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第14章 核酸的物理化学性质

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核酸的理化性质

核酸的理化性质

线
尿嘧啶核苷酸
pK1 = 1.0 第一磷酸基
pK3 = 6.4 第二磷酸基
烯醇式羟基
21
pH
由于核苷酸含磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不 同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离 子。
在第一磷酸基和含N环解离曲线的交叉处，带负电荷的 磷酸基与带正电荷的含N环数目相等，此时pH即为核苷酸 的等电点：
完全水解 完全水解
嘧啶碱回收率高
6
二、碱水解
RNA的磷酸酯键对碱敏感、因此RNA易被碱水解， 产生核苷酸。 在室温，0.3～1mol/L KOH，24h，就可将RNA完全水 解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。
DNA无2′-OH，因此对碱有一定抗性：
生理意义： DNA更稳定 ，是遗传信息的载体。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
3.链球菌脱氧核糖核酸酶类
是一个内切酶，作用于DNA，产物为5’磷酸为末端的碎片，长度 不一，最适PH为7，需镁离子参与。
Dase只作用于DNA 12
4.限制性内切酶：
在细菌中发现有这类酶，主要降解外源DNA，第一个发现的限制 性内切酶是从大肠杆菌(E.coli.)中发现的(1968年)。
限制性内切酶的命名（以EcoR I 为例）：
7
三、酶水解
（一）核酸酶的分类
①按底物专一性分类：
RNase（核糖核酸酶） DNase（脱氧核糖核酸酶）
核酸内切酶 ②按对底物作用方式分类： 核酸外切酶
小球菌核酸酶：内、外切均可 ③按磷酸二酯键断裂方式分类：
3′-OH与磷酸基之间断裂 如 蛇毒磷酸二酯酶
5′-OH与磷酸基之间断裂 如 牛脾磷酸二酯酶
磷酸基（含两个羟基）的解离

《生物化学》核酸的物理化学性质

《生物化学》核酸的物理化学性质
（3）链球菌脱氧核糖核酸酶 (streptococcal deoxyribonuclease, Dnase） 是内切酶，作用于DNA，成为5 ' -磷酸为末端
的寡聚核苷酸，细菌中发现的这类酶，主要是降解外源的 DNA ，具有很严格的碱基序列专一性。如 EcoRⅠ，不需要ATP，只需要镁离子，专一性很 强，能识别DNA上6对碱基组成的序列，交错切割，
9.8
N
N
H
NH
N
NH
H
O O
HN
NH+
pK1' 3.2
N
HN
H
H2N
N
NH
H2N
N
NH
N
N
N-
pK
' 2
9.6
H
鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上
O
O
N-
NH+
pK3' 12.4
N-
N
H2N
N
H
NH
H2N
N
N-
3、核苷酸的解离：
由于核苷酸含有碱基和磷酸基，为两性电解质，在 不同的pH溶液中解离程度不同，在一定条件下可以形成 兼性离子。核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离， 核酸的酸碱性质与此有关。
质(如核酸、蛋白质、细胞结构等)的性质或物理状态的一类标记 分子。
探针技术是在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和
诊断的非常有用的技术，已在遗传性疾病诊断上开始应用。
例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取 DNA，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还 可以发现一些没有症状的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量DNA 后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。

核酸的理化性质

核酸的理化性质

限制性内切酶
原核生物(及病毒)中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中 4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列， 并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末 端，这类酶称为限制性内切酶（ristriction endonuclease）。 山东落花生花落东山 帘卷晚晴天，天晴晚卷帘 Was it a cat I saw?

二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
2、核苷的解离
3、核苷酸的解离
结合及释放 质子的能力
第 1、碱基的解离 14 章 碱基：含氮碱基，杂环化合物（很多生物碱的结构） 核 1）、具有芳香环的结构特征，呈平面或近乎平面 酸 含有共轭双键体系，紫外区有吸收（260nm）。 的 物 2）、氮原子位于环上或取代氨基上 弱碱性来自于环上氮原子，pKa约9.5，倾向于接受H 理 取代氨基（或曰碱基环外的氨基）碱性很弱，生理 化 条件下不能被质子化。 学 性 质
核酸的物理化学性质
一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收性质 四、核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的水解
（一）酸水解 糖苷键比磷酸二酯键 更易被酸水解 嘌呤碱基的糖苷键比 嘧啶碱基的糖苷键对 酸更不稳定
NH 2
酯键
O
N N O
N 9 N
5' HO P O CH2 O
-
糖苷
1' H H 2' OH
H
H OH
腺苷酸
（二）碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱 水解，产生核苷酸。 由于RNA的核糖上有2’OH基，在碱作用下形成 磷酸三酯。 磷酸三酯极不稳定，随 即水解产生，产生 2’,3’-环磷酸酯，再水 解成2’-核苷酸及3’-核 苷酸

