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生牛奶中的主要微生物检测方法及其控制生牛奶中的微生物污染是一个常见的问题，主要包括细菌、真菌、酵母和寄生虫等微生物。
这些微生物会在奶牛乳汁采集、加工和贮存过程中引入牛奶中，给牛奶的品质和安全性带来潜在风险。
对生牛奶中的微生物进行检测和控制至关重要。
1. 细菌计数细菌计数是评价生牛奶卫生质量的重要指标。
常用的方法是平板计数法，即将取样的牛奶平铺在含有营养物质的琼脂平板上，培养一段时间后，通过计数菌落的数量来估算牛奶中的细菌数量。
2. 病原菌检测生牛奶中可能存在各种病原菌，如沙门氏菌、变形虫等。
常用的方法是聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附测定法（ELISA），通过检测目标基因和蛋白质来判断牛奶中是否存在病原菌的污染。
3. 酵母和真菌检测生牛奶中的酵母和真菌可能对牛奶品质造成影响，特别是发酵牛奶的生产。
常用的方法是培养法和PCR法，通过培养和检测特定基因来鉴定和计数酵母和真菌。
4. 蛋白质和乳酸菌菌种检测蛋白质和乳酸菌是生牛奶中的重要组分，其数量和菌种多样性直接影响乳品的质量。
常用的方法是电泳和PCR，通过分析蛋白质和菌种的特征来判断牛奶的质量。
为了控制生牛奶中微生物的污染，可以采取以下措施：1. 严格控制奶牛的健康状况，定期进行兽医检查和疫苗接种，防止病原菌的传播。
2. 保持牛奶采集和加工设备的清洁和消毒，避免微生物的交叉污染。
3. 控制牛奶的温度和pH值，不利于微生物的生长和繁殖。
4. 采用低温贮存和瞬时高温消毒等技术，杀灭牛奶中的微生物。
5. 引入先进的微生物检测技术，及时发现和处理牛奶中的微生物污染。
生牛奶中微生物的检测和控制是确保牛奶品质和安全的重要环节。
通过采用适当的检测方法和控制措施，可以有效预防和消除牛奶中的微生物污染，保证牛奶产品的质量和安全性。
食品中嗜冷菌的检测实验报告
实验目的：检测食品中是否存在嗜冷菌，初步了解食品卫生质量。
实验材料：
1. 细菌培养基
2. 无菌培养皿
3. 恒温箱
4. 食品样品
实验步骤：
1. 提取食品样品5克，加入15毫升无菌生理盐水中，摇匀。
2. 取1毫升加入含有10毫升细菌培养基的无菌试管中。
3. 对于每个样品，设置一个无菌培养皿，将1毫升的培养基稀释10倍加入培养皿中。
4. 将试管和培养皿放入恒温箱中，分别在15℃和25℃两个温度下培养。
5. 培养24小时后，观察每个培养皿内是否有菌落生长。
实验结果：
在15℃的条件下，每个培养皿中都有菌落生长，且形态相似，颜色为灰白色，形状为圆形或椭圆形，直径约为1-2毫米；在25℃的条件下，也都有菌落生长，但数量较少，形态和颜色与15℃下相似。
结论：
通过实验，证实了食品样品中存在嗜冷菌。
嗜冷菌是一种能在低温环境下生长的细菌，容易引起食品污染，影响食品的卫生质量，应加强卫生监管。
嗜冷菌检测方法嗜冷菌检测方法嗜冷菌概念牛乳挤出来要经过冷却处理，降低乳温从而抑制细菌的生长繁殖，但在低温条件下有些细菌也能生长，而这类细菌即为低温菌。
低温菌又包括嗜冷菌和耐冷菌。
嗜冷菌主要存在于低温环境中，包括两类微生物，一类是专性嗜冷菌（Psychrophiles）最高生长温度不高于20℃，最适生长温度为15℃，在0℃仍然可以生长繁殖的微生物；另一类为兼性嗜冷菌（Psychrotrophics），又名耐冷菌，最高生长温度高于20℃，最适生长温度高于15℃，在0～5℃仍然可以生长繁殖的微生物。
专性嗜冷菌主要分布在常冷低温区，对温度的变化比较敏感，20℃以上即很快引起死亡；而兼性嗜冷菌分布范围较宽，从常冷到不稳定的低温环境中都能分离到。
方法一：基准法—6.5℃，培养10天（仲裁法）1 范围此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验。
