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一、目的基因的扩增
（四）、PCR产物的提纯
实验目的：
回收得到纯的目的DNA，去除影响DNA连接酶活性的物质及其它DNA片段。
纯化产物用于酶切和连接反应。
主要实验仪器：
冰箱，为试剂、样品或菌种提供冷冻、冷藏的保存环境制冰机，用于制备碎冰块
微量移液器，用于吸取微量试剂及样品
超净工作台，提供无菌工作台面
常温离心机，用于样品的常温离心分离
核酸电泳仪，用于核酸的电泳分离分析
主要实验室剂：
酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70％乙醇、TE。
实验步骤：
将PCR反应液转入1.5ml离心管中，加入50ulTE和100ul 酚/氯仿/异戊醇，盖好离心管盖子，上下颠倒混匀。
将管置于离心机中，12000rpm离心5min。
取上清，加入1/10体积3mol醋酸钠和2.5倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，室温放置20min沉淀DNA。
将管置于离心机中，12000rpm离心10min。
离心后现象：（图片）。
弃上清，加入1ml70％乙醇，12000rpm离心5min。
离心后现象：（图片）。
弃上清。
将管口打开，倒置于纸巾上数秒，使液体尽可能流尽，再平放于纸巾上室温干燥10min。
加30ulTE溶解沉淀，取5ul样品跑电泳。
电泳图谱为：（图片）。
确认回收到PCR产物后，剩余样品置于-20℃冰箱中备用，用于酶切。
END。
PC产物的回收与鉴定PCR产物的回收（胶回收试剂盒）1、胶回收的目的（1）去除非特异性扩增的产物（2）去除多余的底物（3）去除多余的Taq酶（4）得到目的片段2、胶回收的过程（1）切胶：紫外下切胶，称重。
之后用枪头将胶块捣碎。
切胶的刀片最好选用一次性刀片，实验台等也尽可能用乙醇擦拭干净。
可通过空EP管与装胶EP管质量的差值计算胶的质量。
注意切胶时尽可能避免切到条带外的凝胶，且避免紫外时间过长。
别忘记胶条有厚度，前后多余的部分也尽量切除。
如果感觉手感不好，可以试试切胶神器：（2）溶胶：每1mg胶加入1μL膜结合液（MB），按比例1:1加入MB，55℃水浴溶解。
每1—2min震荡混匀，待溶解后至少在水浴中保持1—2min，保证胶块完全溶解。
在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密结合，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解DNA才能充分释放。
否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。
（3）结合：将溶胶转移至纯化柱内，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将纯化柱重新插回收集管中。
胶块完全溶解后最好将胶液温度降至室温再上柱，因为纯化柱在温度较高时结合DNA的能力较弱。
离心时注意对称放置离心管。
（4）漂洗：向纯化柱正中加入600μL漂洗液（预先加过无水乙醇），12000rpm离心30s，去除废液。
重复一次后，将纯化柱开盖离心2min，彻底去除残余漂洗液中的乙醇。
纯化柱正中为硅基材料，在高盐环境下能够吸附DNA，在低盐环境下能够释放DNA。
漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶切、PCR等实验。
（5）洗脱：将纯化柱置于1、5mL离心管中，向纯化柱正中加入30μL洗脱缓冲液或无菌水，放置1min后，12000rpm离心1min，洗脱DNA。
务必将洗脱缓冲液或无菌水加入纯化柱正中，若沾在管壁上，一定要震动离心管，使液体滑落到管底，以便被纯化柱吸收。
（6）保存：将获得的DNA片段于-20℃保存，或直接用于后续实验。
pcr切胶回收的步骤
PCR切胶回收呀，这可是个很有趣的小实验呢。
先说说准备工作吧。
你得有已经跑过PCR并且经过琼脂糖凝胶电泳的胶块哦。
然后呢，把要用的工具都准备好，像干净的刀片啦，还有专门的切胶回收试剂盒。
开始切胶啦。
在紫外灯下看胶块的时候，就像寻宝一样呢。
找到你要的那条DNA 条带，然后用刀片小心翼翼地把它周围的胶切下来。
可别切太大块啦，不然会有好多杂质的。
切的时候就像在给小宝贝做精细的手术一样，要很小心哦。
切好胶之后，就按照试剂盒的说明来操作啦。
一般是把切下来的胶放到一个离心管里，然后加入一些溶液，让胶融化。
这时候你就看着胶慢慢变成液体，感觉就像魔法一样呢。
接着呢，要把融化后的液体加到吸附柱里。
这个吸附柱就像一个小卫士，专门把DNA吸附住，而那些杂质就被留在外面啦。
把液体加进去之后，离心一下，就像坐小过山车一样，让液体在离心力的作用下快速通过吸附柱。
然后呢，要清洗一下吸附柱。
这一步就像是给小卫士洗个澡，把它身上可能残留的杂质都洗干净。
再离心一下，把清洗的液体甩掉。
最后就是把我们想要的DNA从吸附柱上洗脱下来啦。
加入洗脱液，再离心，这个时候我们的DNA就乖乖地跑到洗脱液里啦。
就像把小宝贝从保护它的小房子里接出来一样。
这样，PCR切胶回收就完成啦。
虽然过程有点小复杂，但是只要按照步骤来，就可以得到我们想要的纯净的DNA啦。
每次做这个实验都感觉像是在和小小的DNA分子玩一场有趣的游戏呢。
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)
【实验原理】
1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】
（一）试剂
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液
3.琼脂糖（Agarose）
4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
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实验六 PCR产物胶回收实验（一）一、实验目的1. 掌握胶回收的常规操作2. 了解胶回收PCR产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。
本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为20~70%。