核酸理化性质

核酸理化性质

3.3 核酸的理化性质、分离纯化和含量测定一核酸的分子大小一核酸的分子大小二核酸的溶解度与黏度•核酸微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂•黏滞度：DNA 〉RNA ；dsDNA〉ssDNA•DNA变性，黏度降低三核酸的酸碱性质•核酸是多元酸，具有较强的酸性;•DNA碱基对在pH4.0~11.0之间最稳定•DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5四核酸的紫外吸收天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值1232202402602800.10.20.30.4波长（nm ）光吸收123克原子磷消光系数e(p)•以每升核酸溶液中1克原子磷为标准来计算核酸的消光系数，称为克原子磷消光系数e(p)。

e(p)=A/CL•A：吸收值C：每升溶液中磷的克原子数L：比色杯内径厚度•增色效应hyperchromic effect核酸变性时，紫外吸收值e(p)值显著升高，称为增色效应•减色效应hypochromic effect在一定条件下，变性核酸可以复性，此时紫外吸收值e(p)值又回复至原来水平，称为减色效应五核酸的变性、复性和杂交(一) 变性核酸的变性denaturation维持核酸空间结构的作用力氢键和碱基堆积力被某些理化因素破坏，使核酸的空间结构改变，从而引起核酸理化性质和生物学功能的改变。

•增色效应•Tm值•黏度降低•旋光性降低•沉降系数S增加•浮力密度大大增加•对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定程度时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。

Tm：熔解温度(melting temperature) DNA的Tm值一般在70-85℃之间。

影响Tm值的因素•1.DNA的均一性均质DNA Tm范围小异质DNA Tm范围大•ii. G-C含量G-C含量与Tm值成正比关系G-C含量越高，Tm值越大•iii. 介质中的离子强度•离子强度较低的介质中，D N A的T m较低，范围较宽•离子强度较高的介质中，情况则相反•D N A制品保存在较高浓度的缓冲液(一般1m o l/L N a C l溶液)。

核酸的性质

核酸的性质

DNA的核苷酸序列测定
DNA的测序策略
DNA片断的序列测定
英国Sanger ， 1975年加减法，1977年末端 终止法，目前广泛用于DNA的自动测序 美国Maxam和Gilbert ， 1977年化学断裂法 基本原理：把DNA变成在不同碱基的核苷酸处 打断的四套末端标记的DNA片断，当相应于四 个不同碱基产生的四套DNA片断并排进行电泳 分离时，产生一个可以直接读出DNA顺序的区 带。
模板DNA的变性：双链DNA解离，使之成为单链，以便 它与引物结合 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性 成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的 互补序列配对结合（退火温度与Tm有关，温度太低非特 异扩增增加，温度过高引物和模板不易结合） 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半 保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板
真核生物mRNA的分离：亲和层析
真核生物的mRNA有polyA的尾巴，能被oligo-dT柱 子吸附而和其他物质分离开来
真核生物ｍＲＮＡ的分离
核酸纯度鉴定与含量测定
根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度 （若样品中含有杂蛋白或苯酚，则 A260/A280比值明显降低）
纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0
核酸的物理化学性质
核酸的水解 核酸的磷酸二酯键和糖苷键可 以被水解

室温条件下，DNA在碱中变性， 但不水解，RNA水解，水解产物为 2’-和3’-核苷酸的混合物。

化工专业生物化学课件—核酸的物理化学性质

化工专业生物化学课件—核酸的物理化学性质
– 只有纯的样品才能 用分光）
• 核苷酸中磷含量测定
• 摩尔磷吸光系数[ε(P)]的变化可 以判断核酸是否发生变性
– 增色效应： 核酸变性时，得到的单 链核酸的[ε(P)]要比双链核酸高出 25%，称增色效应
– 减色效应：复性后， [ε(P)]发生降 低后的现象，称减色效应
• 03 限制性内切酶
– 主要降解外源DNA
– 大肠杆菌来源的EcoR I
– 限制性内切酶与甲基化酶（A/C）成对出现
2.核酸的酸碱性质—碱基解离（P504）
• 碱基的酸碱性质：嘧啶和嘌呤碱杂环上的氮原子（N）及 其取代基具有结合与释放质子的能力
– 尿嘧啶核苷酸碱基的碱性极弱，解离常数一般测不出
• 核苷的解离
核苷酸的解离曲线（P507）
• 尿嘧啶核苷酸碱基的碱性极弱，基本测不出其含氮杂环的 解离曲线，因此没有碱性离子状态，也无pI
3.核酸的紫外吸收-1（P507）
• 原因：
– 嘌呤和嘧啶碱具有 共轭双键，在紫外 波段具有特征吸收 （260nm）
• 作用
– DNA或RNA定量测 定
– DNA（1.8）或 RNA（2.0）纯度测 定（A260/A280）
x(G+C)=(Tm-69.3)X2.44
• 环境的离子强度
– 较低离子浓度环境中，Tm低而宽 – 较高离子浓度环境中，Tm高而窄
5.DNA的复性（P509-10）
• 复性
– 变性的两条DNA单 链在一定条件下重新 形成双链的过程
• 退火
– 热变性的单链DNA 在缓慢冷却的过程中 复性的现象
– DNA片段越大，复 性越慢
• 02 核糖核酸酶T1
– 专一性更强：只水解鸟嘌呤核苷酸（G）3端的磷酸形成的磷酯键 – 耐热、耐酸

