平滑肌肌动蛋白a-actin免疫荧光法鉴定

毕业论文文献综述生物技术α-肌动蛋白基因研究现状摘要：肌动蛋白(actin)是所有真核生物细胞内的重要结构蛋白，有6种亚类，心脏α-actin、骨骼肌α-actin、平滑肌α-actin 是其中的三种，在机体内执行着不同的功能，本文通过阅读大量相关文献综述了它们各自的功缺失、突变后会引起的某些疾病以及一些疾病发生与该种基因表达的影响，所以我们可以通过克隆其基因并进行序列的分析，并研究清楚肌动蛋白基因有利于其他各领域对该基因的应用。

关键字：肌动蛋白；心脏α-actin基因；骨骼肌α-actin基因；平滑肌α-actin基因；研究现状0前言肌动蛋白(actin)基因大量存在于几乎所有物种的有核细胞中，是一种高度保守蛋白，与一些管家蛋白的基因一样，在物种内持续恒量表达，因而在很多量化的实验技术如实时定量PCR、Northern 杂交、免疫蛋白印迹中被当作内参照。

它是肌肉细胞的一个重要的收缩蛋白，也是细胞骨架的主要组成部分，参与细胞发育进程的多个方面，包括细胞运动、新陈代谢、有丝分裂、肌肉收缩等，在脊椎动物中，actin 家族根据氨基酸序列的不同可分为6 种类型：包括2 种细胞质actin（β 型和γ型），2 种横纹肌型α-actin，即骨骼肌α-actin、心脏α-actin 和2种平滑肌actin，即α-血管平滑肌型、γ-型内脏平滑肌型。

近来的研究表明，尽管这些亚型在氨基酸序列上同源性非常高（> 90%），但是不同的actin 基因在功能上是不可互换的[1]。

α-肌动蛋白是一种具有2个亚基的蛋白质，其主要作用显然是将肌动蛋白微丝锚定在肌节Z线上，以下是对心脏α-actin基因、骨骼肌α-actin基因、平滑肌α-actin基因这三种分别进行阐述。

1心脏α-actin基因与相关疾病及其研究机理心脏α-肌动蛋白基因(cardiac alpha-actin, CAA)近年逐渐被认识的在心脏发育过程中起重要作用的一个基因。

免疫组化分型诊断抗体选用表（2016年3.15版）注：红字提示目前未购买到，或者抗体预试验未完成，或观点尚未证实。

一、间叶肿瘤：Vimentin+ Cytokeratin- LCA-1、肌源性肉瘤：Actin (广谱肌动蛋白HHF35)，Actin（平滑肌肌动蛋白SMA）+，Desmin（结蛋白）+，横纹肌肉瘤P63/MyoD1/Myogenin+，平滑肌瘤或肉瘤高分子量钙结合蛋白（H-caldesmon）浆+，平滑肌瘤或乳腺肌上皮Calponin肌动蛋白结合蛋白+。

2、组织细胞肿瘤（注：恶纤组CD68阴性、CD10阳性）：CD68（PG-M1单核细胞）+，CD68（KP-1组织细胞/巨噬细胞）+，CD163+。

脂肪肉瘤：S-100和Ki-67脂母细胞核浆+。

骨巨细胞瘤（软组织巨细胞瘤）：单核细胞P63+CD68-，多核细胞P63-Ki67-CD68+3、滑膜肉瘤：Cytokeratin+，Vim+，CK19+，CK7+，CK17+，EMA+，SYT基因+。

胃肠间质瘤：CD34+、CD117+、DOG-1+。

4、神经源性：PNET：CD99/CgA/Syn/S-100/Nue-N+, PNET/髓母: INI-1+(恶性横纹肌样瘤-)。

恶性神经鞘瘤：S-100/CD57/PGP9.5/Leu-7+。

室管膜瘤EMA+（中枢神经用EMA点状胞浆阳性）、CK+，GFAP+，S-100+。

脉络膜瘤GFAP-，S-100+。

星型胶质瘤：GFAP+，少突细胞瘤：Olig2，黄色瘤样星型细胞瘤CD34阳CR阴（节细胞胶质瘤CD34阴CR阳）神经元细胞、：NeuN+，Nestin+，NF+，Syn+。

