 ③关注科学与社会。
第2课时 ●教学过程 ［课前准备］ 1.教师准备 （1）教师将听证会规则、程序、角色扮演的程序和具体要求以及评价标准复印好，分发给各学习小组。 （2）教师整理《转基因生物和转基因食品利弊争论的要点》，印发给各学习小组。 （3）收集转基因生物和转基因食品安全性的资料信息，转基因生物技术的利弊关系的资料，请有关专家学者到学校做有关基因工程知识的讲座。 （4）教师设计并参与制作计算机教学课件，在校园网上制作网页，查找大量资料，完善网页内容，建立内容丰富的“基因工程知识资源库”。 （5）教师根据学生的资料准备状况、知识的准确性、抢答的积极性、讲述的条理性、姿态的自然性、课件的美观性编制《学生听课记录和评价表》。 （6）教师编制《研究性学习课题研究专题报告》。 2.学生准备 （1）学生预习教材，对教材中的内容做宏观地了解。 （2）利用课余时间，通过看书、看报及看电视，收集有关基因工程的成果与发展前景的资料或信息并制成课件，也可以走访有关的专家、学者了解该内容。 （3）分组预习并完成教师下发的有关资料。 （4）按听证会的要求摆好课桌椅，根据各小组的选择按辩论的正方和反方分成左右两个大组。 ［情境创设］ 教师：通过课件向学生展示基因工程给人类带来巨大成就的图片。同时述说如下：基因工程自1973年诞生后，由于基因工程技术具有可以直接控制基因，将基因从一个物种转移至另一个物种，创造出新的物种或新的品种的显著特点，也就是说，可按照人们的主观愿望，创造出自然界中原先并不存在的新的生物类型，使人类从单纯地认识生物和利用生物的传统模式跳跃到随心所欲改造生物和创造生物的新时代。经过30多年的发展历程，取得了惊人的成绩，特别是近10年来，基因工程的发展更是突飞猛进。基因转移、基因扩增多技术的应用，不仅使生命科学的研究发生了前所未有的变化，而且在实际应用领域中，为农牧业、食品工业、医药卫生、环境保护等方面开拓了广阔的发展前景。 今天就由同学们来阐述自己的认识和看法。 ［师生互动］ 教师：首先请各小组汇报课前收集到的有关基因工程应用的事例资料。 学生分组汇报并交流课前收集资料的情况。 学生1：基因工程在农业上的应用主要表现在两方面： （1）通过基因工程技术获得高产、稳产和具有优良品质的农作物。 （2）用基因工程的方法可培育出具有各种抗逆性的作物新品种。现在已培育出一批分别具有抗病、抗虫、抗除草剂、抗盐碱、抗病毒、抗干旱等性状的转基因农作物。1996至2000年的短短五年间，全球转基因作物从170×104 hm2发展到4 420×104 hm2，其推广速度是前所未有的…… 学生2：基因工程在畜牧养殖业中的应用 基因工程在畜牧养殖业上的应用也具有广阔的前景，科学家将某种特定基因与病毒DNA构成重组DNA，然后，通过感染或显微注射技术将重组DNA转移到动物受精卵中，并由这种受精卵发育成新个体，这就是我们在前面提到的转基因动物。通过转基因动物人们
《基因工程综合实验》教学大纲 学时：54学时学分：3学分课程性质：必修 实验个数：7个适用专业：生物技术，生物工程大纲执笔人：朱常香大纲审定人：郑成超 一、实验课的性质与任务 本课程是一门专业实验课。该课程以植物基因工程的研究程序为主线，综合了目的基因的分离、克隆，载体的构建，目的基因转化、转基因植株的鉴定等方面的实验内容，在注重专业性和可操作性的前提下突出先进性和系统性，加强教学内容的选择性。通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握基因工程的实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。 二、实验的目的与要求 本课程的目的是培养高年级本科生及研究生进行基因操作的能力。教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果，学会正确书写科学报告（论文）。
三、实验项目及内容提要
四、实验报告的格式 实验报告的撰写要求使用专用实验报告纸。实验报告的内容应包括：实验目的，实验的基本原理，实验用的仪器设备及试剂，实验操作程序，实验结果，实验应注意事项。 五、本课程考核方式、方法及实验成绩评定方法 考核可采取闭卷、开卷、课程论文等形式，或多种形式相结合，对学生的学习情况做出全面科学的评价。 成绩评定把学生的实际动手能力放在重要地位。根据考试情况、实验报告撰写情况及平时表现给予综合评定。 六、实验应配套的主要仪器设备及台（套）数
附：教学参考书目 1、使用实验指导 《基因工程综合实验》操作手册。温孚江，朱常香，宋云枝等，2003。 2、参考书目 （1）《分子克隆实验指南》（第三版）。J·萨姆布鲁克，D·W·拉塞尔著，黄培堂等译。科学出版社，2002。 （2）《基因工程原理与技术》。王关林，方宏筠主编，科学出版社，1998。