2 方法提要2.1 准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿。
2.2 将培养皿在6.5℃条件下培养10天。
2.3 根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数，选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数。
3试剂3.1 稀释液生理盐水：0.85％的氯化钠水溶液，灭菌。
3.2 培养基平板计数琼脂23.5g+脱脂奶粉1g，溶于1000ml水中。
必要时用滤纸过滤。
调节pH值为6.9±0.1。
将培养基分装倒入三角瓶中，每瓶100—150ml。
在121±1℃下灭菌15min，如果培养基马上要用，用水浴锅冷却到46±1℃。
如果不是，则为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷却到46±1℃。
注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。
4 仪器及玻璃器皿微生物实验室常用仪器，制备和稀释样品所用仪器以及：4.1 培养箱，可以调节并保持到6.5±0.5℃4.2 pH计，带温度补偿，精度为0.14.3 水浴，可以保持到46±1℃4.4 三角瓶，250—300ml，带合适的塞子。
牛乳中嗜冷菌的危害牛乳中嗜冷菌的检测方法-养牛技术嗜冷菌在-15—20℃之间最宜生长，其在保存过程中产生的大量胞外耐高温的脂肪酶和蛋白酶会分解脂肪和蛋白质，所以在高温杀菌后仍有残留，从而造成牛奶腐败变质。
为避免鲜牛乳发生变质,一般从收集到加工过程中都采取冷藏,但此时往往会导致乳中嗜冷菌占具主导地位,而其产生的耐热性酶类是主要造成鲜牛乳以及乳制品质量变差的一个主要原因.检测牛乳中细菌总数一般在37℃温度下进行48h培养,但该条件下嗜冷菌不会生长,从而往往被忽视,应加强检测。
下面就具体来了解一下：牛乳中嗜冷菌的危害牛乳中嗜冷菌的检测方法。
1、来源鲜牛乳中的嗜冷菌具有比较广泛的来源，且可分成较多类型的菌株，其中数量较多的是微球菌、假单胞菌以及产碱杆菌。
微球菌分布比较广泛，主要存在于动物体表、空气、水源以及、设备上；假单胞菌属主要在海水、淡水、土壤以及多种植物体内存在；产碱杆菌主要在饲料、水源以及粪便中存在。
在污染嗜冷菌的途径中，主要是通过接触个人，如药浴杯污染、挤奶工双手不卫生、水清洗乳头污染、贮存及运输设备不干净或没有严格消毒等，都容易导致嗜冷菌含量过高。
2、危害鲜牛乳中主要为兼性嗜冷菌，产碱杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏杆菌属、黄杆菌属以及无色杆属等，是目前经常能够分离到的嗜冷菌。
通过对以上菌株进行特性分析，发现其都会影响鲜牛乳的保存。
例如，假单胞菌具有很强分解蛋白质和脂肪的能力，能够导致脂肪发生分解，从而容易形成脂肪哈败味，还能够使其中的蛋白质发生分解产生蛋白胨；产碱杆菌，自身无法使牛乳中的糖类发生分解而产酸，但能够生成棕黄色、灰黄色的色素，还能够导致牛乳中含有的有机盐发生分解而生成碳酸盐，从而导致牛乳呈碱性，能够造成乳制品发生黏性变质。
也就是说，嗜冷菌能够使牛乳中的成分被破坏，这主要是由于嗜冷菌能够分泌耐热蛋白酶、脂肪酶而导致蛋白质、脂肪发生分解。
另外，在有氧低温条件下，嗜冷菌能够引起生色反应，如黄色、奶油色、绿色、红色、金色、黑色或者棕褐色等。
最常见的“嗜冷菌”，有耶氏菌和李斯特菌。
肉类、奶及奶制品、豆制品、沙拉和水产品等，都是较易受其污染的食物。
先说耶氏菌，它可引起多种疾病，最常见的是小肠结肠炎，主要表现为腹痛、腹泻、发热等症状，或出现类似阑尾炎的症状，偶尔也能引起肠道溃疡和穿孔。
耶氏菌还可以引起皮肤多形红斑、结节红斑和关节炎。
严重的话可致人发生败血症、脑膜炎、肺脓肿、肝脓肿、骨髓炎。
李斯特菌可引起新生儿、孕妇、老年人以及免疫功能下降或缺陷的人发病，它可引起新生儿败血症、脑膜炎，导致呼吸或循环衰竭，病死率高达100%。