核酸性质


核酸的凝胶电泳
核酸的序列测定 DNA聚合酶链反应 DNA的化学合成
第十五章 核酸的研究方法
一 核酸的分离、提纯和定量测定
核酸制备
总的要求：防止核酸的降解和变性，要尽量保
持其在生物体内天然状态
注意的事项：条件温和，防止过酸、过碱、避
免剧烈搅拌，防止核酸酶作用
P513
第十五章 核酸的研究方法
（一）DNA的分离

Chapter14
核酸的物理化学性质
四
核酸的变性、复性及杂交
（三）、核酸的杂交
2. 常见杂交的类型


（1）Southern blotting （2）Northern blotting （3）Western blotting
（1）. Southern印迹杂交

将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的 滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂 交作用检测这些被转移的DNA片段
经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)×2.44


(3)介质中的离子强度 一般在较高的离子强 度时，DNA的Tm值较高，而且熔解过程发生在 一个较小的温度范围之内。
P509
Chapter14
核酸的物理化学性质
四
核酸的变性、复性及杂交
（二）、复性 (renaturation)

变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺 旋结构，这过程称复性 1. DNA复性的特点：
一、 核酸的水解
二、核酸的酸碱性质
三、核酸的紫外吸收
四、核酸的变性、复性及分子杂交 五、核酸的沉降特性
502
Chapter14
核酸的物理化学性质

核酸的物理化学性质和第15章核酸的研究方法辅导版

嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳 定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷 键。DNA在pH1.6于37℃对水透析可完全除去嘌呤碱； 在pH2.8于100℃加热1h，也可完全除去嘌呤碱。
为了水解嘧啶糖苷键，需要较高的温度。用甲 酸（98%～100%）密封加热至175℃2h，无论RNA 或DNA都可以完全水解，产生嘌呤碱和嘧啶碱，缺 点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在155℃加 热60min（对DNA）或80min（对RNA），嘧啶碱的 回收率显著提高。
DNA分子的热变性曲线
异质的
DNA变性温
度范围宽，
均质的DNA 变性温度范
bacterial DNA
Viral DNA
围窄。
影响DNA分子Tm的因素
（1）G－C含量：G－C之间有3个氢键，所以G －C含量越高Tm越高。通过测定Tm值，可以推
算出DNA中G－C的含量，其经验公式为:
xGC (Tm 69.3) 2.44
RNA只有局部的双螺旋，所以其Tm较低，变
性温度范围较宽。不管是DNA还是RNA，加入甲
酰胺可降低其Tm值。双链RNA的变性曲线几乎与 双链DNA相同。
1.一种浮萍的18SrRNA
2.酵母的杀伤RNA（双 链）加甲酰胺
3.同2，但无甲酰胺
DNA的复性
变性DNA在适当条件下，可以使两条分开的
单 链重 新 缔合 成 双链 DNA， 这 个 过程 称 为复 性 （renaturation）。将热变性的单链DNA骤然冷却， DNA不 能 复性 ， 只有 缓 慢降 温 才能 使 热变 性 的 DNA复性，这个过程又称为退火（annealing）。
核酸的碱水解
RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。

