长江大学学报（自科版）农学卷２００７年９月第４卷第３期ＪｅｅｒｎａｔｏｆＹａｎｇｔｚｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔＳｏｌＥｄｉｔ）ＡｇｒｔＳｏｌＶＳｅｐ．２００７。ＶｏＬ４Ｎｏ．３
植物线虫的分泌蛋白质及其功能研究进展
应喜娟，刘丽娟，柳宇琰。罗大民（厦门大学生命科学学院．福建厦门３６１００５）罗云（华中师范大学医学院。湖北武汉４３００７０）
［摘要］植物体内寄生的植物线虫必须寄生于宿主体内并获取充足的营养才能完成完整的生活史。植物线虫的寄生过程主要是依靠线虫分泌蛋白质的作用来完成。近年来。对植物线虫分泌蛋白质的研究取得了重大进展。分离出一系列由线虫表皮、侧器、食道腺等分泌的蛋白质．这些蛋白在线虫与植物相互作用的过程中起重要的作用ｚ破坏宿主细胞壁．影响宿主细胞周期．改变宿主细胞代谢过程和传导信号．选择性蛋白质降解、抵抗宿主细胞对线虫的防御等。［关键词］植物线虫Ｉ植物线虫一宿主互作，分泌蛋白［中圈分类号］￥４３６．４１２．２９；Ｑ７１［文献标识码］Ａ［文章编号３１６７３—１４０９（２００７）０３一．￥００５一０４
植物线虫危害遍布世界各地，每年造成的农业经济损失超过７７０亿美元Ⅱ］．。植物线虫从植物获取营养的方式主要有非固定和固定性取食２种。非固定取食的线虫在一个取食位点仅停留一段时间，而固定取食的线虫，如根结线虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｓｐｐ．）和胞囊线虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｐｐ．ａｎｄＧｌｏｂｏｄｅｒａｓｐｐ．）等，它们侵入根部并诱导根部细胞分化形成特殊的取食结构——巨型细胞，作为线虫发育和繁殖的持续营养源［－２，３］。植物线虫分泌的蛋白质一直都是线虫研究的热点，这些从线虫表皮、侧器、食道腺分泌出来的蛋白质与线虫寄生生活密切相关，并具有不同的功能，在线虫的寄生过程中，扮演不同的角色。它们破坏宿主细胞的细胞壁结构，使线虫能够入侵宿主；重新启动宿主细胞的细胞周期和再次分化，最终诱导形成巨型细胞；改变宿主细胞新陈代谢过程，为线虫提供其所需的营养物质；结合植物细胞信号传导途径受体，改变宿主细胞的生理活动；抵抗宿主细胞的免疫反应，保护线虫不受侵害。这类与线虫寄生密切相关的蛋白质是植物线虫最为有利的进化特征Ｈ～８］。植物寄生线虫所分泌的蛋白质是线虫得以完成寄生生活的关键因素，是研究植物线虫寄生机制并从中寻求防治线虫危害的重要环节。目前，对这类蛋白质的研究主要通过分离分泌蛋白质、克隆与寄生有关的ｃＤＮＡ来进行［ｇ“０３。此外，抗原抗体特异识别反应、ＨＰＬＣ及二维聚丙烯酰胺凝胶电泳在分泌蛋白质的研究也得到了广泛的应用。指纹图谱技术与基因芯片技术用于比较线虫不同生活时期及不同组织ｍＲ－ＮＡ的表达情况，并从中筛选与寄生相关的基因；鸯立线虫食道腺ｃＤＮＡ文库、ＥＳＴ—ｃＤＮＡ文库，通过对同源基因的筛选、核酸杂交技术、抗体识别表达ｃＤＮＡ文库来分离与线虫寄生相关的基因都是该领域常见的研究方法。ＲＮＡｉ技术也是研究基因功能的有力手段，已越来越多的应用到寄生相关基因的研究中［１１～１３Ｊ。
１表皮因子
线虫表皮具有复杂的细胞外结构，它对线虫形态维持、蜕皮及保护线虫不受体外环境侵害有重要作用。由真皮细胞表达并分泌至表皮的蛋白质不仅有构成线虫外骨骼的重要组分胶原蛋白，还具有能使线虫免受宿主防御系统伤害的蛋白埙。研究发现用单克隆抗体与线虫表皮蛋白质结合后，能抑制线虫在宿主组织中的迁移口‘１。在马铃薯金线虫（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）表皮发现的过氧化物还原酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
