第八章+植物细胞培养及此生物质生产

• 小规模的悬浮培养可在培养瓶中进行。大规模的需要 利用生物反应器生产。
• 植物细胞培养是在植物组织培养技术基础之上发展起 来的。理论基础是植物细胞的单个细胞内存在生命体 的全部能力（全能性）。
8.1 植物单细胞的培养
8.1.1 单细胞制备方法 8.1.2 单细胞培养技术
8.1.1 单细胞制备方法
• • • • •
与细胞悬浮培养相比，植物细胞固定化培养 具有以下优势： 细胞生长较为缓慢，利于次生代谢产物的积 累。 易于控制化学环境、收获次生代谢产物。 细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小。 有利于进行连续培养和生物转化。
（1）细胞包埋固定 化方法
① 海藻酸盐固定化： 原理：在钙离子或
其他多价阳离子存
植物细胞培养技术的应用：
① 药物代谢产物
目前采用植物细胞培养生产的药物成分主要包括：
• • • • • • 苷类：皂苷、强心苷、甘草皂苷、香豆精苷等。 淄醇：菜油、豆、谷、胆、异岩藻淄醇等。 生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。 醌类：恩醌、萘醌、返醌等。 蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂、植物病毒 抑制剂、植物抗生素等。 紫杉醇、紫草宁、人参。
• 8.3.5.2 次级代谢物的提取：在一定条件下，用适当 溶剂处理原料，使所需的代谢物充分溶解到溶剂中的 过程。 • 8.3.5.3 沉淀分离：金属盐沉淀法、PH沉淀法、有机 溶剂沉淀法、盐析沉淀法等。 • 8.3.5.4 层析分离：吸附层析、分配层析、离子交换 层析、凝胶层析等。
• 8.3.5.5 萃取分离：有机溶剂萃取、双水相萃取、超
在时，多糖中羧基 和阳离子之间形成 离子键，从而形成 凝胶。
② 卡拉胶固定化：原理：在钾离子存在条件
下能形成凝胶。 ③ 琼脂糖固定化：不需要其他离子参与来保 证胶的稳定性。
（2）固定化生物反应器
① 流化床生物反应器
② 填充床生物反应器
③ 膜生物反应器
优点：单位体积细胞密度大。 缺点：混合效果较差，传质率低， 细胞受压力大，易破碎。
第8章 植物细胞培养及 次生物质生产
8.1 植物单细胞培养 8.2 植物细胞悬浮培养 8.3 植物细胞大规模培养及次生物质生产
• 植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其他 易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到 分散成游离的单个细胞或小细胞团，通过继代培养使 细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。
8.1.2.2 看护培养

是指用一块活跃生长的愈伤组织 来看护单个细胞，使其持续生长 和增殖的一种培养方法。这块愈 伤组织被称为看护组织。 具体方法是将单个细胞接种于滤 纸上，再置于愈伤组织之上培养。 优点是简便、成功率高。

• 8.1.2.3 微室培养
• 是为了进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细 胞培养技术。
① ② ③ ④
1×10 ³ 1×10 5个/ml。 ~
植板密度不能低于某一临界值（临界密度）； 应选用旺盛分裂期细胞； 操作时减少细胞损伤； 黑暗或弱光培养。
添加有机成分或采用条件培养基，植板密度可以低一些。
• • • • • •
临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于 某值，培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞 团，则该值就是临界密度。 初始植板密度应根据培养基的营养状况而改 变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越 低，反之则相反。
一定量的细胞悬液，同时加入等量的新鲜培养液。
8.3 植物细胞大规模培养和次生物质生产
• 植物细胞培养技术的意义： 1) 节约能源，减少耕地占用面积，而且不受季节、地 域限制。有利于对生态环境和珍稀植物资源的保护。 2) 排除病菌和害虫影响。 3) 可通过特定生物转化途径获得均一的有效成分。 4) 利用植物细胞培养技术生产药物和一些工业原料已 成为工业化生产植物产品的一条有效途径。通过植 物细胞培养可以生产相当于几倍或几十倍完整植株 所产生的次生物质。具有极大的经济效益。
是将悬浮培养的分散细胞均匀分布在一薄层固体培养基中
进行培养的技术。具体步骤： ① 单细胞悬浮液的制备，并记数。 ② 调节细胞密度。1×10³-1×105个/ml。 ③ 培养基选择与凝固剂选择，30-35℃混匀浇平板。密
封后在倒置显微镜下标记单细胞位置。
④ 25℃，暗培养。数天后计算植板率。
平板培养注意事项：
•
• •
④ 饲料、精细化工等产品
• 植物细胞大规模培养主要包括3个步骤：
诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织并建立悬浮 细胞系 筛选高产细胞系 在生物反应器中大量培养细胞或细胞团并适时 收获。
• 8.3.1 细胞株的筛选
• 生长活跃、合成目的产物较多部位取材----愈 伤组织培养----液体培养基振荡培养以分散细 胞----用单细胞培养技术获得单细胞克隆产生
临界萃取等。
• 8.3.5.6 结晶：盐析结晶法、有机溶剂结晶 法等。 • 8.3.5.7 浓缩与干燥： • 浓缩用各种吸水剂，硅胶、聚乙二醇等。 • 干燥用真空干燥、冷冻干燥、吸附干燥等。
8.3.6 植物细胞培养存在问题
1) 生长缓慢，长时间培养对无菌要求更为严格， 同时对反应器的设计也提出了更高的要求。
③ PH：一般在5-6之间。
8.3.4 生物反应器的选择
适合植物细胞悬浮培养的生物反应器应该具有合适的氧 传递、良好的流动性和低的剪切力。 生物反应器设计要总体上考虑以下几个重要因素：
1) 结构严密，能耐受蒸汽灭菌，无害耐蚀材料，内壁光滑。
2) 有良好的气－液接触和液－固混和性能及热量交换性能。 3) 保证产物质量和产量下，尽量节省能源消耗。 4) 减少泡沫的产生，有参数检测和控制仪表，能联机。
悬浮细胞生长与增殖
延迟期，对数生长期、直线生长期、减缓期、静止期、 衰亡期。
8.2.2.2 连续培养
指在培养过程中，连续地以一定速度添 加培养液，同时排出旧的培养液，使培养物 不断得到营养物质补充并保持培养液总体积 不变的培养。
①
封闭式连续培养：指新老培养液同时、等量流进、
流出，回收细胞于培养系统中，细胞数目不断增加。
• 1)
细胞悬浮培养的优点是： 能大量提供分散性好且比较均匀的细胞，为研究细胞 的生长、分化创造条件。 细胞营养吸收充分、环境条件好，细胞增殖快。
2) 3) 4)
可避免有害代谢物在局部浓度过高。
适合大规模的培养，生产有价值的活性代谢物。
8.2.1 细胞悬浮培养一般过程
① 疏松易碎愈伤组织诱导：外植体，基本培养基及有机
三种应用于植物细胞悬浮培养
的生物反应器：