生物化学课件14 核酸的物化性质


尿嘧啶核苷酸 pK1 = 1.0 第一磷酸基 pK3 = 6.4 第二磷酸基 烯醇式羟基
pH
pH
三、核酸的紫外吸收
碱基、核苷、核苷酸和核酸在 240 ～ 290nm 的紫外波 段有强烈的光吸收， λmax=260nm
2006-3-22
上海大学生命科学学院
1、鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 2、含量计算 1ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）
2006-3-22
上海大学生命科学学院
2、RNAase ★RNase H
作用于DNA-RNA中的RNA链
★牛胰核糖核酸酶（ pancreatic ribonuclease) , RNase I
最适pH ：7.0-8.2 产物： 3′- 嘧啶核苷酸或以其为结尾的寡核苷酸。高度专一 的内切酶
★RNase T1 ★RNase T2
2006-3-22
上海大学生命科学学院
2006-3-22
上海大学生命科学学院
2006-3-22
上海大学生命科学学院
2006-3-22
上海大学生命科学学院
DNA抗碱水解 生理意义：
DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
2006-3-22
上海大学生命科学学院
（三）酶水解
非特异的磷酸二酯酶：
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30.98A （ P）＝ WL
ε：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径
• OD260的应用： 1. DNA或RNA的定量
– OD260=1.0相当于 • 50μg/ml双链DNA • 40μg/ml单链DNA（或RNA） • 20μg/ml寡核苷酸
2.判断核酸样品的纯度
尿素（PAGE中DNA ）
4、变性后理化性质变化
OD260增高 比旋度下降 酸碱滴定曲线改变
粘度下降 浮力密度升高 生物活性丧失
RNA变性：从螺旋到线团之间的转变 RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显
完全变性后核酸紫外吸收值增加： • 天然DNA 25－40%、RNA 约1.1% • 实质：碱基暴露
• 减色效应（低色效应） —— 复性时紫外吸收减少的现象
(三)
核酸的杂交
变性
复性
不同来源的 DNA分子
DNA-DNA 杂交双链分子
Southern杂交 Northern杂交 Western杂交
CH 2 O
N
-
OH pK 1.5
' 1
-
OH
-
O O P O OH
O O P O O
H
CH 2 O
N
CH 2 O
N
OH
OH
• DNA等电点为4～4.5； • RNA等电点为2～2.5
三、核酸的紫外吸收
• 碱基含有共轭双键
• 最大吸收峰260nm左右
核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔 磷即相当于摩尔核苷酸。
大小与G+C含量成正比。
• 指增色效应达50%时的温度 • 一般DNA Tm 值在85 - 90 C之间
Tm值大小与下列因素有关：
（1）DNA的均一性： （2）G－C含量：
经验公式： XG+C＝（Tm－69.3）×2.44
（3）介质中的离子强度：
(二)核酸的复性（renaturation）
H2N
N
NH
N
N
-
2、核苷的解离
•戊糖可增强碱基的酸性解离 •核糖中的羟基也可发生解离
3.核苷酸的解离
•磷酸基使核苷酸具有很强的酸性
O R O P OH
pK 0.7 1.6
' 1
O O P OH
N
OH
R
O
-
pK 5.9 6.5
' 2
O O P O
-
R
O
-
H
CH 2 O
H
• 变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的 单链重新缔合成双链——复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(annealing) 。
DNA复性
• 分子量越大复性越难； • 浓度越大，复性越容易； • DNA复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列DNA，复性快）。
– DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 – RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 – 含杂蛋白及苯酚，降低
3.判断DNA是否变性
四、核酸的变性、复性与杂交
(一) 核酸的变性（denaturation）
1、DNA的变性：
在某些理化因素作用下，DNA双链解 开成两条单链的过程。
第14章 核酸物理化学性质
一、核酸的水解
酸、碱、酶水解
• 作用于磷酸二酯键和糖苷键 • DNA/RNA对酸/碱的耐受程度有差别
二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
具有芳香环结构特点 • 能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变 • 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 ______主要是环内氨基的贡献
胞嘧啶中
NH2
' pK 2 9.8
HN
pK1' 4.15 N
H O H+ NNNNNH
N
NH
H
O N
N
N
-
HN
pK1' 3.2
H
H2N
HN
' pK 2 9.6
H2N
N
NH
N
NH
H
鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上
O
-
O H+ N
N
pK 3' 12.4
H
H2N
N
-
N
2、变性的实质
某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
降解：核苷酸骨架上3’，5 ’-磷酸二酯键的断裂
3、变性因素
高温（一般＞75℃）— 热变性
强酸、碱 — 酸碱变性
甲醛（Agarose中RNA ）
+
NH2
NH2
' pK 2 12.5
HN
pK1' 4.6 N
H
N
-
H
O N H O N H
O
N H
尿嘧啶及胸腺嘧啶中
O O O CH3 NH O
NH
pK1' 9.5 NH
N H O N H O
pK1' 9.9 NH
O N H
CH3
O
N H
NH2
+
NH2 N
NH2 N
由于变性或降解引起紫外吸收增加的现 象称增色效应
DNA变性
5、DNA热变性的特征
变性过程是“跃变式”的，而非渐 变
解链曲线： 连续加热DNA，以温度对
A260作图，所得的曲线称为解链曲线。
Tm：DNA变性时，OD260达
到最大值的50%时的温度称 为DNA的解链温度或融解温 度(Tm)。