［收稿日期］２００７—０６—０１［基金项目］围家基础科学人才培养基金项Ｉ三１（Ｊ０６３０６４９）；ｔ－海市科学技术委员会资助项目（０６ＤＺ２２１１０）［笼一作者简介］应喜蝎（１９８３０７女，福建南平市人，硕士研究生，研究方向为植物线虫与植物间的互作．
［通讯作者］罗大民（１９６２－），教授。主要从事动植物寄生线虫学研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｍｌｕｏ＠ｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．
万
方数据·６·长江大学学报（自科版）农学卷２００７年９月
ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）能具有降解宿主细胞生成的过氧化脂肪酸，抵御植物氧化防御，保护线虫不受侵害并阻断植物防御信号途径的功能‘利。在苍白球胞囊线虫（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａｐａｌｌｉｄａ）中发现的脂肪酸结合蛋白（Ｇｐ—ＦＡＲ一１），能够与亚麻酸结合，从而抑制植物抗性物质生成及茉莉酸信号途径‘”］。表明表皮细胞分泌蛋白质在线虫寄生过程中起重要的作用。
２侧器分泌的蛋白质
侧器是线虫的化学信号感受器，是加工、传递化学信号的器官。单克隆抗体与侧器分泌的蛋白结合后，影响线虫的蜕皮，从而影响线虫入侵植物组织的过程Ｉ－“］。在根结线虫侧器的分泌物中，发现了糖蛋白ｇｐ３２，它可能指引线虫第二期幼虫（Ｊ２）入侵并定位于植物根组织。尔后的研究发现分泌蛋白质ＭＡＰ一１具有Ｎ端信号肽，可能在线虫——植物互作的识别过程中起重要作用‘１６１。研究表明，侧器分泌的蛋白质可能有多种成分参与到线虫的寄生过程，并且具有不同的功能。
３食道腺分泌的蛋白质及其功能
植物线虫借助中空的口针将线虫食道腺分泌物注人宿主组织或细胞中，在宿主组织或细胞中行使不同的功能。这类由线虫食道腺分泌的行使寄生功能的蛋白质被称为寄生蛋白质（ｐａｒａｓｉｔｏｍｅ），表达寄生功能的基因被称为寄生基因（ｐａｒａｓｉｔｉｓｍｇｅｎｅ），对它们的研究是植物线虫研究的一个热点【ｌ“１７ｑ刘。３．１参与细胞壁分解的水解酶植物线虫必须侵入宿主才能完成寄生生活，它们不仅通过机械破坏植物组织，还通过口针分泌在食道腺细胞表达的用于改变细胞壁结构的酶类帮助它们侵入植物组织或在植物组织内迁移。当Ｓｍａｎｔ［５］第一次在马铃薯金线虫及大豆胞囊线虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｇｌｙｃｉｎｅｓ）食道腺分泌物中发现寄生基因伊ｌ，４一内葡聚糖酶（伊ｌ，４－ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ）基因时，即证实了这个猜想。这也是第一次在动物细胞中发现纤维素酶，它在线虫迁移过程中起作用。后续的研究也在南方根结线虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｎｃｏｇｎｉｔａ）发现了内葡聚糖酶［２０］。其他用于改变细胞壁结构的蛋白质还包括果胶水解酶，它可以降解果胶类多糖，破坏植物相邻细胞间的中胶层结构Ｉ－１８３等。目前研究者在马铃薯金线虫食道腺分泌物中发现了扩张蛋白（ｅｘｐａｎｓｉｎ），它能够通过打断细胞壁多聚物之间的氢键诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛［２¨。在马铃薯金线虫中，扩张蛋白与细胞壁降解酶同时分泌，这可能是破坏植物细胞壁使线虫能人侵宿主细胞的主要原因［２２１。３．２参与诱导巨型细胞形成的蛋白质植物线虫能诱导根细胞形成特化的取食结构——巨型细胞。虽然巨型细胞的形成机制还不清楚，但是研究发现在巨型细胞形成过程中食道腺细胞相当活跃，说明食道腺分泌物可能参与诱导巨型细胞形成。