孕妇感染后会出现畏寒、发热、头痛、肌痛、关节痛、背痛等类似上呼吸道感染的症状，还可引起早产、死产或新生儿脑膜炎而致其死亡。
成年人感染后，则可引起败血症，表现为发热、肌痛、腹泻和恶心。
感染李斯特菌后，还可导致中枢神经系统受损，出现脑膜炎、脑炎、脑脓肿，出现发热、头痛、恶心、呕吐和偏瘫等，约40%的病人还会发生呼吸衰竭，病死率较高。
此外，李斯特菌感染还会引起心内膜炎、化脓性结膜炎、发热性肠炎、肝炎、肝脓肿、胆囊炎、脾脓肿、关节炎、骨髓炎等。
被耶氏菌和李斯特菌污染的食物，经正常的煮烧可将细菌杀灭。
多数嗜冷菌在贮存期间，能产生热稳定性胞外降解性酶类（主要是蛋白酶、脂肪酶和碱性磷酸脂酶），在巴氏消毒过程中基本不受影响，这类热稳定性胞外蛋白酶和脂肪酶甚至经过UHT处理后仍能保持部分活性，造成乳及乳制品风味及质地上的变异，主要表现为：1.蛋白酶分解乳蛋白后，导致产品发苦，，水解过程中释放的氨基酸会使褐变反应加剧，分解k-酪蛋白，引起蛋白胶凝化。
2.分解脂肪后，导致游离脂肪酸增加，口感风味变差。
嗜冷菌的检验和控制目前用于检测生奶中嗜冷菌数量的方法有多种，最常见的方法是在5℃—7℃培养10天后计数，或将样品21℃增菌培养后，采用选择性培养基在21℃培养25小时后，将样品中G-杆菌作为嗜冷菌污染的指标，这些方法在时间及针对性上都存在严重的缺陷。
牛奶中嗜冷菌危害及其检测方法摘要: 虽然低温保藏及冷链技术限制了牛奶中微生物的繁殖与代谢, 但是在低温环境中恰恰非常适合嗜冷菌的生长代谢, 并影响牛奶质量。
生产中通常用巴氏杀菌和超高温灭菌来杀灭牛奶中的嗜冷菌, 却无法消除由嗜冷菌所分泌的较高的耐热性的脂肪酶和蛋白酶, 进一步影响乳及乳制品风味质地。
因此快速检测牛奶中的嗜冷菌, 对于控制生牛奶中嗜冷菌繁殖、提高乳制品产品质量、延长货架期等都具有重要的现实意义。
本文主要总结与讨论了牛奶中嗜冷菌的危害以及几种常见的对原料奶中嗜冷菌快速检测的方法, 包括直接荧光过滤技术、电阻抗法、酶联免疫吸附法、流式细胞计数法、氨肽酶法、聚合酶链反应结合酶联免疫吸附法, 并将它们在工业应用上的优缺点进行了比较。
关键词: 嗜冷菌; 原料乳; 快速检测; 危害ABSTRACT: The techniques of cryopreservation and cold chain limit the microbial reproduction and metabolism in milk. However, a low temperature environment is very suitable for the growth and metabolism of psychrophilic bacteria. Pasteurized and ultra high temperature sterilization is usually used to kill psychrophile, but they are unable to remove the heat-resistant lipase and protease produced by the psychrophile, finally to affect the flavor and texture of dairy products. Therefore, rapid detection of milk psychrophile in raw milk is important for microbial control, quality improvement and shelf-life extending. This paper summarizes and discusses the hazards of psychrophile in milk, as well as several common rapid detection