基因工程及其应用》教学设计 一、总体设计指导思想 本节课突出对学生科学素质的培养，精心设计课堂教学，将科学探究的过程作为本节课的教学主线，以求让学生亲身参与、体验科学探究的过程，从而培养学生的科学精神和科学素养。 二、教材分析 基因工程是现代生物科技中的热点，逐渐对人类的生产和生活产生巨大的影响，所以该内容被录入了现行的高中生物必修教材中，并且在选修教材中有更详细的阐述。学习这一内容，既有助于学生对这一前沿科技的了解，也能让学生对科学、技术、社会三者的关系有更深入的理解，还能为学生的人生规划和发展提供一种新的视角。本课学习的基因工程操作的原理及教材概括的基本步骤：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的表达与检测这四个步骤，都可以在必修1和必修2中找到理论基础。但基因工程是在分子水平的操作，操作过程细微，抽象，实验现象看不见也摸不着，只凭教师讲述是很枯燥并较难讲清，学生也难以理解。教学内容的呈现还具有一定的开放性，展示了对转基因食品安全性问题认识的不同观点，引导学生对转基因生物和转基因食品的安全性问题的关注、思考和交流。 三、教学目标 （一）知识与技能 ①知道基因工程的概念 ②掌握基因工程操作的基本工具 ③理解基因工程操作的基本步骤 ④举例说出基因工程的应用 （二）过程与方法 ①通过对概念、原理、方法的理解和掌握，逐步形成分析、综合等思维能力，具备运用学到知识评价和解决实际问题的能力。 ②通过引导学生网上探究，引导学生主动参与，培养收集处理信息的能力、分析和解决问题的能力及交流与合作的能力。 （三）情感态度与价值观 ①形成结构与功能相统一的基本观点。 ②培养理论联系实际的良好学风，培养爱国主义热情。 ③关注科学与社会。 四、教学重难点
6.2基因工程及其应用教学设计案例 基因工程及其应用 --案例 一、教学目标的确定 课程标准中与本节内容相对应的具体内容标准是："关注转基因生物和转基因食品的安全性"，这也是本节要达成的主要教学目标。课程标准并未明确指出本章要讲述基因工程的内容，考虑到本章教材知识体系的完整性，以及学生达成上述目标所需要的知识基础，本节还将"简述基因工程的基本原理"，"举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用"作为教学目标。 二、--思路 第一课时--流程图如下。 第二课时--流程图 如下。 三、教学实施的程序 教师组织引导 学生活动 教学意图 教师通过图 片和音像资料展示基因工程产品，如种子、水果、疫苗或药物等，
引入课题。教师利用"问题探讨"，提出问题，组织学生讨论、交流看法。 ·为什么能把一种生物的基因"嫁接"到另一种生物上？ ·推测这种"嫁接"怎样才能实现？ ·这种"嫁接"对品种的改良有什么意义？ 教师小结：从杂交育种的局限性切入，人类可以利用基因工程技术按照自己的意愿直接定向改变生物。说明本节教学目标。 教师肯定学生合理的想法，引发思考。 "你的想法很好，可是用什么样的方法才能实现你的设想呢？" 教师用类比的方法引导学生思考基因工程的大致步骤和所需要的工具：剪刀、针线、运载体等。并用问题启发学生："你能想像这种‘剪刀加浆糊’式的‘嫁接’工作在分子水平的操作，其难度会有多大吗？" 以ecor i为例，构建重组dna分子模型，体会基因的剪切、拼接、缝合的道理。教师交代清楚ecor i是已发现的500多种限制性内切酶中的一种，它是一种从细菌中发现的能在特定位置上切割dna分子的酶。它的特殊性在于，它在dna 分子内部"下剪刀"，专门识别dna分子中含有的"gaattc"这样的
基因工程实验 实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化 试剂 A.LB液体培养基（L）: 1000ml 蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（yeast extract）5g, NaCl 10g, 加去离子水至1000ml 用5MNaOH调至pH7.2-7.5。121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。 B.LB固体培养基（L）： 每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。 C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。 Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。 D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。 E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS. F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml. G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/L NaCl, 终浓度为10mg/ml。100 o C加热15分钟，冷却后分装。 H.饱和酚：市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的 0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提， 使pH达到7.6以上。 I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。 J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。 K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。 三、操作步骤 1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含 50μg/ml Amp）中，37 o C培养约12小时至 对数生长后期。 2．质粒DNA的少量快速提取---碱裂解法 A.取1.5ml培养液倒入1.5ml ependorf 管中，4o C下12000g离心3min。 B.弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。 C.菌体沉淀重悬浮于100μl预冷的溶液I中（激烈震荡，充分混匀）。 D.加入新配制的溶液II 200μl，快速盖紧管口，并倒置离心管，温和颠 倒ependorf管6-8次，以混匀内容物（千万不要震荡）,放置5分钟。 E.加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒
DNA重组技术基本工具的教学设计 设计思路 “DNA重组技术的基本工具”这节课位于人教版高中生物选修三第一专题第一节第二课时。基因工程是现代生物技术的核心内容，通过模拟DNA重组过程，将具体的操作程序有机联系起来，加深对这一程序的理解，有利于提高学生的认知水平和接受能力。针对重点难点对教学内容进行结构化处理，并与基因工程的实际操作练习起来；在模拟探究的过程中不断生成问题，引导学生依据载体的特点，按照相似性原理，选择和建立模型，进而对模型进行“剪”与“连”等操作，并分析操作结果。 教学分析 1．教材分析 重点：DNA重组技术的三种基本工具 难点：载体的特点及应用 2．学情分析 通过上一节课的学习，学生们已初步掌握了“DNA重组技术的基本工具”有哪些，其作用是什么。但这些基本工具在实际应用中如何发挥作用，是非常抽象的内容，仅仅靠学生的想象，很难真正理解并融会贯通；同时，中学生的心理发育特点，决定了他们更乐于通过实际动手操作来解决遇到的问题，同时对自己新发现的问题有更加强烈的探究欲望。 3．教学条件分析 对于本节课的教学设计而言，需要如下教学条件：电脑，投影仪，彩色复印纸，剪刀，双面胶。 教学目标 简述基因工程原理及基本操作程序 掌握基因工程基本操作程序的四个步骤 通过动手操作、小组合作，提高学生自主学习及合作探究的能力。 教学策略与手段 教学模式：探究式教学，通过创设问题情境，在分析问题、解决问题的过程中不断生成一系列新的问题，培养学生的自学能力，以及探究和思维能力。 教学策略：利用教学多媒体，自制教具，使抽象的问题形象化，引导学生自主动手操作，解决每一程序中的技术难点和重点。 教学手段：PPT，自制教具，投影仪等综合教学辅助工具。本节课模拟探究的是载体与目的基因的连接，所以将教材提供的碱基序列加以调整，用彩色打印纸打印，如图：