在食道腺分泌物中，分离出蛋白质ＳＸＰ／ＲＡＬ２及钙网蛋白（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）［２引，发现这２个蛋白质分别分泌入巨型细胞中，推测它们可能与巨型细胞的形成有关［２３．３参与细胞周期调控的蛋白质植物线虫能影响宿主细胞的细胞周期，促使其进行不完全的有丝分裂，形成合胞体结构。在马铃薯金线虫食道分泌物中分离出＜３ｋｕ的短肽，可以促进烟草叶细胞原生质的合成和人外周血单核细胞的分裂，因此这类短肽可能在植物线虫寄生过程中起促进宿主细胞有丝分裂的作用ｒ６１。分泌的短肽具有分裂素的作用，另有研究从食道腺分泌物中分离出蛋白质ＲａｎＢＰＭ［２引，它是一类在微管组织中心与Ｒａｎ结合的蛋白质，是重要的Ｒａｎ的调节蛋白。Ｒａｎ对微管组织、形成具有重要作用，因此在细胞分裂过程中，Ｒａｎ影响纺锤体的形成。在食道腺分泌物中含有ＲａｎＢＰＭ，显然将影响宿主细胞中Ｒａｎ与ＲａｎＢＰＭ的相互作用，从而影响细胞从有丝分裂间期进入分裂期。研究发现，短肽分裂素与ＲａｎＢＰＭ是同时分泌人宿主细胞的，猜测这两类蛋白质参与宿主细胞的合胞体的形成【２５］。３．４模拟植物细胞信号传导分子的短肽植物细胞信号传导分子对植物细胞的生理活动具有重要的调节作用，植物线虫通过模拟植物细胞信
号传导分子影响植物细胞的生理活动。除在马铃薯金线虫发现具有促进细胞分裂作用的短肽外，在胞囊
万
方数据第４卷第３期应喜娟等：植物线虫的分泌蛋白质及其功能研究进展
线虫与根结线虫中还发现了其他具有信号传递作用的短肽。大豆胞囊线虫的寄生基因Ｈｇ－ＳＹＶ４０［７］，与拟南芥次生分生组织细胞分化中ＣＬＡＶＡＴＡ途径的配体ＣＬＶ３蛋白质具有相同的ｃ－端的信号区，能够激活ＣＬＡＶＡＴＡ信号通路［２６］。ＣＬＡＶＡＴＡ是由配体ＣＬＶ３与磷酸激酶受体ＣＬＶ／ＣＬＶ２复合物结合后被激活，引导细胞分化的发生。大豆胞囊线虫通过Ｈｇ－ＳＹＶ４６的作用调节植物细胞分化，这一发现为线虫可能诱导植物细胞去分化，并重新分化形成巨型细胞的推测提供了证据Ⅲ。在南方根结线虫也发现了一个表达１３个氨基酸短肽的寄生基因１６Ｄ１０［１引，并且在根结线虫中具有相当的保守性，它与ＧＲＡＳ蛋白质家族的ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ样转录因子相互作用，它可能参与了寄生早期的线虫与植物间的信号传递［１¨。３．５参与调节新陈代谢的蛋白质植物线虫的寄生将改变植物细胞新陈代谢过程，为线虫提供适宜的寄生环境。对爪畦根结线虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｊａｖａｎｉｃａ）寄生基因的研究发现了表达分支酸变位酶的基因Ｍｊ－ＣＭ－ｌ［８］。分支酸变位酶是植物莽草酸途径（ｓｈｉｋｉｍａｔｅｐａｔｈｗａｙ）的关键酶，它催化分支酸生成预苯酸（ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ），最终合成苯丙氨酸和酪氨酸。动物中没有莽草酸途径，但是在植物中它是生成芳香族氨基酸及次生代谢产物的重要代谢途径。线虫分泌的分支酸变位酶不受植物反馈抑制的调节，它加快了分支酸香预苯酸转化的速率，从而竞争性抑制了莽草酸途径的另一个支路，即植物分支酸衍生物（ＣＤＣｓ）的生成。ＣＤＣｓ在调节植物生长发育、植物抗性方面起重要作用［８］。植物激素吲哚乙酸的合成受到Ｍｊ—ＣＭ－Ｉ表达产物的抑制ｏ７１，这一研究结果证实了植物线虫通过分泌分支酸变位酶打破植物莽草酸途径的平衡，抑制ＣＤＣｓ的合成，从而影响植物细胞的发育。ｉ３．６其他功能蛋白质由于高通量基因筛选技术的发展，从植物线虫食道腺基因中发现了很多未知功能的序列，它们有可能是植物线虫的寄生基因的序列，这些序列中有些在其他物种中找到它们已知功能的同源序列，由此可以推测它可能具有的功能；而有些序列则暂时无法了解其功能，有待研究的进一步深入。