酵母单杂交系统

酵母单杂交手册目录1简介2试剂盒包含的内容3缩写4 Y1H Gold 酵母菌株的相关信息5附加材料&酵母培养基A cDNA扩增、文库构建和筛选所需的附加材料B 相应的培养基要求6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建A方法：合成、克隆p目的基因-AbAi质粒B方法：构建诱饵-受体酵母菌株7利用AbA r的表达检测诱饵菌株A方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度8 cDNA文库的构建A方法：利用SMART技术合成cDNA第一链B方法：利用Long Distance PCR (LD-PCR)扩增cDNA第一链C方法：利用CHROMA SPIN+TE-400 Columns技术纯化合成的双链DNA9单杂交的文库的构建和筛选A方法：单杂交cDNA的文库的构建和筛选10结果分析11阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离A方法：通过划板确认受体表型B方法：酵母菌落PCR以消除Duplicate Clones（假阳性克隆？多拷贝？）C分离和纯化文库中可靠的具有受体活性的质粒D方法：区分阳性克隆和假阳性克隆E分析阳性克隆的序列12问题排除指南13参考文献附录A：质粒信息附录B：酵母生长培养基的配置及所需营养物附录C：SMART技术原理图1 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选蛋白-DNA的相互作用图2 将相应的片段整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株图3 利用SMART技术和酵母的特点构建和筛选你的文库图4 通过菌落PCR确认pBait-AbAi构建成功图5 利用SMART技术合成cDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec 图6 利用SMART技术进行扩增图7 利用CHROMA SPIN+TE-400技术并收集产物图8 说明受体基因表达阳性克隆和假阳性克隆之间的活性差异图9 通过共转化选择性培养基验证相互作用图10 pAbAi载体和做对照的p53-AbAi载体图谱图11 pGADT7-Rec载体图谱图12 pGADT7载体图谱表格表1 Y1HGold酵母菌株基因型表2 利用各种SD培养基验证Y1HGold酵母菌株的表型表3 AbA r本底表达的预期结果表4 RNA总量与最佳循环数直接的关系表5 Matchmaker Gold One-Hybrid问题排除指南表6 Set 1酵母培养基和Set 1 Plus酵母培养基的组分表7 Matchmaker Gold Protocols所包含的每一个内容A介绍Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System为建立酵母单杂交cDNA文库的建立提供了一个简单高效的方法。

1.酵母单杂交的基本原理酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。

用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。

在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。

据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。

酵母单杂交原理示意图2.酵母单杂交技术的特点酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。

应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。

近来，已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。

随着酵母单杂交体系的不断发展和完善，它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。

采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。

由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。

目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。

酵母单杂交技术1．酵母单杂交的基本原理酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA 结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。

用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。

在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。

据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。

酵母单杂交原理示意图2．酵母单杂交技术的特点酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。

应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。

近来，已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。

随着酵母单杂交体系的不断发展和完善，它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。

采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。

由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。

目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。

酵母单杂交(yeast one hybrid)技术，是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析。

运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，比其他体外技术获得的结果，更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。

1 酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术，最早是1993年由Li et al 从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。

目前认为真核生物的转录起始，需要转录因子的参与。

这些转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD)。

用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。

研究表明GAL4的DNA结合结构域，靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域，可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。

在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。

据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要它能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。

正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2部分组成：(1)将文库蛋白片段，与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒； (2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒。

酵母单杂交的原理及应用1. 引言酵母单杂交是一种基因工程技术，通过将不同的酵母菌株进行杂交，实现基因的转移和重组。

这种技术在生物医药领域和食品工业等多个领域有广泛的应用。

本文将介绍酵母单杂交的原理，以及其在生物学研究和应用领域的具体应用。

2. 酵母单杂交的原理酵母单杂交是基于两个重要的生物学现象：酵母菌的性别和重组。

酵母菌是一种真核生物，有两种性别：雄性和雌性。

酵母菌的重组是指在有性生殖过程中，两个父本酵母菌的基因经过交换，重新组合成新的基因。

酵母单杂交的原理如下： - 首先，选择两个具有不同性别的酵母菌株。

- 将这两个株种分别培养在不同的培养基中，分别生成没有交配伴侣的单倍体细胞。

- 利用化学或物理方法将两种单倍体细胞融合在一起，形成杂交细胞。

- 将杂交细胞培养在适宜的培养基中，使其进行有性生殖。

- 在有性生殖的过程中，两个亲本酵母的基因进行交换和重组，形成新的基因组。

重组的结果可能是基因突变、基因删除、基因重复等。

- 通过筛选和鉴定，筛选出具有特定性状的酵母单杂交子代。

3. 酵母单杂交的应用3.1 用于基因功能研究酵母单杂交可以用于揭示基因的功能和相互作用关系。

通过将感兴趣的基因与其他酵母菌基因进行单杂交，可以确定该基因的功能和参与的生物过程。

此外，酵母单杂交也可以用于酵母基因组的大规模互作网络研究，帮助科学家理解复杂的生物调节网络。

3.2 用于疾病研究与药物筛选许多疾病与基因突变有关，通过酵母单杂交可以研究基因突变对蛋白质功能的影响，从而揭示疾病机制。

此外，酵母单杂交还可以用于药物筛选。

通过将药物与酵母菌基因进行单杂交，可以评估药物对基因的作用和效果，为新药的发现提供线索。

3.3 用于产酵母菌株的改良与优化酵母单杂交可以用于改良和优化产酵母菌株的特性。

通过筛选和鉴定具有特定性状的酵母单杂交子代，可以选择出高产酵母菌株或改良后的酵母菌株。

这对于酿酒、发酵食品和酶工程等产业具有重要意义。