嗅母NeuN-，Syn+，CgA+，NSE+，S-100癌巢周围支持细胞+、脑膜瘤Vim+, EMA+, PR+，CK+, S-100+。

副神经节瘤：Syn+, CgA+, S-100支持细胞+。

血管母细胞瘤：间质细胞аinhibin/VEGF/NSE/Vim/S-100/D2-40+，GFAP/CK/CD10/EMA-；CD34及CD31血管内皮阳性。

小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定范晶晶【摘要】To study a new simple mechanical method for the isolation and culture of Mouse myometrial smooth cells （mMSMCs） in order to provide a experimental model for study the physiology and pathology of MSMCs. A new mechanical method was used to isolate mouse myometrial smooth. And then type Ⅰ collagenase and trypsin were used to isolate mMSMCs. More than 90%of the dissociated cells exhibited initial viability. The surviving cells were observed by phase con- trast microscope and verified by immunofluorescence staining. After 3 days of incubation, primary cultures of cells attached the wall of the incubation dishes, and reached confluence with 2 weeks. The cells grew with spindle--shape and showed typi- cal ＂hill-valley＂ pattern under phase contrast microscope. Immunofluorescence staining for smooth musclea--actin shewed positive reaction in more than 98% attached cells. The mMSMCs cultured in this experiment survive well, with highly puri- ty, and can serve the further studies of physiology and pathology.%为寻找研究子宫平滑肌细胞生理和病理的实验研究模型，试建立一种新的简易机械分离培养小鼠子宫平滑肌细胞的方法。

临床常用免疫组化标记物及意义免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于临床病理学领域的技术，用于检测组织样本中特定蛋白质的表达和定位信息。

这种技术的基本原理是使用特异性的抗体与目标蛋白质结合，然后通过化学反应或荧光染色方法来显示出蛋白质的表达情况。

在临床实践中，免疫组化常用于诊断肿瘤包括癌细胞的分类、分级以及分子靶向治疗的预测。

下面将介绍一些常用的免疫组化标记物及其意义。

1. 细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）2.细胞膜蛋白（CD）细胞膜蛋白是细胞膜上的免疫组化标记物，常用于诊断和分类各种肿瘤。

例如，CD20和CD3是血液系统恶性肿瘤（如淋巴瘤）的诊断标记物；CD34用于判断肿瘤的血管生成和预后。

3. 平滑肌肌动蛋白（Smooth Muscle Actin，SMA）平滑肌肌动蛋白是平滑肌组织中的一个标志性蛋白，常用于诊断和分类平滑肌源性肿瘤，如平滑肌肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤。

4. 雌激素受体和孕激素受体（Estrogen Receptor，ER和Progestrone Receptor，PR）雌激素受体和孕激素受体的阳性表达在乳腺癌诊断和治疗中具有重要的价值。

ER和PR的表达程度可以预测乳腺癌对内分泌治疗的敏感性，指导治疗方案的选择。

5. 肿瘤抑制基因（Tumor Suppressor Gene，TSG）蛋白常用的TSG蛋白包括p53、PTEN、BRCA1等。

这些蛋白的突变或缺失与肿瘤的发生和进展密切相关。

免疫组化检测这些TSG蛋白的表达情况可以帮助评估肿瘤的分子异常，对于预测预后和指导治疗具有重要意义。

6.基因突变相关蛋白近年来，免疫组化也逐渐应用于检测肿瘤常见的基因突变或扩增，其中包括EGFR、HER-2、ALK、BRAF等。

这些突变和扩增与肿瘤的治疗反应和预后关系密切。

免疫组化检测这些基因突变相关蛋白的表达情况可以为肿瘤靶向治疗的选择和预后评估提供重要信息。

《免疫组织化学》试题库标准答案三性颗粒呈粗颗粒状。

正常肝细胞阳性，肝胆管上皮阴性。

约80％肝细胞癌为HPC阳性，不足5％非肝细胞癌表达HPC。

81.Vimentin 波形蛋白（Vimentin）主要分布于间叶细胞及其起源的肿瘤组织，而上皮细胞及其肿瘤一般不含此蛋白。

常用于间叶来源的恶性肿瘤如间皮瘤、滑膜肉瘤、脑膜瘤等诊断，该抗体对癌与肉瘤、恶性黑色素瘤与癌、胸腺瘤与淋巴瘤、未分化癌与小细胞间叶肿瘤的鉴别诊断具有重要参考意义。

