(自学)体外定点突变

采用重叠PCR进行定点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。

而采用重叠引物PCR介导的定点突变实验是一种快速有效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。

该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链, 从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。

此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。

该技术主要包括以下几步：设计引物，PCR扩增基因两端，回收两端片段，两端片段退火延伸，扩增全长基因。

1. 引物设计重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。

可以有三种方法来设计引物，具体如下图所示。

引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。

其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点。

突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。

2. 分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。

注意该步一定要用pfu酶，不要用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，从而可能会使产物移码突变。

3. 分别回收第2步所得两条PCR产物（一定要用胶回收，准确回收两条目的条带）。

4. 将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶进行PCR。

进行PCR约5-10轮即可。

5. 取第4步PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因。

定点突变技术的原理和步骤嘿，咱今儿来聊聊定点突变技术呀！这玩意儿可神奇了呢！你想啊，就好像是一个特别厉害的魔法，能让基因按照我们的想法来变一变。

那定点突变技术的原理是啥呢？简单来说，就是要精准地在基因的特定位置上搞点小改动。

这就好比是在一个庞大的基因拼图里，准确地找到那一块我们想要动的小拼图，然后给它换个模样。

这可不是随随便便就能做到的哦，得有非常精细的操作和技巧才行呢。

那具体咋操作呢？这步骤可不能马虎。

首先呢，得设计好要突变的那个点，这就像是给要走的路先规划好方向，可不能瞎走。

然后，要准备好各种工具和材料，这就跟出门得带好钥匙、钱包一样重要。

接下来，就是真正开始动手啦！就像一个精巧的工匠，小心翼翼地对基因进行操作。

把原来的那块小拼图取出来，再把我们准备好的新的放进去。

这过程可得特别仔细，不能有一点差错，不然可就前功尽弃啦！做完这些还不算完哦，还得检查检查，看看变的对不对，效果好不好。

这就像我们做完作业得检查一遍一样，可不能马马虎虎的。

你说这定点突变技术是不是很神奇？它能让我们对基因进行精确的改造，为很多领域带来了巨大的帮助。

比如说在医学上，能帮助我们研究疾病的发生机制，找到更好的治疗方法。

在农业上呢，能让农作物变得更优秀，产量更高，品质更好。

想象一下，如果没有定点突变技术，我们对基因的了解和利用会少多少啊！那得是多大的损失呀！所以说，这项技术真的是太重要啦！总之呢，定点突变技术就是这样一个既有趣又有用的东西。

它让我们对基因的操控变得更加精准和有效。

我们要好好利用它，让它为我们的生活带来更多的好处和惊喜。

你说是不是呀？。

名词解释体外突变的概念体外突变是指基因组的一处或多处发生变异且不会被遗传给后代的现象。

这种变异可以由环境因子引起，例如辐射、化学物质或病毒感染等。

体外突变在细胞或个体层面发生，可以导致某些细胞的突变，但不会被遗传给下一代。

体外突变与生物个体的遗传物质（DNA）相关，DNA分子是构成生命的遗传信息的基本单位。

它由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）组成的链状结构，编码了生物体所需的蛋白质合成信息。