回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。
三、试剂及配套设备和材料3.1 试剂Extraction buffer Wash buffer Elution buffer3.2 配套设备和材料无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机四、基本技术参数1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或2.0 ml离心管中。
请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。
一般情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul（50ul为最终洗脱体积）。
2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。
例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。
对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。
3. 于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。
一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔23分钟混匀一次。
如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。
4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。
如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。
5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。
质粒或PCR酶切产物切胶回收实验材料实验耗材：枪头（10μl、200μl、1ml）、EP管(200μl、1ml)试剂：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根）、ddH2O准备工作：50˚C加热块、质粒或PCR酶切产物、PCR产物实验操作步骤：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇。
1. 柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使用当天处理过的柱子）2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
3. 向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入100 µl PN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。
注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。
4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可分批加入。
5. 向吸附柱CA2中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW 加入后静置2-5 min再离心。
实验三PCR产物电泳回收检测（D2500-01型号）1..琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，推荐使用新鲜的TAE/TBE Buffer和新配制的胶。
2.片段完全分离后，在紫外灯下迅速切取所需条带，DNA在紫外灯下爆光时间不超过30s。
3.称取凝胶块的重量，按照每1g凝胶加入1ml Binding Buffer对应量，加入适量体积的Binding Buffer,55-60℃水浴至凝胶完全溶解（约7-10min）。
每隔2-3min振荡一次。
注意：当Binding Buffer完全溶解凝胶后，请注意溶液颜色的变化。
如果溶液颜色已经变成紫色或红色，必须加入5ul 5M NaAc, pH 5.2至溶液中调整pH值。
4.把HiBind DNA 柱子套在2ml收集管。
5.将DNA/凝胶混合液转移至套在2ml收集管的HiBind DNA柱子中，10,000xg离心1min。
6.倒去滤液，把柱子装回收集管中。
HiBind柱一次能装700ul溶液，若混合液超过700ul,每次转移700ul至柱子中，然后重复5-6步骤。
7.把柱子重新装回收集管，加入300ul Binding Buffer,按上述条件离心，弃去滤液。
8.把柱子重新装回收集管，加入700ul SPW Wash Buffer,按上述条件离心，弃去滤液。
注意：使用前SPW Wash Buffer必须用无水乙醇稀释。
9.（可选）重复步骤8一次。
10.弃去滤液，把柱子重新装回收集管，13,000xg离心空柱2min以甩干柱子基质。
11.把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30ul 65℃预热的Elution Buffer到柱子基质上，室温静置2min。
≥13,000xg离心2 min洗脱出DNA。
PCR产物胶回收实验引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的常用技术。
在PCR实验中，扩增产物通常需要从琼脂糖凝胶上回收和纯化，以便进一步的分析和应用。
本文将介绍一种PCR产物胶回收的实验方法。
实验材料：1. 扩增产物：经过PCR扩增得到的DNA片段。
2. 琼脂糖凝胶：用于扩增产物分离和纯化。
3. 胶回收缓冲液：用于胶回收的缓冲液。
4. 真空浓缩仪：用于回收DNA片段。
5. 无菌纯水：用于制备实验溶液。
6. DNA电泳仪：用于检测和分析PCR产物。
实验步骤：1. 准备琼脂糖凝胶：a. 根据实验需要，制备适合的琼脂糖凝胶。
b. 加入适量的琼脂糖凝胶染料（如安全染料）。
2. 进行PCR扩增：a. 根据所需扩增片段的序列，设计引物，并合成引物。
b. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶等。
