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酵母双杂交操作步骤(总9页)本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母单杂交技术1．酵母单杂交的基本原理酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA 结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。
在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。
酵母单杂交原理示意图2．酵母单杂交技术的特点酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。
应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。
近来，已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。
随着酵母单杂交体系的不断发展和完善，它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。
采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。
由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。
目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。
知⽆不“研”⼀⽂读懂酵母单双杂交点对点验证⼀、前⾔酵母双杂交由Fields和Song在1989年提出. 他的产⽣是基于对真核细胞转录因⼦特别是酵母转录因⼦GAL4性质的研究。
酵母双杂交就是基因转录所需的转录因⼦的两个结构域在两个互作蛋⽩的吸引下位置靠近，诱导了基因的表达。
酵母双杂交系统的最主要的应⽤是快速、直接分析已知蛋⽩之间的相互作⽤，及分离新的与已知蛋⽩作⽤的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋⽩之间的相互作⽤具有以下优点：•⑴作⽤信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因⼦的作⽤⽽给出的，省去了纯化蛋⽩质的繁琐步骤。
•⑵检测在活细胞内进⾏，可以在⼀定程度上代表细胞内的真实情况。
•⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因⽽可检测存在于蛋⽩质之间的微弱的或暂时的相互作⽤。
•⑷酵母双杂交系统可采⽤不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA⽂库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋⽩等多种不同亚细胞部位及功能的蛋⽩。
⼆、酵母单/双杂交简介1、酵母单杂交酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展⽽来的⼀种研究核酸-蛋⽩相互作⽤的⼯具，被⼴泛⽤于研究真核细胞内基因的表达调控，如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋⽩基因、分析DNA结合结构域信息等。
2、酵母双杂交酵母双杂交及系统是⼀种鉴定和检测蛋⽩质相互作⽤的研究⽅法，因其具有灵敏性⾼、功能强⼤、适⽤范围⼴等特点，现已被应⽤于多个研究领域。
①核蛋⽩酵母双杂交：核蛋⽩酵母双杂交技术最初由Fields等⼈在研究酵母转录因⼦GAL4性质时建⽴，后续经过不断改进已发展成为⼀种成熟的蛋⽩-蛋⽩互作研究⼯具，具有简便、灵敏、可反映蛋⽩在活细胞内互作真实情况的特点，被⼴泛应⽤于互作蛋⽩的筛选、蛋⽩相互作⽤的鉴定/验证、蛋⽩互作机理的探究、蛋⽩连锁图谱绘制等⼯作。
②膜蛋⽩酵母双杂交：DUALmembrane技术在传统的酵母双杂交系统的基础上，巧妙地利⽤分离的泛素系统（split-ubiquitin）进⾏蛋⽩质相互作⽤的筛选；泛素作为降解信号分⼦，⼈为分成两部分：N端（Nub），C端（Cub），互补重构的完整泛素分⼦可被泛素专⼀性蛋⽩酶（UBPs）识别，从⽽导致与泛素相连的蛋⽩被酶解。
第一实验：酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）一、目的掌握酵母双杂交原理和方法。
利用酵母双杂交方法在拟南芥转录因子AP2-EREBP家族中筛选与拟南芥Med25有相互作用的蛋白。
二、原理酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain，DBD)和转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)。
DNA结合结构域可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域可在其连接区适当部位断开，仍具有各自的功能。
将两个待测蛋白分别与这两个结构域组成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与DBD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
图 1-1 酵母双杂交基本原理酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。
其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。