然而，由于各种原因，例如自然辐射、化学物质暴露和病毒感染，DNA分子可能会发生变异。

体外突变是指这些DNA分子的基因组中发生的变异，但不会被纳入生物个体的遗传基因库中。

在细胞层面，体外突变可能会导致突发性突变，即DNA链断裂、碱基对插入或删除等。

这些突变可能会干扰基因的正常功能，导致细胞生命周期的异常或导致细胞死亡。

在个体层面，体外突变可能会导致一些可见的身体突变。

例如，辐射暴露可导致皮肤患者发生烧伤、灼伤或其他组织损伤;化学物质暴露可导致毒性反应，如过敏、溃疡或器官损伤。

虽然这些身体突变可能在短期内有明显影响，但它们通常不会被纳入生物个体的遗传信息中，因此不会被传给后代。

细胞或个体受到突变的影响通常是暂时的。

当细胞或个体受到突变的刺激后，大多数细胞会试图修复受损的DNA分子，以维持正常的基因组。

一些修复机制，如DNA修复酶，可以寻找和修复受损的DNA分子。

这种修复机制对于保护细胞免受严重的DNA突变和损伤非常重要。

然而，即使有修复机制的存在，体外突变仍然可能在细胞或个体中造成一些不可逆转的损害。

一些细胞可能无法进行修复，导致其死亡或不正常功能。

在个体层面，体外突变可能导致细胞的死亡，组织损伤或一些疾病的发展。

尽管体外突变在遗传学中的作用有限，但它仍然是生物学研究中一个重要的现象。

通过了解和研究体外突变，科学家们可以更好地理解生物体如何对不同环境因素做出响应，并制定相应的防护措施。

此外，研究体外突变还可以帮助人们更好地了解细胞和基因组的功能和调控机制，从而推动生物医学和药物研发领域的进步。

定点突变原理定点突变原理是指生物体基因组中某个特定位置的碱基序列发生突变的现象。

这种突变可以是单个碱基的替换、插入或缺失，也可以是更大范围的基因片段的改变。

定点突变可以导致生物体的遗传信息发生改变，从而影响其表型特征和遗传特性。

定点突变的发生通常是由于DNA复制过程中的错误或外部环境因素的影响。

在DNA复制过程中，酶类会不时出现错误，导致新合成的DNA链上出现错误的碱基。

此外，环境因素如辐射、化学物质等也会对DNA分子产生损害，导致定点突变的发生。

定点突变可以分为两种类型，点突变和插入/缺失突变。

点突变是指单个碱基的改变，包括错义突变、无义突变和无框移码突变。

错义突变是指由于碱基替换导致对应的氨基酸发生改变，从而影响蛋白质的结构和功能；无义突变是指由于碱基替换导致对应的密码子变成终止密码子，导致蛋白质合成过程中提前终止；无框移码突变是指由于碱基插入或缺失导致密码子的读框发生改变，从而影响蛋白质合成过程中的氨基酸序列。

