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蛋白思考题

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聚沉:
•聚沉（coagulation）：是指在聚沉剂的作用下，溶液中的蛋白质相互聚集为较大聚沉物（＞1mm）的过程
•原理：金属离子与蛋白发生螯合作用，使其变性，蛋白疏水基团外露，相互作用而聚集成大分子沉淀
•常见的聚沉剂：无机盐类（如氯化锌、氯化铁、氯化铝、硫酸锌、硫酸铝），聚合无机盐（聚合铝、聚合铁等）
•聚沉条件：-20℃以下，pH3~6，较高离子强度，高多价金属离子（Fe3+、Al3+）
截留分子量: (molecular weight cut-off, MWCO)：不能通过超滤膜的最小分子量如：MWCO为10kDa超滤膜，截留大于10kDa的所有分子，小于10kDa的分子能通过
盐析:
原理:蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随着盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）
盐析发生的原因：盐浓度增高到一定数值时，水活度降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出
盐析结束后，常需要用透析法或凝胶过滤层析法对蛋白样品进行脱盐处理
进行蛋白质盐析沉淀时，最常选取的盐是硫酸铵。

与其它盐相比，具有如下优点：①溶解度大，对温度不敏感（25℃时溶解度为769g/L，0℃时为679）；②分级沉淀效果好；③蛋白在高浓度硫酸铵存在的环境下，生物学活性保持不变；④价格低廉，废液可作为农田肥料
盐析法一般采用分级沉淀法操作，举例：先选择25%饱和度硫酸铵，使部分杂蛋白由于盐析作用沉淀下来，而目标蛋白处于溶解状态而保留在上清中；弃去沉淀，保留上清，在上清中加入60%饱和度硫酸铵，使目标蛋白发生盐析作用而沉淀下来，弃去上清，沉淀蛋白即可作为后续纯化用
排阻极限、
超滤:是指选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法
透析:
•原理：透析是利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，把不同性质的物质彼此分开的一种方法
•对于蛋白质样品，透析过程中因蛋白质分子体积很大，不能透过半透膜，而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中，因此不断更换透析用水即可将蛋白质与无机盐小分子物质完全分开。

蛋白的分离纯化过程中常用此法脱去无机盐（如硫酸铵）
•如果透析时间过长，可采用低温条件下进行，以防止微生物滋长、蛋白变性或降解
絮凝:
•絮凝（flocculation）：是指在絮凝剂的作用下，通过吸附、交联、网捕，把蛋白质聚
结为大絮体沉降的过程
•大致原理：絮凝剂大分子借助离子键、氢键和范德华力，同时吸引大量蛋白，发挥“中间桥梁”作用，最终聚结成网状絮体结构而沉淀下来
•常见的絮凝剂：淀粉、树脂、单宁、离子交换树脂及纤维素衍生物（往往含大量带电基团）
•絮凝作用一般在聚沉作用之后使用；絮凝剂的选择应根据成本、毒性等具体情况考虑；应通过试验确定最适合的絮凝剂类型、用量及作用条件
凝胶过滤色谱
1.简述应用超滤法浓缩蛋白样品的基本原理及该法的优点和局限性。

是指选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法。

优点&局限性
•优点：超滤浓缩技术的优点是操作简便，不需添加任何化学试剂，实验条件温和，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止蛋白质分子的变性、失活。

在蛋白质分
子的制备技术中，超滤除用于浓缩外，还可用于蛋白样品的脱盐和脱水•局限性：不能直接得到蛋白干粉制剂。

对于蛋白质溶液，一般最终只能浓缩到10~50％的浓度
2.蛋白质样品的沉淀法有哪些优点与局限性？有哪几种常用的沉淀方法？选择沉淀方法时需要考虑哪些因素？
•在生化制备中常用的沉淀方法有：
①盐析法
②有机溶剂沉淀法
③等电点沉淀法
④聚乙二醇沉淀法
⑤选择性沉淀法
⑥结晶沉淀法
3.蛋白质样品的浓缩有哪几种方法?其各自的原理分别是什么?
常用的浓缩方法主要有超滤法、沉淀法、冷冻干燥法、吸附法、双水相分离法
超滤法:是指选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法。