在对大豆胞囊线虫的寄生基因的研究过程中，利用ＰＳＯＲＴＩｆ分析发现，有３个ｃＤＮＡ克隆表达的蛋白质具有经典的人核信号ＮＬＳ，推测它们可能在宿主细胞内起作用［２明；还发现了与泛素化蛋白质水解途径有重大关系的蛋白质：泛素与Ｓｋｐｌ。Ｓｋｐｌ是ＳＣＦ复合物中的一个关键的骨架蛋白质，ＳＣＦ作为一个泛素连接酶，是蛋白水解小体的底物，具有特异性识别待降解底物的功能。线虫分泌Ｓｋｐｌ至宿主细胞可能通过特异降解某些蛋白质而调节植物细胞的生理活动使其更适合线虫的寄生［２¨。泛素在植物体内是过量的，线虫分泌的泛素可能通过传递特定的信号起作用［３０，３１］。这２种蛋白质具体在植物细胞内如何作用还有待进一步的研究。研究发现，在南方根结线虫中具有纤维素结合结构域的蛋白质（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）［捌，它可能在巨型细胞形成过程中起作用；还发现了具有卷曲螺旋（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）结构域的蛋白质，由于该结构域具有多种功能，因此这类蛋白质在植物一线虫相互作用过程中的具体作用未知［１引。确认这类已发现的未知功能的寄生基因将是以后寄生基因研究工作的一个重点内容。
４展望
由线虫表皮、侧器、食道腺分泌出来的蛋白质是线虫进行寄生生活所必须的，充分了解这类寄生相关基因的功能对植物线虫防治具有重要意义［＇３３，３４］。以已知功能的寄生相关基因为靶位点设计的药物或新型植物线虫生物防治方法探讨可能成为植物线虫防治研究的方向。目前已经发现植物ＲＮＡｉ技术可能是一种很好的生物防治的方法：Ｓｈｉｎｇｌｅｓ等Ⅲ３将以南方根结线虫基因１６Ｄ１０为靶基因设计的ｄｓＲＮＡ序列表达在拟南芥中，发现它能够有效的抑制线虫的寄生。
［参考文献］［１］ＪｕｎｇＣ．ｃａｉＤＧ·ＫｌｅｉｎｅＭ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｎｅｍａｔｏｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｃｒｏｐｓｐｅｃｉｅｓ口］．ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，１９９８，３，２６６～２７１．［２］ＤａｖｉｓＥＬ，ＨｕｓｓｅｙＲＳ，ＢｅｕｍＴＪ，ｅｔａｌ．Ｎｅｍａｔｏｄｅｐａｒａｓｉｔｉｓｍｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ。２０００，３８１３６５～３９６．［３］董绋。张路平，康云辉．植物线虫寄生策略及致病机理［Ｊ］．河北师范大学学报。２００３．２７（３）。２９８～３０８．［４］ＪｏｎｅｓＪＴ，ＲｅａｖｙＢ，ＳｍａｎｔＧ．ｅｔａ１．Ｇ｜ｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄＩｍｅｓｏｆｔｈｅｐｏｔａｔｏｃｙｓｔｎｅｍａｔｏｄｅＧ６ｃ·６ｃｄｆ喇Ｒｏｓｔｏｃｈｉｔｎｓｉｓ［刀．Ｇｅｎｅ，２００４，３２４１４７～５４．［５］ＳｍａｎｔＧ，ＳｔｏｋｋｅｒｍａｎｓＪＰＷＧ，ＹａｈＹＴ．ｅｔａｌ．ＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓｃｅｌｌｕｌａｓｅｓｉｎａｎｉｍａｌｓｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＰｌ，４－ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔＷＯ
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