c. 进行PCR扩增反应。
3. 分析PCR产物：a. 用电泳法将PCR产物与DNA标准品一同进行电泳。
b. 根据需要，记录PCR产物的迁移距离和片段大小。
4. 准备胶回收缓冲液：a. 根据实验所需，制备合适的胶回收缓冲液。
5. 胶回收：a. 使用刮胶刀将PCR产物切下，放入离心管中。
b. 添加足够的胶回收缓冲液，使产物完全浸没其中。
c. 低温热激活离心管以使产物与缓冲液充分混合。
d. 放入离心机中离心，以使产物完全沉积到离心管底部。
6. 剔除上清：a. 使用吸走器小心地吸取上清，避免吸取产物。
b. 检查离心管底部是否完全干燥，如有残余液体则继续吸取。
7. 回收DNA片段：a. 加入适量的无菌纯水，以溶解和洗涤DNA片段。
b. 用手轻轻摇晃离心管，使DNA片段溶于水中。
c. 使用真空浓缩仪，将溶解的DNA片段浓缩至所需浓度。
8. 分析纯化后的PCR产物：a. 用电泳法将纯化后的PCR产物与DNA标准品一同进行电泳。
b. 检查PCR产物的迁移距离并与之前的分析结果进行比较。
结论：通过PCR产物胶回收实验，我们成功地从琼脂糖凝胶中回收和纯化了PCR扩增的DNA片段。
pcr产物纯化回收跑胶试验结果分析PCR产物的回收（玻璃奶吸附法）SYBR会使DNA部分显出绿色荧光，在紫外灯下辨认绿色荧光，可将胶切下。
实验结果及分析本次试验中，在最后一步检测中看到了荧光，说明了DNA的存在，证明回收到了PCR的产物PCR产物的直接纯化：一、原理PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。
目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。
本实验中， Buffer PCR-A促使大于100bp 的DNA片段选择性地吸附到 silica膜上。
经 Buffer W. BufferW2洗涤去除残留在sica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后，吸附到sica膜上的DNA片段经微量水或 Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学的操作。
二、材料与方法1、材料PCR产物2、仪器、用具恒温孵育器（65C)、离心机、移液器、1.5ml离心管3、试剂Buffer_PCR -A Buffer w1；已加无水乙醇的 Buffer V2 Eluent或去离子水4、方法(1）在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer PCR-A若需加入的BufferPCR-A不足100ul，则加入100ul。
(2）将DNA --prep Tube置于2 -ml Microfuge Tube中，将步骤（1）中的混合液移入DNA -prep Tube I中，5500rpm离心1min。
(3）弃滤液，将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube 中，加入500 ul Bufer W1,5500rpm离心1min。
(4）弃滤液，将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube 中，加入700山已加无水乙醇的 Buffer V2,5500rpm离心1min，以同样的方法再用700山己加无水乙醇的 Buffer\2洗涤一次。
PCR产物的胶回收分离纯化一、实验仪器1、琼脂糖凝胶电泳系统2、紫外观察分析仪3、离心机4、单面刀片5、恒温水浴锅二、试剂1、DNA回收试剂盒2、50×TAE3、ddH2O三、步骤1 在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml离心管中。
4. 称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1 mg=1 μl 进行计算。
5. 向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer 的加量如下表：凝胶浓度DR-I Buffer 使用量1.0％ 3 个凝胶体积量1.0％～1.5％ 4 个凝胶体积量1.5％～2.0％ 5 个凝胶体积量6. 均匀混合后75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热）。
此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6～10 分钟）。
注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA 的回收率。
7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。
当分离小于400 bp 的DNA 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20% 的异丙醇。
8. 将试剂盒中的Spin Column 安置于Collection Tube 上。
9. 将上述操作7 的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。
注）如将滤液再加入Spin Column 中离心一次，可以提高DNA 的回收率。
10. 将500 μl的漂洗液Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm 离心30 秒钟，弃滤液。
11. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm 离心30 秒钟，弃滤液。
注）请确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇。
12. 重复操作步骤11。
13. 将Spin Column 安置于新的1.5 ml 的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入25 μl 的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置 1 分钟。
胶回收一. 提高胶回收量的办法：1）增加电泳时的上样量。
2）电泳缓冲液用新鲜配制的。