基因工程第1、2节练习 1．下列何种技术能有效地打破物种的界限,定向地改造生物的遗传性状,培育新的农作物优良品种 A ．基因工程技术 B ．诱变育种技术 C ．杂交育种技术 D ．组织培养技术 2．科学家已经能够通过基因工程的方法，能使番茄果肉细胞中含有人奶蛋白。以下有关该基因工程的叙述错误的是（ ） A ．采用反转录的方法得到的目的基因有启动子、终止子 B ．用同种限制酶处理质粒和含目的基因的DNA ，可产生相同的黏性末端而形成重组DNA 分子 C ．番茄的叶肉细胞可作为受体细胞 D ．启动子对于目的基因在番茄的叶肉细胞中的表达是不可缺少的 3．质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置（插入点有a 、b 、c ），请根据表中提供细菌的生长情况，推测①②③三种重组后的细菌的外源基因 A ．①是c ；②是 b ；③是a B ．①是a 和b ；②是a ；③是b C ．①是a 和b ；②是b ；③是a D ．①是c ；②是a ；③是b 4．在DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在 DNA 上定位，使其成为 DNA 分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶 HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个 4kb （1kb 即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。 据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA 分子上的限制位点数目是以下哪一组？ 2 代表的为抗氨苄青霉素基因
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为～L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA
实验教学设计
当堂训练 1、下图表示“制作洋葱鳞片叶内表皮细胞临时装片”实验的部分操作步骤，步 骤②和④滴加的液体分别是（） 师生互动 技能巩固 A．碘酒、清水B．清水、碘酒C．碘液、清水D．碘液、生理盐水 2、制作的洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片放在显微镜下用低倍镜观察，先转动粗 准焦螺旋，如果物像不够清晰，再转动______，直到看到清晰的物像。若在视野 中看到的物像位于视野的左下方，要把物像移到视野的中央，载玻片应向______ 方向移动。 3、盖盖玻片的方法不恰当，很容易出现气泡，影响观察效果。下列四种盖盖玻 片的方法中，最不容易出现气泡的是(图中半扁圆形结构代表水滴，箭头代表盖 盖玻片的方向) ( )
学生实验报告 实验导学（一）+操作考核评分表 制作临时装片观察植物细胞，我们可以选择洋葱、黄瓜等材料，通常我们选择洋葱作为材料来进行观察。在制作洋葱鳞片叶内表皮临时装片时要注重把握以下几个步骤，自主学习P43“制作洋葱鳞片叶内表皮细胞临时装片”完成填空，并讨论标注每个步骤的关键动词（建议用异色笔）。
典型题例探讨 1、使用碘液处理洋葱鳞片叶内表皮细胞的目的是什么？ 2、怎样区分显微镜视野中的气泡和细胞？ 选做实验导学（二） （7）、制作黄瓜表层果肉细胞临时装片时，先在洁净的载玻片中央滴一滴（），然后用小刀将洗净的黄瓜表皮刮掉，再用清洗后的小刀轻轻刮取少许黄瓜表层（），用清洁牙签刮取均匀（）在载玻片上的水滴中，盖好盖玻片，制成临时装片。 拓展讨论 根据老师出示四幅实验操作中的显微投影图片（洋葱内表皮临时装片染色+未染色，黄瓜果果肉表层细胞临时装片染色+未染色）讨论：它们有哪些相似的结构？不同材料制作临时装片时是否有必要都进行染色？ 师生互动，巩固提升 1、下图表示“制作洋葱鳞片叶内表皮细胞临时装片”实验的部分操作步骤，步骤②和④滴加的液体分别是（） A．碘酒、清水B．清水、碘酒C．碘液、清水D．碘液、生理盐水 2、制作的洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片放在显微镜下用低倍镜观察，先转动粗准焦螺旋，如果物像不够清晰，再转动______，直到看到清晰的物像。若在视野中看到的物像位于视野的左下方，要把物像移到视野的中央，载玻片应向______方向移动。 3、盖盖玻片的方法不恰当，很容易出现气泡，影响观察效果。下列四种盖盖玻片的方法中，最不容易出现气泡的是(图中半扁圆形结构代表水滴，箭头代表盖盖玻片的方向) ( )
基因工程实验(答案)
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开
始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase 活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。