PCR产物胶回收实验

一、目的基因的扩增
（四）、PCR产物的提纯
实验目的：
回收得到纯的目的DNA，去除影响DNA连接酶活性的物质及其它DNA片段。

纯化产物用于酶切和连接反应。

主要实验仪器：
冰箱，为试剂、样品或菌种提供冷冻、冷藏的保存环境制冰机，用于制备碎冰块
微量移液器，用于吸取微量试剂及样品
超净工作台，提供无菌工作台面
常温离心机，用于样品的常温离心分离
核酸电泳仪，用于核酸的电泳分离分析
主要实验室剂：
酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70％乙醇、TE。

实验步骤：
将PCR反应液转入1.5ml离心管中，加入50ulTE和100ul 酚/氯仿/异戊醇，盖好离心管盖子，上下颠倒混匀。

将管置于离心机中，12000rpm离心5min。

取上清，加入1/10体积3mol醋酸钠和2.5倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，室温放置20min沉淀DNA。

将管置于离心机中，12000rpm离心10min。

离心后现象：（图片）。

弃上清，加入1ml70％乙醇，12000rpm离心5min。

离心后现象：（图片）。

弃上清。

将管口打开，倒置于纸巾上数秒，使液体尽可能流尽，再平放于纸巾上室温干燥10min。

加30ulTE溶解沉淀，取5ul样品跑电泳。

电泳图谱为：（图片）。

确认回收到PCR产物后，剩余样品置于-20℃冰箱中备用，用于酶切。

END。

PC产物的回收与鉴定PCR产物的回收（胶回收试剂盒）1、胶回收的目的（1）去除非特异性扩增的产物（2）去除多余的底物（3）去除多余的Taq酶（4）得到目的片段2、胶回收的过程（1）切胶：紫外下切胶，称重。

之后用枪头将胶块捣碎。

切胶的刀片最好选用一次性刀片，实验台等也尽可能用乙醇擦拭干净。

可通过空EP管与装胶EP管质量的差值计算胶的质量。

注意切胶时尽可能避免切到条带外的凝胶，且避免紫外时间过长。

别忘记胶条有厚度，前后多余的部分也尽量切除。

如果感觉手感不好，可以试试切胶神器：（2）溶胶：每1mg胶加入1μL膜结合液（MB），按比例1:1加入MB，55℃水浴溶解。

每1—2min震荡混匀，待溶解后至少在水浴中保持1—2min，保证胶块完全溶解。

在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密结合，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解DNA才能充分释放。

否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。

（3）结合：将溶胶转移至纯化柱内，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将纯化柱重新插回收集管中。

胶块完全溶解后最好将胶液温度降至室温再上柱，因为纯化柱在温度较高时结合DNA的能力较弱。

离心时注意对称放置离心管。

（4）漂洗：向纯化柱正中加入600μL漂洗液（预先加过无水乙醇），12000rpm离心30s，去除废液。

重复一次后，将纯化柱开盖离心2min，彻底去除残余漂洗液中的乙醇。

纯化柱正中为硅基材料，在高盐环境下能够吸附DNA，在低盐环境下能够释放DNA。

漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶切、PCR等实验。

（5）洗脱：将纯化柱置于1、5mL离心管中，向纯化柱正中加入30μL洗脱缓冲液或无菌水，放置1min后，12000rpm离心1min，洗脱DNA。

务必将洗脱缓冲液或无菌水加入纯化柱正中，若沾在管壁上，一定要震动离心管，使液体滑落到管底，以便被纯化柱吸收。

（6）保存：将获得的DNA片段于-20℃保存，或直接用于后续实验。

pcr切胶回收的步骤
PCR切胶回收呀，这可是个很有趣的小实验呢。

先说说准备工作吧。

你得有已经跑过PCR并且经过琼脂糖凝胶电泳的胶块哦。

然后呢，把要用的工具都准备好，像干净的刀片啦，还有专门的切胶回收试剂盒。

开始切胶啦。

在紫外灯下看胶块的时候，就像寻宝一样呢。

找到你要的那条DNA 条带，然后用刀片小心翼翼地把它周围的胶切下来。

可别切太大块啦，不然会有好多杂质的。

切的时候就像在给小宝贝做精细的手术一样，要很小心哦。

切好胶之后，就按照试剂盒的说明来操作啦。

一般是把切下来的胶放到一个离心管里，然后加入一些溶液，让胶融化。

这时候你就看着胶慢慢变成液体，感觉就像魔法一样呢。

接着呢，要把融化后的液体加到吸附柱里。

这个吸附柱就像一个小卫士，专门把DNA吸附住，而那些杂质就被留在外面啦。

把液体加进去之后，离心一下，就像坐小过山车一样，让液体在离心力的作用下快速通过吸附柱。

然后呢，要清洗一下吸附柱。

这一步就像是给小卫士洗个澡，把它身上可能残留的杂质都洗干净。

再离心一下，把清洗的液体甩掉。

最后就是把我们想要的DNA从吸附柱上洗脱下来啦。

加入洗脱液，再离心，这个时候我们的DNA就乖乖地跑到洗脱液里啦。

就像把小宝贝从保护它的小房子里接出来一样。

这样，PCR切胶回收就完成啦。

虽然过程有点小复杂，但是只要按照步骤来，就可以得到我们想要的纯净的DNA啦。

每次做这个实验都感觉像是在和小小的DNA分子玩一场有趣的游戏呢。

PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)
【实验原理】
1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。