3）切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。
4）把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。
5）溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。
6）胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul （PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。
7）加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。
8）最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。
9）可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。
10）将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。
DNA胶回收实验技术总结胶回收一. 提高胶回收量的办法：1）增加电泳时的上样量。
2）电泳缓冲液用新鲜配制的。
3）切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。
4）把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。
5）溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。
6）胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
5.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。
【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。
2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。
近似地确定其体积（假设其密度为1g/ml）。
分子生物学实验报告实验名称：PCR反应及PCR产物的鉴定、回收与载体连接班级：生工xx姓名：xxx学号：xxxx日期：xxxPCR反应及PCR产物的鉴定、回收与载体连接1 引言聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片断的一种技术。
由于这种方法高效、敏感、特异性高[1]，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。
通过本次实验来学习PCR反应的基本原理与实验技术，了解引物设计的一般要求，同时学习PCR产物的回收及其与载体连接的原理和方法。
2 材料和方法2.1 实验原理2.1.1 PCR反应的基本原理聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点[2]。
PCR进行的基本条件是：以DNA为模板（在RT-PCR中模板是RNA）；以寡聚核苷酸为引物；需要4种dNTP作为底物；有耐高温的Taq DNA聚合酶。
PCR每一个循环由三个步骤组成：①变性:加热模板DNA，使其解离成单链；②退火:降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA所需扩增序列结合；③延伸:在适宜温度下，DNA聚合酶利用dNTP使引物3’端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。
每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35-45个循环后，目标片段的扩增可达106-107倍。
由于DNA的琼脂糖凝胶电泳已于实验一详细阐述与实验，此次不再赘述。
2.1.2 PCR产物的回收与载体连接原理DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
PCR产物纯化和切胶回收一、pcr产物纯化PCR扩增完成后需要进行琼脂糖凝胶电泳检测，在条带单一无其他杂带的情况下，可以直接对产物进行纯化，常见的纯化方法有：1、硅胶层析柱法原理：大多数离心柱中吸附DNA的是一层硅胶膜，实际上就是一层玻璃纤维，其表面有大量修饰的硅羟基（Si-OH），硅羟基在溶液中解离后带负电，然后与带正电盐离子、带负电DNA形成电桥，从而吸附住DNA，使得DNA双链变单链，不会被生物大分子溶剂洗脱，但能经水溶性缓冲液水化后，被定量回收，从而实现纯化分离。
2、磁珠法（abs60151）原理：磁珠是有磁性的能吸附DNA的物质，其内部核心是铁离子，在磁场作用下可以吸附在磁体上。
在核心外，经过羧化，带有羧基基团，在特定的离子条件下，可以与DNA结合。
结合后，在外磁场的作用下，磁珠与DNA结合体移动到磁体周围，可以很方便去除其他多余的液体，这时，不能与磁珠结合的所有杂质都随水溶液一并去除。
然后，在洗脱条件下，DNA与磁珠分离，溶解在水中，将溶解有DNA的溶液转移，就得到了纯化后的DNA样本。
3、其他纯化方法①渗透液结合醇沉纯化原理：利用分子大小不同，小分子的物质能够通过渗透膜溶解到大量的溶液中去，而大分子的物质不能通过渗透膜，所以继续留存在透析袋中，通过乙醇沉淀最后达到去除小分子物质，得到纯化的有机大分子的效果。
②直接沉淀纯化原理：DNA分子在高盐离子醇溶液中会被沉淀出来，而其他物质继续溶液在溶液中，沉淀出来的DNA分子经过离心与溶液成分分开，达到纯化的目的。
二、凝胶回收纯化如电泳检测结果存在非特异性条带，则需要将目的条带切出来，再用胶回收试剂盒（abs60098）对凝胶进行回收纯化，相较于直接纯化，只是多了一步溶胶的过程，相应的产物纯度提高，回收率则下降。
附：在PCR扩增完成后，反应体系中除了DNA片段，还存在离子、dNTP、引物及聚合酶等物质，这些物质会影响后续克隆测序等实验，因此对其产物进行纯化是必不可缺的步骤，不同的纯化手段各有自己的优缺点。
PＣR产物得胶回收分离纯化一、实验仪器1、琼脂糖凝胶电泳系统２、紫外观察分析仪3、离心机４、单面刀片5、恒温水浴锅二、试剂1、DＮA回收试剂盒２、50×TAE3、dｄH2O三、步骤１在紫外灯下切分含ＤNA得琼脂糖块,尽可能除去多余得琼脂糖。
