葡萄糖酸钙锌颗粒微生物限度检查方法验证

葡萄糖酸钙和葡萄糖酸锌的含量-实验准备滴定法测定葡萄糖酸锌钙口服液中葡萄糖酸钙和葡萄糖酸锌的含量一、目的1．学习设计滴定分析法实验。

2．巩固所学知识，并将所学知识应用实际。

3．培养综合分析问题和解决问题的能力。

方法一EDTA滴定法-差减法-减钙量法-钙紫红素指示剂原理：（1）在pH＝10时，以铬黑T为指示剂，用0.01mol/L 的EDTA 滴定液滴定口服液中的Ca2＋、Zn2＋，溶液由紫色变为纯蓝色为终点，得Ca2＋、Zn2＋消耗EDTA滴定液总体积V1。

滴定前：Ca2＋＋HIn2－（纯蓝色）→CaIn－（紫红色）＋H＋Zn2＋＋HIn2－（纯蓝色）→ ZnIn－（紫红色）＋H＋终点时：ZnIn－（紫红色）＋H2Y2－→ ZnY2－（纯蓝色）＋HIn2－＋H＋（2）在pH=12以上的强碱性溶液中，以钙紫红素指示剂，用EDTA滴定液滴定，溶液由紫色变为纯蓝色即为终点，得Ca2＋消耗EDTA滴定液体积V2，根据消耗的滴定液体积可计算得葡萄糖酸钙的含量。

采用差减法，即用滴定Ca2＋、Zn2＋消耗的滴定液总体积V1减去Ca2＋消耗的体积，可计算得葡萄糖酸锌的含量。

计算公式：试剂：钙紫红素指示剂：取钙紫红素0.1g，加无水硫酸钠10g，研磨均匀，即得。

氢氧化钠试液：氢氧化钠4.3g，加水使溶解成100 ml，即得。

其它所用试剂均同“水的硬度测定”实验。

葡萄糖酸锌钙口服液规格：10ml/支，含葡萄糖酸钙：600mg、葡萄糖酸锌：30 mg。

（相当于钙：54 mg、锌：4.3mg。

）每1ml EDTA滴定液（0.01 mol/L）相当于4.484mg葡萄糖酸钙（C12H22CaO14·H2O）每1ml EDTA滴定液（0.01 mol/L）相当于4.556mg葡萄糖酸锌（C12H22ZnO14）方法：（1）精密量取口服液1.5mL于250mL锥形瓶中，加蒸馏水50mL，其它操作均同“水的硬度测定”实验。

药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。

第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。

器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。

培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。

固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。

煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。

万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。

液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。

万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。

消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。

表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。

可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。

另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。

第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。

首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。

进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。

微生物限度检测方法验证操作指导书1.0目的确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。

2.0适用范围适用于公司所有需进行微生物限度检测的产品。

3.0职责化验室负责人：对本规程的实施负责。

检验人员：严格按照本规程执行检验操作。

4.0参考文件4.1 验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。

4.2 验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。

5.0程序5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。

5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。

6.0内容6.1 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。

根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。

6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证6.2.1 验证用菌株铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]黑曲霉[CMCC（F）98 003]白色念珠菌[CMCC（F）98 001]6.2.2 验证用菌液制备6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。

取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。

微生物限度检查方法验证方案目录1、概述2、验证目的3、验证条件4、验证步骤5．验证试验小结1.概述微生物限度为产品质量的一个重要指标，其检查方法的选择对检验结果真实性有很大的影响，为此必须对其检查方法进行验证。

2.验证目的通过对微生物限度检查方法的验证，确认在正常条件下本检验方法处于控制状态，且能够稳定地对公司产品进行有效的微生物的检查和控制。

确认相应标准操作规程的适用性。

3.验证条件3.1验证小组成员与分工3.2 参加本方案实施操作的人员须事先进行《微生物限度检查标准操作程序》的培训，能熟练掌握检查方法和原理，熟悉本方案的内容。

3.3验证所用的各类物料均应符合相应的规定或标准。

相应的设备须验证的应事先进行验证并符合要求。

4.验证步骤4．1验证依据参照2010年版《中国药典》微生物限度检查计数方法的验证4．2与验证有关的文件《微生物限度检查标准操作程序》文件编号：SOP-ZL-010《净化工作台标准操作程序》文件编号：SOP-ZL-0324．3验证用材料4．3．1试验样品药品包装用复合膜产品4．3．2实验菌株1．金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]2．大肠埃希菌[CMCC（B）44102]3．枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]4．白色念株菌[CMCC（F）98001]5．黑曲霉[CMCC（F）98003]以上菌株购自省药品检验所。

4．4细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证4．4．1验证方法4．4．1．1菌液制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤中，培养18～24小时；接种白色念株菌至改良培养基中，培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100CFU的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为50～100CFU的孢子悬液，备用。