methods for psychrophile in raw milk. These methods include direct fluorescence filtering technology, electrical impedance method, enzyme- linked immunosorbent assay, flow cytometry,aminopeptidase enzyme,. The advantages and disadvantages in industrial application are also compared.KEY WORDS: psychrophilic bacteria; raw milk; rapid detection; hazard引言嗜冷菌是一类菌的总称, 这类菌一般是在0℃～20℃之间最适宜生长, 由于这个温度范围与其他菌的最适生长温度范围相比要低很多, 故此得名嗜冷菌。
嗜冷菌主要包括两类微生物。
一类是专性嗜冷菌(Psychrophiles) , 另一类为兼性嗜冷菌(Psychrotrophics)又名耐冷菌[1]。
其中专性嗜冷菌最高生长温度不超过20℃, 最适生长温度为15℃或者更低, 在0℃依然可以生长繁殖。
而兼性嗜冷菌的最高生长温度高于20℃, 最适生长温度高于15℃, 0℃～5℃也能生长繁殖, 适应的温度范围更广, 在环境中存在更为广泛,食品中的腐败菌大部分为兼性嗜冷菌。
嗜冷菌种类繁多, 在已知的嗜冷菌中, 细菌是数量和种类最多的一类, 涉及30 多个属, 其中属于革兰氏阴性的假单胞菌属(Pseudomonas) 和革兰氏阳性的杆菌属(Bacillus)较多。
这些嗜冷菌广泛地分布于各种低温环境中。
除细菌外, 在寒冷地区也发现有放线菌、霉菌、酵母和低温藻类[2]。
1牛奶中主要的嗜冷菌及嗜冷菌的危害1.1 牛奶中的嗜冷菌牛奶中的嗜冷菌中最常见的是假单胞菌属(Pseudomonas), 特别是荧光假单胞(Ps.fluorescens) 。
除此之外还存在有产碱杆菌属(Alcaligenes), 色杆菌属(Chromobacterium), 黄杆菌属(Flavobacterium), 芽孢杆菌属(Bacillus), 梭菌属(Clostridium), 棒状杆菌属(Coryncbacterium), 链球菌属(Streptococcus), 乳杆菌属(Lactobacillus)和微球菌属(Microbacterium)等。
在假单胞菌中, 部分假单胞菌具有强力分解脂肪和蛋白质的能力, 可将原料奶中蛋白分解成蛋白胨, 把脂肪分解从而产生脂肪哈败味。
产碱杆菌, 其本身不能分解原料奶中的糖类产酸, 但其能产生灰黄色、棕黄色的色素, 使得原料奶中所含的有机盐分解成碳酸盐, 从而使牛奶转变为碱性, 并导致乳品产生黏性变质。
1.2 嗜冷菌的危害微生物中嗜冷菌的污染是影响乳产品保质期的最主要因素。
作为冷藏原料奶中生长的优势菌群, 嗜冷菌在原料奶没有及时冷却、冷却温度不达要求或贮存时间过长时, 就会大量繁殖, 并产生耐热水解酶,如蛋白质分解酶和脂肪分解酶, 这些水解酶能破坏牛奶中的主要成分、脂肪、蛋白质和卵磷脂。
嗜冷菌胞外蛋白酶耐热的机制在于经过高温处理后,未被破坏的处于非折叠状态的蛋白酶分子(无活性)重新折叠成有活性的天然构象。
因此该类酶能够耐受巴氏杀菌(72 ℃/15 s) 和超高温(UHT)(120 ℃～150 ℃/0.5～8.0 s) 灭菌工艺处理, 在低温贮存过程中逐渐被激活, 并在奶制品储藏过程中继续分解其中的脂肪和蛋白质, 导致产品出现苦味、结块、分层,从而引起牛奶腐败变质[3]。
总之, 嗜冷菌能破坏原料奶中成分, 主要是由于嗜冷菌活动产生能分解脂肪、蛋白质的耐热脂肪酶、蛋白酶。
这些热稳定性胞外降解性酶类(主要是脂肪酶、蛋白酶)在巴氏杀菌消毒过程中基本不受影响, 甚至经过超高温杀菌处理后仍能保持部分活性,最终, 蛋白酶水解乳蛋白带来例如苦味、异味、果味和酵母味等非正常风味; 而脂肪酶水解牛奶脂肪的过程会释放出一些游离脂肪酸, 这些脂肪酸会造成牛奶制品腐臭、异味、碱味和苦味[4]。