沉淀法：指在样品中加入适量的中性盐或有机溶剂等，使目标蛋白变成沉淀析出，再用合适的缓冲液溶解沉淀的方法。

沉淀法既可达到浓缩蛋白样品目的，还可部分除去杂质。

4.描述应用层析技术时一般如何检测装柱质量的好坏？
•检测装柱质量
–a、对光检查。

对光肉眼观察装填好的凝胶柱：柱内凝胶应均匀、无纹路、无气泡
–b、可通过加样易于观测的有色物质进行洗脱（如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等），来观察洗脱过程中色带的下降是否均匀，判断装柱质量。

如果色带
歪曲弥散，则需重新装柱。

5.描述进行层析分离蛋白样品时采用手动加样法的具体操作？
•手动加样法的具体操作：填装好的凝胶柱经平衡后，用胶头滴管吸取柱床上层部分多余洗脱液，待洗脱液下降至近床表面2-3mm时，关闭柱出口（注意不能使洗脱液全部流干）；用胶头滴管吸取一定体积的样品液后，贴柱内壁旋转缓缓加入，以防加样过快导致凝胶床面表面受损；加样完毕后，打开柱出口，让样品液缓慢渗入凝胶床内；当样品液面恰与凝胶床表面持平时，贴内壁小心加入几毫升洗脱液冲洗内壁，并使洗脱液高出凝胶床表面2-3cm，此后即可进行恒流洗脱。

6.凝胶过滤层析技术具有哪些特点？主要有哪些用途？
凝胶过滤层析特点：
（1）介质不带电荷，不溶于水，亲水性好，具化学
惰性，不与被分离蛋白发生化学反应，分离条
件温和，不会使蛋白变性失活
（2）分离效率高，回收率较高
（3）广泛应用于蛋白质混合物的分离纯化，脱盐等
（4）一般采用细长柱
（5）经过凝胶过滤层析分离后样品将被稀释，因此
上样前需对样品进行浓缩
•层析技术是利用蛋白质混合物中各种蛋白的物理化学性质的不同（分子大小、带电性质、吸附力、分子亲和力等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离目的的技术
1.蛋白质样品的脱盐及缓冲液更换
2.蛋白质样品的分级分离
3.蛋白质分子量的测定
7.良好的凝胶过滤层析介质应满足什么样的要求？常用的凝胶过滤层析介质的种类有哪几种，试写出代表这些介质的英文名。

①凝胶颗粒内部具有三维网孔结构：能使不同分子量的蛋白质得以分离
②亲水性高，表面具惰性：即介质与蛋白质之间不发生化学或物理相互作用
③稳定性强：在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长
④机械强度较高：能承受较高的操作压力（流速）。