ICP-MS测定葡萄糖酸钙锌口服溶液中葡萄糖酸锌的含量【摘要】目的：建立对葡萄糖酸锌钙型口服液当中葡萄糖酸锌钙物质含量的检测方式。

方法：在探究成分中葡萄糖酸锌钙含量的阶段中使用了AAS方法和ICP—MS方法相结合的检验方式，对该药品当中葡萄糖酸锌物质的含量进行了分析，并对两种检测方式的结果进行了对比，数据结果显示ICP—MS类型对该药物中葡萄糖酸锌钙含量的检测方式更为有效。

结果：锌元素在0到0.8微克每毫升的浓度范围有良好的线性相关性。

平均加样类回收率数值为96.6%。

采用AAS类检测方式和ICP—MS类型检测方式进行药物检测的时候，其结果显示大致相同。

结论：在对葡萄糖酸锌钙型口服液当中葡萄糖酸锌钙物质含量进行检测的时候，ICP—MS检测方式具有检测过程简便、快捷，检测结果精准、可重复性良好的特点，是一种高效的葡萄糖酸锌钙型口服液当中葡萄糖酸锌钙物质含量检验方式。

【关键词】葡萄糖酸锌钙；口服液；含量测定；ICP—MS；AAS；实验探究葡萄糖酸锌钙是药物市场中葡萄糖酸锌钙型口服液的主要成分，对这种物质含量的测定方式也是对葡萄糖酸锌钙型口服液进行质量控制的关键指标。

在当前药品市场中对葡萄糖酸锌钙型口服液进行质量检测的时候，常会使用AAS类型检测方式对葡萄糖酸锌钙型口服液进行质量检验，这种检测方式具有良好的可靠性，也是当前对该药品进行质量控制主要方式。

而在药品成分检验技术不断发展的现代，也出现了ICP—MS等众多新型、高效的成分检测方式，能更加高效的对葡萄糖酸锌钙型口服液的成分进行分析。

而ICP—MS类型检测技术由于在检测方面具有检出限度低、成分含量检验结构精度高、能同时进行多元素检定等优点而在药物含量检验方面有突出表现，成功的被应用到了环境分析、食品安全检验以偶及半导体材料制造等领域。

本文通过对比了AAS以及ICP—MS两种类型检验技术在对葡萄糖酸锌钙型口服液中主要物质检验方面各项性能，以期建立更为高效的葡萄糖酸锌钙型口服液当中葡萄糖酸锌钙物质含量的检测方式。

文件编号：SVP YF-0-01-00验证文件******微生物限度 检查法验证方案********有限责任公司目录1 适用范围 2 目的 3 概述 4 验证所需要的仪器设备及文件 5 可接受的限度范围标准 6 测试方法 7 异常情况处理 8 测试结果 9 结论 10 再验证周期 11 附表1 适用范围 本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。

2 目的 建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。

3 概述 3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分，文献报道盐酸氨基葡 萄糖有抑菌活性。

根据以上特点，按《中国药典》2010 年版附录Ⅺ J《微生物限度 检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试 液。

“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法 2 薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母 菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。

3.2 验证时间：************批平行三次试验。

4 验证所需要的仪器设备及文件 4.1 验证需用仪器设备器具名称规格型号检定日期检定单位有效期电热恒温培养箱 HG101-3多用生化培养箱 SP-80 蒸汽灭菌器 ZDX-35B4.2 验证所需要的文件及存放地方 资料名称《HG101-3 电热恒温培养箱操作维护保养 SOP》 《SP-80 型生化培养箱操作维护保养 SOP》 《ZDX-35B 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP》 《微生物限度检查法 SOP》 5 可接受的限度范围标准 5.1******微生物限度检查质量标准存放地点项目标准规定细菌总数≤1000 个/g霉菌、酵母菌≤100 个/g大肠埃希菌不得检出5.2 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于 70%。

若试验组的菌回收率均不低于 70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于 70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

微生物限度检查方法验证方案六、验证内容1.供试液的制备1.1.取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:10的供试液。

1.2.取1:10供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:100的供试液。

1.3.取1:100供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:1000的供试液。

备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

2.菌液制备2.1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30〜35℃培养18～24小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至、、、制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。

2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20〜25℃培养2～3 天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至，制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。

2.3.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，使大量的孢子成熟。

加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每 1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。

2.4.上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存有效期内使用。

微生物实验室检测设备配置方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。

3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。

4.验证实施：4.1.1试验前的准备：4.1.1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃,灭菌30 min,在3天内使用。

4.1.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制微生物实验室检测设备配置方案说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃, 灭菌15 min，在3周内使用。

4.1.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。

药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。

细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。

特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。

2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。

（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。

（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。

6. 写出验证资料。

示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。

2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。

霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。

2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。