分子荧光分析法实验讲义

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2. 单重态与三重态
S1
T1
S0
处于分离电子轨道的非成对电子，平行自旋比配对自旋更稳
定，因此，三重激发态的能级比相应的单重激发态的能级低。
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3.激发态→基态的能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
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internal conversion
释放能量回到基态。
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I F ∝f (λex 、λem)
固定激发波长、扫描发射波长
蒽的发射光谱19
（三）荧光光谱的特征 （1）荧光光谱的形状与激发波长无关(荧光光谱 的强度与激发波长有关) （2）荧光光谱比激发光谱波长长 （3）镜像对称
（4）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC）
系间跨跃是发生在两个不同多重态之间无辐射跃迁，如从S1 到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能 层有较大重叠时，处于这两个能层上受激电子自旋方向发生 变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程 称为系间跨跃。发生在不同多重态之间
n
MX hvi MX*
4400 4000
i1
3600
固定lem=620nm(MAX)
3200
n
2800
MX* MX hv j 2400
j1
2000
1600
lex =290nm (MAX)
1200
800
400
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
vibrational internal conversion

5.空白溶液测试： 设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样
架内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近 零时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
6.系列维生素Ｂ２标准溶液的测试： 把各标准样品按从稀到浓的顺序置于试样架内，和空白溶液测
3.仪器自检： 预热仪器20分钟后，双击电脑桌面上“RF-530XPC”
图标，仪器在计算机的引导下开始自检，约3分钟完毕，此 时仪器操作软件打开。
若此时软件为“光谱测定”模式，则点击“Acquire Mode”主菜单，在下拉菜单中选择“Quantitative”，此时软 件转为“定量测定”界面模式。
（☆注意：在一定浓度范围内适用）
? 问题：
试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。
1.4 荧光仪的基本构造
？问题：荧光光度计与紫外-可见分光光度计在光路设置
上有什么不同？为什么？
1.5 分子荧光分析法的应用简介
★ 常规分析应用：
☆ 定性分析：φf；λex；λem；峰形等 ☆ 定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C ☆ 其它（略）
2.2 实验流程
1、VB2的荧光光谱的绘制 2、标准工作曲线的制作 3、未知液的测定
1.开机： 打开RF-5301荧光分光光度计的电源开关，打印机开
关，开启电脑。预热仪器20分钟。
2. 配制系列维生素Ｂ２标准溶液： 取5个干净的50ml容量瓶，分别加入1.0, 2.0, 3.0,
4.0 , 5.0ml浓度为10.0μg/ml的维生素Ｂ２标准溶液用水稀释 至刻度，摇匀。
10-6 ~ 10-2 s F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s

分子荧光光谱分析法测定维生素Ｂ２一、目的要求1. 了解荧光光谱分析基本原理2. 掌握荧光法的定量分析方法（工作曲线法）3. 了解日本岛津RF—5301型荧光分光光度计的构造及其使用方法。

二、基本原理当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激发态中各种振动状态的一种。

然而由于分子通过与溶剂分子，同类分子或其他分子的碰撞，而失去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此过程中并不发光。

但当分子从激发态的最低振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级降落至基态的各个不同的振动能级时，则以光的形式辐射出能量，所辐射出的光即是荧光。

当固定激发光波长和强度不变，而记录荧光强度随波长变化的曲线，称为荧光光谱。

若固定荧光最强处的荧光波长不变而改变激发光波长，记录荧光强度随激发光波长变化的曲线，称为激发光谱。

当荧光物质分子受到光辐射后，不但产生荧光而且还将产生荧光分析中所不希望的瑞利散射光及其倍频光谱。

对于液体样品不但会产生瑞利散射光及其倍频光谱，还同时会产生拉曼光谱，这些光谱构成了对荧光光谱的干扰，在荧光光谱的测定和荧光物质的定量分析中必须给以识别和消除。

维生素Ｂ２（核黄素）在一定波长的激发光照射下会发射出绿色荧光，根据荧光强度在一定浓度范围内与荧光物质浓度成正比，用标准曲线法对样品进行定量分析，在线性良好的情况下，也可用浓度直接读出被测样品的浓度。

一般而言，所选择的激发光要有利于排除瑞利光谱和拉曼光谱的干扰。

在此基础上再选择激发灵敏度高的激发波长及合适的滤光片，对于维生素Ｂ２可选择270nm的激发光，使用UV-35滤光片。

三、仪器与试剂１、仪器日本岛津RF—5301荧光分光光度计，液体样品架，UV—35截止型滤光片50ml容量瓶8个，100ml烧杯2个，洗瓶一个，玻璃棒二根，去离子水。

２、试剂A．１％的醋酸溶液B．维生素Ｂ２标准溶液：称出10.0mg维生素Ｂ２先溶于少量的１％的醋酸溶液，然后转移到1000ml容量瓶中，用１％的醋酸溶液定容至刻度，摇匀，至阴暗处保存。

荧光物质在特定波长光的照射下，可以发出比照射光波长更 长的荧光，通过测量荧光强度和荧光波长，可以对荧光物质 进行定性和定量分析。
发展历程
1
分子荧光分析法的发展历程可以追溯到20世纪 初，当时科学家们开始研究荧光现象。
2
在20世纪50年代，随着荧光光谱仪的发明，分 子荧光分析法得到了广泛应用。
3
近年来，随着高灵敏度检测设备和技术的发展 ，分子荧光分析法在生物、医学、环境等领域 得到了越来越广泛的应用。
全自动化设备
实现样本自动进样、分析、数据处 理和结果输出等功能。
分析方法改进
优化荧光探针
改进荧光探针的设计，提高其 灵敏度和特异性。
多元分析方法
结合多种分析技术，形成多元 分析方法，拓展分析范围。
实时动态监测
实现实时、原位监测，提高分 析的及时性和可靠性。
06
结论与展望
研究成果总结
分子荧光分析法在生物样品检测方面具有较高 的灵敏度和选择性，能够实现对多种生物分子 的同时检测。
物样品检测。
在未来，分子荧光分析法将会在更多的领域得到 应用，如生物医药、环境监测、食品安全等，为
人类的生活和健康提供更可靠的保障。
THANKS
感谢观看
研究生物分子的结构和功能 检测生物样品中的基因突变 检测药物在生物体内的代谢过程
在化学分析中的应用
研究化学反应的动力学过程 分析化学合成中的产物
检测化学试剂的纯度和杂质含量
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分子荧光分析法的优缺点
优点
选择性强
灵敏度高
荧光分析法对某些物质的选择性较高，可以 较为准确地测定某些特定的物质，适用于复 杂基质样品的检测。
荧光分析法的仪器设备相对昂贵，实验成本较高，需 要专业的技术人员进行操作和维护。