机械搅拌式反应器 气动式生物反应器：鼓泡式、气升式 固定化细胞生物反应器
• 8.3.4.1 搅拌式反应器
原理：利用机械搅动使细胞悬浮和通气。
优点：搅拌充分，供氧和混合效果好。 缺点：剪切力容易伤害植物细胞。
机械搅拌式反 应器示意图
• 8.3.4.2 气动式生物反应器
原理：利用空气动力使培养液流动。
优点：剪切力小，对细胞伤害小。易长时间无菌
培养。 缺点：低气速细胞容易聚集，与培养液混合差。 高气速会产生泡沫，影响植物细胞生长。
• 8.3.4.3 固定化细胞生物反应系统
细胞固定化是指将游离的细胞包埋在多糖或多
聚化合物等中，或使其附着在尼龙网、中空纤 维等上，培养液呈流动状态进行无菌培养的一 门技术。
的愈伤组织----测定其次生代谢产物含量，选
出高产细胞系----继代多次，产物含量仍高， 则为稳定的高产细胞系----可用于大规模细胞
培养。生长的培养基不一定适合目 的产物的生产，因此，采用两步培养法。 首先将细胞培养在生长培养基上，促 进细胞快速增殖，然后转移到生产培养基 上促进细胞合成目的次生代谢产物。
思考题
1. 什么是植物细胞培养？ 2. 简述通过植物细胞悬浮培养获得再生植株的一般技术过程。 细胞悬浮培养的工艺有哪些？ 3. 单细胞制备和培养的基本方法有哪些？
① • 机械法： 主要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单体。 如叶肉组织细胞的分离。
•
由于愈伤组织细胞之间的结构非常松散，因此可以通 过高频率振动从悬浮状态的愈伤组织中振荡下来单个 细胞。
方法原始、效率低，细胞易破，获得细胞数量有限。 但操作方便，且不会改变细胞的生理特性。
•
② 化学方法
• 草酸盐，秋水仙素，CH，2，4-D等对分散 细胞有一定作用。
附加物（CH、谷氨酰胺等），植物生长物质（2，4-D 和细胞分裂素）的种类、浓度和比例等，蔗糖浓度 （10-30g/L）等均对疏松愈伤组织的形成有影响。 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织 的松散性。这样可获得大量均匀一致，疏松易碎，适 合建立悬浮细胞系的愈伤组织。
②
单细胞分离及细胞悬浮培养: 选择合适的接种密度 （104-105个/mL）、温度，摇床转速等。
① 植物生长物质：2，4-D、NAA、IAA、6-BA、
KT等。
② 前体：合成代谢物所必需的前体物质。 ③ 诱导子：能引起植物细胞某些代谢强度或代 谢途径发生改变的物质。包括生物（微生物 或其提取物等）和非生物（辐射、金属离子
等）两类。
8.3.3 培养条件
① 光：光照时间、光质、光强均有影响。 ② 温度：应根据不同细胞培养物及合成不同次 生代谢物种类而定。
③
愈伤组织形成和植株再生：悬浮细胞可直接形成肧 状体或经愈伤组织分化成再生植株（快繁）。 如果以生产代谢产物为目的的细胞悬浮培养，则应 采取适当措施分散开不断聚集的细胞团，使细胞保 持继续增殖，达到最高细胞密度，收获目的产物。
8.2.2 细胞悬浮培养工艺 8.2.2.1 分批培养 指在培养过程中，一次性加入培养基， 在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。 即不向培养系统中补加培养基，也不从系统 中排出培养物。 细胞生长呈现“S”形生长曲线。