果蝇染色体标本制备

（五）压片
染色完成后，将旧的染色液吸去， 加新的50μl染色液，盖上干净的盖玻 片，并覆一层滤纸用大拇指均匀用力 压片。（注意不要使盖玻片移动，也 勿用力过大压碎载玻片。） 注意：压片时适当多加些染液有 利于染色体臂的伸展，但要防止染液 过多而造成材料随染液而溢出。
（六）镜检
在低倍镜选择唾腺细 胞多且染色体分散好的视 野，再转换高倍镜仔细观 察唾腺染色体的染色中心、 染色体臂和横纹以及可能 有的疏松区或因易位而形 成的十字形图象和因倒位 而形成的倒位环等各种结 构。
（二）取唾腺
从瓶壁或培养基表面挑取一只 肥大的三龄幼虫，在盛有水的培 养皿中清洗身上的污物，把幼虫 放在干净载玻片上，并滴0.7%的 生理盐水，在4倍镜下辨认头部 和尾部。头部稍尖，并且有一黑 点即口器，不时地摆动。
每人做两张标本 片，可先做一张， 在染色等待时间 再做另一张。
一手用解剖针或压住头部，将虫固 定，一手用摄子夹紧幼虫下半部（尾端 1/3处），轻轻向两端拉开，唾腺随头 部拉出。唾腺一对透明的球棒状腺 体，前端较细，后端粗钝，有时成对
果 蝇 唾 腺 染 色 体 模 式 图
X
ⅢR
Ⅳ ⅡL
染色中心
ⅡR
ⅢL
五、注意事项
1. 一定加生理盐水，否则唾腺易干。 2. 将脂肪组织清除干净。 3. 水不可太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。 4. 染色时间不可过长，否则背景也着色。 5. 压片时用力要均匀。 6. 染色完以后，将旧的染色液吸去，加新的 染色液，再压片。 7. 吸水时勿将唾腺一起吸走。
粘在一起成“V”字型，其外侧有时附 有乳白或淡黄色的脂肪（不透明）。
如果唾腺被拉断或未被拉出，可用解剖 针在头部或身体处把其挤压出来。
唾液腺
头部口器
脂肪带
挑出唾液腺
唾腺
肠道
头
尾
唾腺
唾腺与肠道的区别
在4倍显微镜下，可见一对半 透明、隐约可见细胞界限的囊状物— —唾腺。移去虫体其余部份，用解 剖针剔除附在唾腺一侧深色泡沫状 的脂肪体，以保证制片质量。若载 片上杂质较多，可用生理盐水适当 冲洗，用吸水纸吸去多余的生理盐 水。 注意：在整个剥离过程中，不能让 载玻片上的生理盐水干涸，否则唾 腺收缩而不易剥离；冲洗残渣和吸 去多余水液时，要避免唾腺被吸水 纸吸走。
三、实验用品
（一）实验材料 果蝇的三龄幼虫。 （二）实验器具 生化培养箱、高压灭菌锅、双筒解剖镜、显微镜、 镊子、解剖针、培养瓶、量筒、载玻片、盖玻片、 棉塞、纱布、橡皮筋、玻棒、烧杯、滴瓶、滤纸。 （三）药品试剂 0.7％氯化钠（NaCl），1mol/L HCl；改良苯酚品 红染色液；果蝇培养基等。
实验五 果蝇唾腺染色体标 本的制作和观察
一、实验目的
练习取出果蝇幼虫唾腺的技术和制 作唾腺染色体标本的方法； 了解体细胞染色体联会现象，观察 果蝇唾腺染色体的形态特征，并根 据唾腺染色体上横纹的形态和排列， 识别不同的染色体。 识别染色体结构变异的细胞学表现。 练习绘制多线染色体图
二、实验原理
本世纪初，D.Kostoff用压片法首先在果蝇 （Drosophila melanogaster）幼虫的唾液腺 细胞核中发现了特别巨大的染色体——唾液腺 染色体（salivary gland chromosomes）。 由于它具有许多重要特点而成为细胞遗传学、 发生遗传学、进化遗传学和分子遗传学研究中 不可多得的好材料。
四、实验操作
（一）幼虫培养
实验前的两个星期，每一个培养瓶放1～2对果蝇 （♀、♂），控制产卵数量，18～20℃条件下饲养。幼 虫要生长肥大，才能获得较大的唾腺。
培养要求： ①饲料松软，含水量较高，营养丰富，发酵良好。 ②追加母液。在一龄幼虫出现后，将成虫移入另 一培养瓶中，在饲料表面滴加低浓度的酵母液（2 ％～4.5％），每天滴加1～2滴；2龄～3龄幼虫时 期适当增加酵母液的浓度（约10％左右）；滴加的 量以覆盖在饲料表面薄薄的一层为宜。 ③控制幼虫的密度。一般情况下，培养瓶中10对成 虫交配后在12h左右必须将成虫转移，一般要求每 cm2培养基表面20～40只幼虫左右。 ④低温培养：稍低的温度有利于幼虫的充分生长发 育，一般15℃～18℃较为合适。
七、作业 制效果较好的唾腺染色体临时片 1张。 绘出你在显微镜下所看到的的果 蝇唾腺染色体略图，并仔细描绘 各染色体臂末端５～１０条横纹， 标明实际标本在观察中所能分辨 的典型部位。
八、思考题