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蛋白质化学思考题

蛋白质化学思考题

第一章绪论1．基因组（genomic）:体现正常细胞功能的全套染色体中的全部基因。

蛋白质组：一种基因组所表达的全套蛋白质, 即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。

功能基因组：表达一定功能的全部基因所组成的DNA序列，包括编码基因和调控基因。

2．如何理解从基因组－蛋白质组是一个复杂而漫长的里程。

基因组研究可以通过序列预测潜在的基因，从而进行研究。

但遗传信息从DNA传递到蛋白质的过程中，存在着RNA水平和蛋白质水平上遗传信息的加工，使得许多蛋白质很难找到直接对应的ORF，为研究带来困难。

基因组不论大小，其核苷酸的数量总是很明确的。

然而，对蛋白质组来说，大部分蛋白质在合成后都进行化学修饰，如磷酸化、糖基化、酰基化等，这样蛋白质组的蛋白质种类将是基因组基因数目的几倍。

在个体发育的不同阶段或细胞的不同活动时期，细胞内产生的蛋白质种类是不一样的，而且不同蛋白质的寿命不同。

蛋白质的另一个特征是，不同的蛋白质通常分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关。

更为重要的是，许多蛋白质在细胞里不是静止不动的，它们在细胞里常常通过在不同亚细胞环境里的运动发挥作用。

不同蛋白质的相互作用导致了不同的功能，或参与信号转导，或形成蛋白质复合体，成为细胞结构或参与调节转录。

使得我们无法从基因组水平对蛋白质演绎的复杂生命活动加以描述和预测。

DNA链上只有四种碱基排列，蛋白质有20氨基酸组合（不算氨基酸修饰）。

溶解度、稳定性等性质各异。

细胞内蛋白质含量差异，蛋白质之间达106数量级，存在蛋白质类型的干扰。

使得对蛋白质研究较为困难。

虽然蛋白质组学研究的支撑技术（双向凝胶电泳、质谱技术、生物信息学技当前蛋白质组学研究的瓶颈。

所以，从基因组－蛋白质组是一个复杂而漫长的里程。

第二章蛋白质一级结构术等）已经取得了巨大的进步并在蛋白质组学研究中发挥着决定性的作用，但不可否认，低检测力、缺乏快速、高效的手段是1．各种氨基酸的三字母符号和单字母符号甘氨酸（Gly，G）亮氨酸（Leu，L）丙氨酸（Ala，A）异亮氨酸（Ile，I）缬氨酸（Val，V）脯氨酸（Pro，P）丝氨酸（Ser，S）苏氨酸（Thr，T）半胱氨酸（Cys，C）甲硫氨酸（Met，M）天冬氨酸（Asp，D）谷氨酸（Glu，E）天冬酰氨（Asn，N）谷氨酰氨（Gln，Q）赖氨酸（Lys，K）精氨酸（Arg，R）组氨酸（His，H）苯丙氨酸（Phe，F）酪氨酸（Tyr，Y）色氨酸（Trp，W）2．名词解释：同源蛋白质（homologous protein）：一组来自同一祖先，随着进化而分化为具有不同结构但功能相同的蛋白质。

蛋白质等电点测定和沉淀反应思考题

蛋白质等电点测定和沉淀反应思考题

思考题
1、蛋白质沉淀有哪几种方法？哪些是可逆的沉淀反应？
2、乙醇引起的变性与沉淀实验时，其中一管加入pH4.7 醋酸-醋酸钠的缓冲溶液有何目的？
3、通过预习请你简单设计提取核酸过程中可用什么方法去除蛋白质，达到提纯核酸的目的，为什么？
1.答： <1> 蛋白质沉淀的方法：盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；低温下用乙醇（或丙酮）；重金属盐沉淀法；生物碱试剂以及某些酸类沉淀法
<2> 低温下用乙醇（或丙酮）；盐析作用
2.答：利用缓冲溶液来维持溶液原来的PH
3.答：酚氯仿抽提出去蛋白质，再用乙醇沉淀得到核酸。

因为酚可以使蛋白质沉淀，离心后位于水相和有机相之间，而核酸溶解于水相。

再加入NaAc和无水乙醇在低温下可以夺取核酸分子周围的水分子，使核酸沉淀。

因为在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

食品化学思考题—第五章蛋白质

食品化学思考题—第五章蛋白质

第五章蛋白质一、选择题1、氨基酸在等电点时具有的特点是（C ）。

A、不带正电荷B、不带负电荷C、在电场中不泳动D、溶解度最大2、中性氨基酸的等电点范围是（D ）。

A、7.6~10.6B、6.3~7.2C、2.8~3.2D、5.5~6.33、谷类蛋白质中的限制氨基酸是（ B ）。

A、精氨酸B、赖氨酸C、酪氨酸D、色氨酸4、在强烈的加热条件下，Lys的ε－NH2易与（AB ）发生反应，形成新的酰胺键。

A、天冬氨酸B、谷氨酸C、天冬酰胺D、谷氨酰胺5、赖氨酸为碱性氨基酸，已知pKa1=2.18，pKa2=8.95，pKa3=10.53，则赖氨酸的pI为（ C ）。

