PCR产物的胶回收分离纯化

一、目的基因的扩增
（四）、PCR产物的提纯
实验目的：
回收得到纯的目的DNA，去除影响DNA连接酶活性的物质及其它DNA片段。

纯化产物用于酶切和连接反应。

主要实验仪器：
冰箱，为试剂、样品或菌种提供冷冻、冷藏的保存环境制冰机，用于制备碎冰块
微量移液器，用于吸取微量试剂及样品
超净工作台，提供无菌工作台面
常温离心机，用于样品的常温离心分离
核酸电泳仪，用于核酸的电泳分离分析
主要实验室剂：
酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70％乙醇、TE。

实验步骤：
将PCR反应液转入1.5ml离心管中，加入50ulTE和100ul 酚/氯仿/异戊醇，盖好离心管盖子，上下颠倒混匀。

将管置于离心机中，12000rpm离心5min。

取上清，加入1/10体积3mol醋酸钠和2.5倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，室温放置20min沉淀DNA。

将管置于离心机中，12000rpm离心10min。

离心后现象：（图片）。

弃上清，加入1ml70％乙醇，12000rpm离心5min。

离心后现象：（图片）。

弃上清。

将管口打开，倒置于纸巾上数秒，使液体尽可能流尽，再平放于纸巾上室温干燥10min。

加30ulTE溶解沉淀，取5ul样品跑电泳。

电泳图谱为：（图片）。

确认回收到PCR产物后，剩余样品置于-20℃冰箱中备用，用于酶切。

END。

PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。

切下带有所需DNA 片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

商品化的T载体有很多。

本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。

这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。

由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。

【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。

2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。

2 / 95.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。

6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。

【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。

2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。

PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)
【实验原理】
1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。

切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

商品化的T载体有很多。

本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。

这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。

由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。

【试剂与器材】
（一）试剂
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。

2.TAE电泳缓冲液
3.琼脂糖（Agarose）
4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。

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实验六 PCR产物胶回收实验（一）一、实验目的1. 掌握胶回收的常规操作2. 了解胶回收PCR产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。

本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为20~70%。

回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。

三、试剂及配套设备和材料3.1 试剂Extraction buffer Wash buffer Elution buffer3.2 配套设备和材料无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机四、基本技术参数1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或2.0 ml离心管中。

请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。

一般情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul（50ul为最终洗脱体积）。

2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。

例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。

对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。

3. 于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。

一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔23分钟混匀一次。

如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。

4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。

如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。

5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。

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PCR产物胶回收实验引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的常用技术。

在PCR实验中，扩增产物通常需要从琼脂糖凝胶上回收和纯化，以便进一步的分析和应用。

本文将介绍一种PCR产物胶回收的实验方法。

实验材料：1. 扩增产物：经过PCR扩增得到的DNA片段。

2. 琼脂糖凝胶：用于扩增产物分离和纯化。

3. 胶回收缓冲液：用于胶回收的缓冲液。

4. 真空浓缩仪：用于回收DNA片段。

5. 无菌纯水：用于制备实验溶液。

6. DNA电泳仪：用于检测和分析PCR产物。

实验步骤：1. 准备琼脂糖凝胶：a. 根据实验需要，制备适合的琼脂糖凝胶。

b. 加入适量的琼脂糖凝胶染料（如安全染料）。

2. 进行PCR扩增：a. 根据所需扩增片段的序列，设计引物，并合成引物。

b. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶等。

c. 进行PCR扩增反应。

3. 分析PCR产物：a. 用电泳法将PCR产物与DNA标准品一同进行电泳。

b. 根据需要，记录PCR产物的迁移距离和片段大小。

4. 准备胶回收缓冲液：a. 根据实验所需，制备合适的胶回收缓冲液。

5. 胶回收：a. 使用刮胶刀将PCR产物切下，放入离心管中。

b. 添加足够的胶回收缓冲液，使产物完全浸没其中。

c. 低温热激活离心管以使产物与缓冲液充分混合。

d. 放入离心机中离心，以使产物完全沉积到离心管底部。

6. 剔除上清：a. 使用吸走器小心地吸取上清，避免吸取产物。

b. 检查离心管底部是否完全干燥，如有残余液体则继续吸取。

7. 回收DNA片段：a. 加入适量的无菌纯水，以溶解和洗涤DNA片段。

b. 用手轻轻摇晃离心管，使DNA片段溶于水中。

c. 使用真空浓缩仪，将溶解的DNA片段浓缩至所需浓度。

8. 分析纯化后的PCR产物：a. 用电泳法将纯化后的PCR产物与DNA标准品一同进行电泳。

b. 检查PCR产物的迁移距离并与之前的分析结果进行比较。

结论：通过PCR产物胶回收实验，我们成功地从琼脂糖凝胶中回收和纯化了PCR扩增的DNA片段。

PCR产物的纯化（回收）一、器材移液枪（100，10，2μL）及其枪头，PCR反应管及其加子，镊子，标记笔二、试剂及其用量1、反应体系50μL，按下列顺序加样ddH2O 36. 4+0.3μL10×PCR Buffer 5μLdNTPs 2μLP1 1μLP2 1μLTaq 0.3μLcDNA template 4μL2、PCR产物回收试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）三、步骤1、目的基因的PCR扩增1）、按照以上试剂及其用量加到PCR反应管，经过适当的混匀后可放到PCR仪进行PCR扩增。

3）、琼脂糖凝胶电泳吸取一定量的6×Loading Buffer 1μL加到每一个PCR产物（50μL），吹打混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入8μL DL2000DNA Marker 作对照，以150V左右电压进行电泳，约15min后于紫外灯下观察结果。

2、切胶：若结果为阳性的话，把该凝胶置于紫外灯台对其目的条带的胶粒进行切割，放入空的1.5Ep管中；3、加入300μLBinding Buffer，盖实管口，标记，再用力甩一甩；4、放入76℃烘箱进行加热，其间需要把Ep管摇动2-3次，使胶粒完全溶解。

5、低速离心一会；6、将上述溶胶液加入到HiBind spin-column中；7、离心（1min，最大速）8、把收集管中的液体再倒入column中再进行离心（同上）；9、弃去收集管中的液体（此时把DNA Elution Buffer拿至76℃烘箱进行预热）；10、加入700μLSPW Buffer，静置2min，离心（1min，最大速）弃收集管中的液体；11、重复10；12、空甩：空管离心（5min，最大速），以弃去DNA回收柱中的残余液体；13、将DNA回收柱放入新的1.5mLEp管中，并加入30μL DNA Elution Buffer至膜的中央，室温放置1min；14、离心（1min，最大速），以收集纯化的DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后于-20℃保存。