插入/缺失突变则是指在基因组中插入或缺失一段碱基序列，导致基因的框架发生改变，进而影响蛋白质的合成。

定点突变的发生对生物体的遗传特性和表型特征都会产生影响。

在遗传学研究中，定点突变被认为是生物体进化过程中的重要驱动力之一。

一些有利于生物体适应环境的定点突变可以被自然选择所保留，从而在种群中逐渐普及。

而一些不利于生物体适应环境的定点突变则可能被淘汰。

因此，定点突变在生物体的进化过程中扮演着重要的角色。

定点突变也是许多遗传性疾病发生的原因之一。

一些致病基因中的定点突变会导致蛋白质结构和功能的改变，从而引发一系列遗传性疾病。

对定点突变的研究有助于我们更好地理解遗传疾病的发病机制，并为相关疾病的治疗提供理论基础。

总之，定点突变是生物体遗传信息发生变化的重要方式，它对生物体的遗传特性、进化过程以及遗传性疾病的发生都具有重要影响。

对定点突变的深入研究不仅有助于我们更好地理解生物体的遗传特性，也为相关领域的研究提供了重要理论基础。

定点突变的步骤定点突变是一种在基因研究中超级酷的技术呢。

咱就先来说说最开始要做的事儿吧。

得先确定好你要突变的那个基因序列。

这就像是在一大串密码里，找到你想搞点小把戏的那一小段密码一样。

这个基因序列的选择可不能马虎，得是对整个研究或者实验有重要意义的部分哦。

接着呀，就得设计突变引物啦。

这引物就像是一把特殊的小钥匙，能精准地找到你想要突变的地方。

设计引物的时候可讲究了，要考虑好多因素，什么碱基互补啦，长度合适啦之类的。

就像你搭配衣服，得考虑颜色搭不搭，款式合不合适一样。

有了引物之后呢，就是进行PCR反应啦。

这PCR反应就像是一个小小的基因复印机，不过呢，它可是按照你设计的引物来工作的。

它会把包含你要突变位置的那一段基因大量地复制出来，而且在这个过程中，因为有引物的引导，就会在复制的时候产生你想要的突变。

这个过程就像是一场小小的基因魔法秀，在分子的小世界里悄悄地改变着基因的模样。

PCR反应完了之后，还得对产物进行验证呢。

这就好比做完了一件艺术品，你得检查检查有没有瑕疵。

验证的方法有不少，像是测序之类的。

测序就像是给基因拍个高清照片，然后仔细看看每个碱基是不是都在正确的位置，有没有按照我们想要的突变发生了改变。

要是验证通过了，那就可以把这个突变后的基因放到细胞或者生物体里啦。

这就像是把一个新的小零件装到一个大机器里，然后看看这个新零件会给大机器带来什么样的变化。

也许会产生一些意想不到的效果，也许会按照我们预想的那样改变细胞或者生物体的某些特性。

定点突变虽然听起来很复杂，但就像做一道超级复杂的菜一样。

只要一步一步按照正确的步骤来，精心准备每一个材料，用心操作每一个步骤，最后就能做出一道让自己满意的“基因大餐”啦。

这过程中虽然可能会遇到不少小麻烦，就像做菜的时候盐放多了或者火候没掌握好，但只要不断调整，总会得到想要的结果的。

而且每一次成功的定点突变，都像是打开了一扇通往新知识新发现的小窗户，让人特别有成就感呢。

1.1.1 基因定点突变简介（INTRODUCTION ）定点突变（site-directed mutagenesis ）是指通过聚合酶链式反应（PCR ）等方法向目的DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。

定点突变能迅速、高效的提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR ）2. 一步法（全质粒PCR ） ► 搭桥法（重叠PCR ）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR ，其中前两次PCR 可同时完成，原理如图一所示：两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。

PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE ）1. 两对引物的Tm 值都应相当。

两端PCR 引物参照普通引物设计并无特殊要求。

所需引入突变包含在中间引物互补区域内 （需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。

2. 对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。

但两引物间互补部分的Tm 值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。

搭桥法定点突变3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。

两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。

（注意前两次不能使用taq聚合酶，因为taq在产物3’ 端多加一个A，导致后续的PCR3出现移码突变）4.克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。

定点突变技术：从单点突变到多点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。

蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。

对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质…体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。

蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。

对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。

而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。

定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。

对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。

准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。

设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。

基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。

定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。

体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。

蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。

对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。

而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。

定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。

一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。

若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。

体外定点突变PCR法构建abl T315I突变的重组质粒标准品石淙;张长林;简正伟;江梅;闻芳;万腊根【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2013(031)002【摘要】目的利用聚合酶链反应(PCR)定点突变技术构建含人类abl基因第6号外显子片段的野生型及含T315I突变型重组质粒,作为检测abl T315I基因突变的阳性对照和阴性对照标准品.方法先设计包括突变位点的两对引物,以健康人外周血基因组DNA为模板,扩增获得野生型和突变型abl基因第6号外显子片段,将其插入pSG5M-flag载体质粒中,并将所获重组质粒分别进行酶切与测序鉴定,通过紫外分光光度计检测标本的浓度和纯度.结果 DNA测序表明在预期位点上发生突变,abl 基因第315位氨基酸密码子由苏氨酸(Thr)残基突变为异亮氨酸(Ile)残基,所构建abl基因野生型和突变型质粒,经酶切和测序鉴定与目的片段完全一致.结论 PCR技术诱导定点突变准确、高效.所构建含野生型和T315I突变的abl基因重组质粒,可为检测abl基因T315I突变提供阴性和阳性对照以及质控品,同时也为T315I突变的相关研究奠定了基础.【总页数】4页(P111-114)【作者】石淙;张长林;简正伟;江梅;闻芳;万腊根【作者单位】南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006【正文语种】中文【中图分类】R733.72;Q343.1+3【相关文献】1.PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究 [J], 杨云霞;熊文碧;冯云;王伯瑶2.采用定点突变PCR构建c-kit D816V突变的重组质粒标准品 [J], 徐芬;张长林;简正伟;江梅;万腊根3.用PCR体外定点突变技术诱导霍乱毒素A亚基突变体的构建 [J], 司艺玲;苏堤;李付广4.利用PCR介导的基因定点突变技术构建L.plantarum P-8亚油酸异构酶突变体[J], 贾丽;赵国芬;李晨曦;张和平;包秋华5.利用PCR介导的基因定点突变技术构建L.plantarum P-8亚油酸异构酶突变体[J], 贾丽;赵国芬;李晨曦;张和平;包秋华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。