放入1.5ml离心管中、４。
称量胶块重量,计算胶块体积。
计算胶块体积时,以1ｍg=1 μl 进行计算。
5. 向胶块中加入胶块融化液DR－I Ｂufｆeｒ,DR-ＩBufｆer 得加量如下表:凝胶浓度ＤR－I Bｕffｅｒ使用量１。
0％ 3 个凝胶体积量1.０%～１。
5% ４个凝胶体积量１、5%～2。
0％５个凝胶体积量6。
均匀混合后75℃加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在４5℃加热)。
此时应间断振荡混合,使胶块充分融化(约6～１0分钟)。
注)胶块一定要充分融化,否则将会严重影响DNA 得回收率。
７、向上述胶块融化液中加入ＤＲ—I Buffer量得1/2体积量得DR-ＩＩBuｆｆer,均匀混合。
当分离小于400bｐ得DＮＡ片段时,应在此溶液中再加入终浓度为20%得异丙醇。
8。
将试剂盒中得SpiｎＣolｕmn安置于Collection Tube 上。
9。
将上述操作7得溶液转移至SpiｎColumn 中,12,000 rｐm 离心 1 分钟,弃滤液、注)如将滤液再加入Sｐｉn Coｌuｍn 中离心一次,可以提高DNA 得回收率。
10.将500 μl得漂洗液Rinse Ａ加入Sｐin Ｃoluｍn中,1２,000 rp ｍ离心３０秒钟,弃滤液。
1１、将70０μｌ得Riｎｓe B加入Spｉn Ｃoluｍn中,12,000 ｒp ｍ离心30 秒钟,弃滤液。
注)请确认RinsｅB中已经加入了指定体积得100%乙醇。
12。
重复操作步骤１1、13。
将SpiｎColｕmn安置于新得1.５ml 得离心管上,在Spin Cｏlumn 膜得中央处加入25μl 得灭菌蒸馏水或Elutｉｏn Buffer,室温静置1 分钟。
实验六 PCR产物胶回收实验
一、实验目的
1. 掌握胶回收的常规操作
2. 了解胶回收PCR产物的目的
二、实验原理
利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。
本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为20~70%。
回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。
三、试剂及配套设备和材料
3.1 试剂
Extraction buffer Wash buffer Elution buffer
3.2 配套设备和材料
无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头
无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机
四、基本技术参数
五、操作步骤
1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或
2.0 ml离心管中。
请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。
一般情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul （50ul为最终洗脱体积）。
2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。
例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。
对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。
3. 于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。
一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔2-3分钟混匀一次。
如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。
4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。
如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。
5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。
如混合液体积大于750ul可先转移750ul，其余的液体待离心弃液后，再转移。
6. 向Spin column内加500ul Extraction Buffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去接液管内液体。
7. 向Spin column内加750ul Wash Buffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去接液管内液体。
如果回收的DNA片段将用于盐浓度敏感的实验，请在加入Wash buffer后静置2~5分钟，再离心。
8. 再次于12,000 rpm离心1分钟，然后将spin column转移到无菌的1.5ml离心管中。
如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。
9. 向Spin column内加50ul Elution Buffer、水或TE溶液，并于室温静置1分钟。
可根据实验的实际需要决定Elution Buffer用量。
但不要低于20ul。
10. 于12，000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段。
回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。
六、注意事项
1. 为了保证没有外源DNA的污染，电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌。
2. 为了减少胶的体积，我们可以用相对比较薄的胶来跑电泳，这样可以减少回收试剂引起的一些后续麻烦。
2. 在洗脱前，将洗脱液于30~60℃温浴，可提高提取效率。
七、思考题
1. 简述影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素。
2. 简述PCR上样缓冲液（loading buffer）的成分及其作用。