由于游离脂肪酸增加, 乳产品风味将会出现如乳酪味、腐烂味、不洁味或酵母味等不良风味。
这些由嗜冷菌产生的脂肪酶、蛋白酶还会造成片式热交换器的淤塞, 造成清洗困难[5]。
2 嗜冷菌的检测方法及其分析比较嗜冷菌危害的严重性, 更加突显出嗜冷菌检测方法的重要性。
2.1 检测方法目前对于原料乳中嗜冷菌的检测方法有很多种, 但这些方法在时间及针对性上都存在各自的缺陷。
在上世纪90 年代, 对微生物快速、自动化检测的研究已经进入了蓬勃发展的阶段, 那些基于微生物学、化学、生物化学、生物技术、免疫学技术、血清学技术的快速、自动化分析方法均可应用于食品中微生物的分离、前期检测、特性研究及计数。
这其中大多数方法都适用于对奶制品的检测。
目前公认的方法主要有三类: 一、平板检测及其改良方法; 二、直接检测法; 三、间接检测法。
其中直接检测方法包含直接荧光过滤技术、流式细胞计数法、实时聚合酶链反应检测法、聚合酶链反应结合酶联免疫吸附法、荧光原位杂交探针法、时间/温度梯度凝胶电泳、双向电泳、ATP 生物发光法; 间接检测方法包含测定游离脂肪酸、测定氨肽酶活性、鲎变形细胞溶解物、酶联免疫吸附法、电阻抗法、石英晶体微天平。
而以上各类检测方法中平板检测法、直接荧光过滤技术、电阻抗法、酶联免疫吸附法、流式细胞法、氨肽酶法这六种属于比较常见的检测方法。
2.1.1 平板检测法平板检测法是取样品稀释液接种至琼脂培养基,在5 ℃～6.5 ℃恒温培养10 天后计数。
或者将样品在21 ℃增菌培养后, 采用选择性培养基在21 ℃培养25 h, 然后将样品中G-杆菌作为嗜冷菌污染的指标。
平板检测法是比较常见的一种方法,但存在着很多缺陷。
经过改进, 在美国 3 M 公司的细菌总数测试纸片的支持下, 纪振杰等,利用标准平板计数法的原理, 在4 ℃下培养样品10 d, 使得平板检测操作更简单, 观察更方便。
虽然平板计数法耗时比较长, 但是计数结果比较准确, 所以常常作为衡量各种快速检测方法相关性的标准值。
2.1.2 直接荧光过滤技术(direct epifluorescent filter technique, DEFT)直接荧光过滤技术是将经胰蛋白酶和TritonX–100 处理过的原料乳进行膜过滤, 原料乳中的微生物就会被留在过滤器上面。
然后对膜上的细菌进行吖啶橙着染, 再置于紫外显微镜下进行观察[6-7]。
被染成绿色荧光的是死亡细胞, 而呈现橘红色、橘灰色或者橘黄色荧光的则为存活下来的细胞。
最后用仪器来进行计数处理。
作为一种快速检测方法, 直接荧光过滤技术相对于传统的培养计数检测有了较好的改进。
该检测方法与平板检测法的相关性系数为0.91～0.94[8]。
DEFT 方法的优点在于系统使用简单, 运用图像分析仪在紫外显微镜下观察计数, 每小时处理的样本可以大于100 个, 检测数量较大。
而且整个检测过程时间上相对于平板检测具有很大的优越性, 检测结果可以在1 小时内获得。
DEFT 方法的缺点在于对嗜冷菌没有特异性识别, 检测出来的是冷藏原料乳中细菌的总数量, 缺少针对性。
而且当检测样品中细菌含量较少时, 还需要对检测样品进行预培养处理来增加目标微生物的数量, 从而提高检测结果的精确度。
虽然检测时间很短, 但是预培养所需要的时间比较长, 一般要24～48 h 或者更长, 所以预培养会相对耗时一些。
再者, 该检测方法所需要的仪器比较昂贵, 检测成本较高, 在实际工业应用上较难开展。
2.1.3 电阻抗法(electrical impedance measurement)电阻抗法是通过测量微生物代谢引起培养基的电特性变化来测定样品微生物含量的一种快速检测方法。
在培养过程中, 微生物生理代谢作用会激活培养基中的电惰性物质。
随着微生物增长, 培养基中电活性分子和离子逐渐取代了电惰性分子, 使其电导性增强, 电阻抗降低。