切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

商品化的T载体有很多。

本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。

这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。

由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。

【试剂与器材】
（一）试剂
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。

2.TAE电泳缓冲液
3.琼脂糖（Agarose）
4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。

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实验六 PCR产物胶回收实验（一）一、实验目的1. 掌握胶回收的常规操作2. 了解胶回收PCR产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。

本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为20~70%。

回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。

三、试剂及配套设备和材料3.1 试剂Extraction buffer Wash buffer Elution buffer3.2 配套设备和材料无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机四、基本技术参数1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或2.0 ml离心管中。

请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。

一般情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul（50ul为最终洗脱体积）。

2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。

例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。

对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。

3. 于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。

一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔23分钟混匀一次。

如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。

4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。

如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。

5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。

质粒或PCR酶切产物切胶回收实验材料实验耗材：枪头（10μl、200μl、1ml）、EP管(200μl、1ml)试剂：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根）、ddH2O准备工作：50˚C加热块、质粒或PCR酶切产物、PCR产物实验操作步骤：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇。

1. 柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（请使用当天处理过的柱子）2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。

3. 向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入100 µl PN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。

注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。

4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可分批加入。

5. 向吸附柱CA2中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW 加入后静置2-5 min再离心。

实验三PCR产物电泳回收检测（D2500-01型号）1..琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，推荐使用新鲜的TAE/TBE Buffer和新配制的胶。

2.片段完全分离后，在紫外灯下迅速切取所需条带，DNA在紫外灯下爆光时间不超过30s。

3.称取凝胶块的重量，按照每1g凝胶加入1ml Binding Buffer对应量，加入适量体积的Binding Buffer,55-60℃水浴至凝胶完全溶解（约7-10min）。

每隔2-3min振荡一次。

注意：当Binding Buffer完全溶解凝胶后，请注意溶液颜色的变化。

如果溶液颜色已经变成紫色或红色，必须加入5ul 5M NaAc, pH 5.2至溶液中调整pH值。

4.把HiBind DNA 柱子套在2ml收集管。

5.将DNA/凝胶混合液转移至套在2ml收集管的HiBind DNA柱子中，10,000xg离心1min。

6.倒去滤液，把柱子装回收集管中。

HiBind柱一次能装700ul溶液，若混合液超过700ul,每次转移700ul至柱子中，然后重复5-6步骤。

7.把柱子重新装回收集管，加入300ul Binding Buffer,按上述条件离心，弃去滤液。

8.把柱子重新装回收集管，加入700ul SPW Wash Buffer,按上述条件离心，弃去滤液。

注意：使用前SPW Wash Buffer必须用无水乙醇稀释。

9.（可选）重复步骤8一次。

10.弃去滤液，把柱子重新装回收集管，13,000xg离心空柱2min以甩干柱子基质。

11.把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30ul 65℃预热的Elution Buffer到柱子基质上，室温静置2min。

≥13,000xg离心2 min洗脱出DNA。

PCR产物胶回收实验引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的常用技术。

在PCR实验中，扩增产物通常需要从琼脂糖凝胶上回收和纯化，以便进一步的分析和应用。

本文将介绍一种PCR产物胶回收的实验方法。

实验材料：1. 扩增产物：经过PCR扩增得到的DNA片段。

2. 琼脂糖凝胶：用于扩增产物分离和纯化。

3. 胶回收缓冲液：用于胶回收的缓冲液。

4. 真空浓缩仪：用于回收DNA片段。

5. 无菌纯水：用于制备实验溶液。

6. DNA电泳仪：用于检测和分析PCR产物。

实验步骤：1. 准备琼脂糖凝胶：a. 根据实验需要，制备适合的琼脂糖凝胶。

b. 加入适量的琼脂糖凝胶染料（如安全染料）。

2. 进行PCR扩增：a. 根据所需扩增片段的序列，设计引物，并合成引物。

b. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶等。

c. 进行PCR扩增反应。

3. 分析PCR产物：a. 用电泳法将PCR产物与DNA标准品一同进行电泳。

b. 根据需要，记录PCR产物的迁移距离和片段大小。

4. 准备胶回收缓冲液：a. 根据实验所需，制备合适的胶回收缓冲液。

5. 胶回收：a. 使用刮胶刀将PCR产物切下，放入离心管中。

b. 添加足够的胶回收缓冲液，使产物完全浸没其中。

c. 低温热激活离心管以使产物与缓冲液充分混合。

d. 放入离心机中离心，以使产物完全沉积到离心管底部。

6. 剔除上清：a. 使用吸走器小心地吸取上清，避免吸取产物。

b. 检查离心管底部是否完全干燥，如有残余液体则继续吸取。

7. 回收DNA片段：a. 加入适量的无菌纯水，以溶解和洗涤DNA片段。

b. 用手轻轻摇晃离心管，使DNA片段溶于水中。

c. 使用真空浓缩仪，将溶解的DNA片段浓缩至所需浓度。

8. 分析纯化后的PCR产物：a. 用电泳法将纯化后的PCR产物与DNA标准品一同进行电泳。

b. 检查PCR产物的迁移距离并与之前的分析结果进行比较。

结论：通过PCR产物胶回收实验，我们成功地从琼脂糖凝胶中回收和纯化了PCR扩增的DNA片段。