A、5.57B、6.36C、9.74D、10.53酸性氨基酸：（1+3）/2；碱性氨基酸：（2+3）/2；不带电，中性：（1+2）/26、易与氧化剂作用而被氧化的氨基酸有（ABCD ）。

A、蛋氨酸B、胱氨酸C、半胱氨酸D、色氨酸7、下列氨基酸中不属于必需氨基酸是（B ）。

A、蛋氨酸B、半胱氨酸C、缬氨酸D、苯丙氨酸8、美拉德反应不利的一面是导致氨基酸的损失，其中影响最大的人体必需氨基酸（A ）。

A、LysB、PheC、Va lD、Leu9、在人体必需氨基酸中，存在ε-氨基酸是（D ）。

A、亮氨酸B、异亮氨酸C、苏氨酸D、赖氨酸10、构成蛋白质的氨基酸属于下列哪种氨基酸（A ）。

A、L-α氨基酸B、L-β氨基酸C、D-α氨基酸D、D-β氨基酸11、蛋白质水解时肽的苦味强度取决于（ABC ）。

A、氨基酸的组成B、氨基酸的排列顺序C、水解用酶D、必需AA的含量12、对面团影响的两种主要蛋白质是（ C ）A、麦清蛋白和麦谷蛋白B、麦清蛋白和麦球蛋白C、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白D、麦球蛋白和麦醇溶蛋白13、乳蛋白中的蛋白质为（CD ）。

A、结合蛋白B、简单蛋白C、磷蛋白D、球蛋白14、属于大豆蛋白组分的有（ABCD ）。

A、2SB、7SC、11SD、15S15、下列蛋白质中不属于金属蛋白的是（A ）。

生物化学思考题

生物化学思考题

生物化学思考题蛋白质1、蛋白质含量的测定方法有哪些？答：蛋白质含量的测定方法主要有：（1）凯氏定氮法：蛋白质含量＝蛋白质含N量×6.25（2）紫外比色法（3）双缩脲法（4）Folin—酚法（5）考马斯亮兰G—250比色法2、蛋白质的基本组成单位是什么?蛋白质经过怎样处理才可产生这些基本组成单位?答：蛋白质的基本组成单位是氨基酸。

蛋白质经过如下三种处理均可产生氨基酸基本单位：（1）酸水解：常用 6 mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110℃ 20小时左右。

（2）碱水解：一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。

（3）酶水解：已有十多种蛋白水解酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、热激蛋白酶等。

反应条件温和，酶水解时间长，反应不完全。

3、已知末端α-COOH，pK3.6，末端α-NH3+pK8.0 ε-NH+3pK10.6。

计算Ala-Ala-Lys-Ala的等电点。

4、简述蛋白质一级结构的测定顺序。

答：测定蛋白质一级结构的先后顺序为：（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。

（2）拆分蛋白质分子的多肽链。

（3）断开链内二硫键。

（4）分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目。

（5）鉴定多肽链的N、C瑞残基。

（6）裂解多肽成小的肽段。

（7）测各肽段的氨基酸序列。

（8）重建完整多肽链的一级结构。

（9）确定二硫键的位置。

5、从热力学上考虑，一个多肽的片段在什么情况下容易形成α-螺旋，是完全暴露在水的环境中还是完全埋藏在蛋白质的非极性内部?为什么?答：当多肽片断完全埋藏在蛋白质的非极性内部时，容易形成氢键。

因为在水的环境中，肽键的C＝O和N－H基团能和水形成氢键，亦能彼此之间形成氢键，这两种情况在自由能上没有差别。

因此相对的说，形成α－螺旋的可能性较小。

而当多肽片段在蛋白质的非极性内部时，这些极性基团除了彼此之间形成氢键外，不再和其它基团形成氢键，因此有利于α－螺旋的形成。

6、某氨基酸溶于pH7的水中，所得氨基酸溶液的pH为6，问此氨基酸的pI是大于6、等于6还是小于6?氨基酸在固体状态时以两性离子形式存在。