解剖幼虫应注意哪些问题？ 为什么要剥离脂肪体？ 什么是染色中心（chromocenter）? 根据你所学的知识，联会（synapsis） 应出现在什么类型的细胞中？ 利用巨大染色体可以进行哪些遗传学 研究？
果蝇唾腺
（三）解离
将剥好的唾腺移到载玻片中央， 加50μl的1 mol/L HCl于腺体上， 解离２～３min，使组织疏松，以 便压片时细胞分散，染色体展开。
加入盐酸后的唾腺
（四）染色
用吸水纸吸去HCl，加100μl滴蒸 馏水轻轻冲洗两次，小心吸干。加 100μl改良苯酚品红染液，染色20min。 （此过程应保持腺体一直处于染液的 浸泡中，随时补充染液。）
果蝇是双翅目昆虫，幼虫期具有很大的唾腺 细胞，其中的染色体是巨大的唾液腺染色体。 唾液腺染色体不断地进行自我复制而不分开， 经过许多次的复制形成约1000～4000拷贝 的染色体丝，合起来达5mm宽400mm长， 比普通中期相染色体大得多（约100～150 倍），所以又称为多线染色体。 唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学 研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、 基因差别表达等提供了独特的研究材料。
果蝇的生活史：成虫-卵-幼虫-蛹。整个生活
史所需时间在20-30天左右，与温度、湿度、食 物等因素有关，因种而异。
成虫：羽化1-2天后进行交配，一般一 生仅交配一次，数日后雌虫产卵。成 蝇寿命一般1-2个月。 卵：椭圆形或香蕉状，长约1mm，乳 白色。常数十至数百粒堆积成块。在 温度较高时，卵产出后一天即可孵化。 幼虫：俗称蛆。圆柱形，前尖后钝， 无足无眼，多呈乳白色。幼虫分3龄， 腹部第8节后侧有后气门1对，由气门 环、气门裂和钮孔组成，是主要的呼 吸孔道。后气门形状是幼虫分类的重 要依据。 蛹：为围蛹，即其体外被有成熟幼虫 表皮硬化而成的蛹壳，圆筒形，棕褐 色至黑色。夏秋季蛹一般3-6天羽化。
2.多线染色体：果蝇的唾腺细胞停止在分裂间期 （永久间期 ），染色体核蛋白纤维不断复制， 平行排列形成巨大而伸展的多线染色体唾腺染色 体经过多次复制而并不分开，每条染色体大约有 1000—4000根染色体丝的拷贝，所以又称多线染 色体(polytene chromosome)。
3.染色体联会：类似有丝分裂中的同源染色体联会。 由于同源染色体紧密配对几乎相互融合，使果蝇 的唾腺染色体只有二倍体染色体数目的单元数。 由于其体细胞同源染色体的配对，故易于进行染 色体的缺失、重复、倒位和易位的细胞学观察和 研究。
六、实验结果
黑腹果蝇的染色体数目是2n=8，X=4，但 是在唾腺细胞中发生体细胞染色体配对，所以 染色体数目减半。X染色体和4号染色体是端部 着丝粒染色体，其着丝粒在染色中心上，另一 端向外伸展。2、3号染色体是中部着丝粒染色 体，其着丝粒也在染色中心，各自的两臂呈“V” 字型向外伸展。按道理应该观察到6个头，但因 为4号染色体较短小，往往在光学显微镜下看不 到，所以通常在铺展较好的情况下只能观察到5 个头。雄果蝇的Y染色体异染色质部分几乎包含 在染色中心，染色稍淡，而且染色体比雌果蝇 的稍细。
果蝇种间或种内不同品系与近缘种之间的遗 传差异常表现为唾腺染色体不联会，形成泡 （puff）、缢痕（constrictions）、间带区 （interband）的伸缩性以及顶体（telomere）的 形态等多方面的变异，可观察是否产生了倒 位、染色体的断裂、融合或重排，据此研究 其基因序列的差异。果蝇唾液腺染色体已广 泛用于种内系统发育和种间亲缘关系的研究 中。
4.横纹结构：每条染色体的染色线在不同的区段 螺旋化程度不一，出现一系列宽窄不同、染色 深浅不一或明暗相间的横纹。不同染色体的横 纹数量、形状和排列顺序是恒定的。利用这些 特征不仅可以鉴定不同的染色体，还可以结合 遗传实验结果进行基因定位。
5.Puff结构：幼虫的不同发育期， 浓缩的染色质纤维会成群解旋、 松开，形成泡状松散结构，使 相应的基因得以表达，这种泡 状结构称Puff结构，亦称染色 体的疏松。
普通果蝇（2n=8）唾腺染色体的形态：各染色 体着丝点附近异染色质区相互结合形成染色很深的染 色中心，第Ⅱ、Ⅲ对染色体呈Ｖ形（中着丝粒），各 有两臂，Ｘ染色体呈棒状，第Ⅳ对染色体呈粒状，观 察时可见五条臂由染色中心向外蜿蜒伸展。
果蝇唾腺染色体的特点：
1.巨大染色体：这种染色体比普通染色体大得多， 宽约5μm，长约400μm，相当于普通染色体 的100—150倍，因而又称为巨大染色体。