82.Desmin结蛋白（Desmin）是一种中间丝蛋白，广泛分布于平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞和肌上皮细胞。

主要用于平滑肌肿瘤、横纹肌肉瘤和肌上皮肿瘤、部分肌纤维母细胞肿瘤的诊断和鉴别诊断。

83. MSA 肌特异性肌动蛋白（Muscle Special Actin;MSA）是一种具有收缩能力的微丝蛋白，广泛分布于几乎所有的肌型细胞中。

主要表达于骨骼肌、平滑肌、心肌和肌上皮细胞、肌纤维母细胞，肌源性肿瘤包括平滑肌瘤，平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤以及肌上皮肿瘤、肌纤维母细胞肿瘤等均可呈阳性反应。

84. MyoD1横纹肌核蛋白（MyoD1）是MyoD1基因所编码的45KD的磷酸化蛋白，只在胚胎横纹肌细胞中表达，正常成人横纹肌细胞不表达，是横纹肌肿瘤的一种非常特异的标志。

免疫表型为胞核型。

主要用于横纹肌肉瘤的诊断。

85.肌生成素因子Myf-3 是横纹肌肉瘤有用的标志物，有助于横纹肌肿瘤与神经母细胞瘤、Wilm's瘤、肝母细胞瘤、淋巴瘤和平滑肌肉瘤的鉴别。

86.肌红蛋白（Myoglobin）肌红蛋白存在于骨骼肌和心肌中，是横纹肌的特异性标记物。

主要用于横纹肌肿瘤的诊断与鉴别诊断，少数恶性中胚叶混合瘤，睾丸畸胎瘤、肾母细胞瘤中肌母细胞亦可见阳性表达。

87. TPO 甲状腺过氧化物酶(TPO)是一种分子量为107 KD转膜蛋白，是甲状腺素合成的主要酶。

TPO是甲状腺良恶性肿瘤鉴别诊断的早期标记物，恶性甲状腺肿瘤细胞中TPO表达水平下降，若TPO低表达则强烈提示异型增生。

平滑肌肌动蛋白技巧概述说明以及解释1. 引言1.1 概述平滑肌肌动蛋白技巧是一项重要的研究领域，主要用于研究平滑肌组织中的肌动蛋白以及其功能和应用。

通过掌握平滑肌肌动蛋白技巧，我们可以深入了解这些基本生物分子在细胞内的运动机制，进而推动相关领域的发展和应用。

1.2 文章结构本文将分为五个部分进行叙述。

引言部分（第1部分）将对本文的整体内容进行概述说明；正文部分（第2部分）将详细介绍平滑肌组织与肌动蛋白之间的关系；接下来（第3部分）将探讨平滑肌肌动蛋白在细胞内所扮演的重要角色；然后（第4部分）会对平滑肌肌动蛋白技巧进行全面概述，包括定义、分类以及相关技术原理与方法；最后（第5部分），文章会总结该技巧在实际应用中的价值，并展望其未来可能发展的方向和解决相关问题的展望。

1.3 目的本文的目的是全面介绍平滑肌肌动蛋白技巧，包括其定义、分类、技术原理与方法以及实验步骤和前期准备工作等方面。

同时，本文还将分析平滑肌肌动蛋白的重要性，探讨它们在细胞内所扮演的功能，并进一步阐述平滑肌肌动蛋白技巧在科研和应用领域中的具体应用价值和潜力。

最后，我们还将展望未来该技巧可能的发展方向，并提出利用平滑肌肌动蛋白技巧解决相关问题的前景展望。

通过本文的撰写，旨在为读者提供对于平滑肌肌动蛋白技巧有一个清晰全面了解，并为相关科学研究和应用开展提供指导和参考。

2. 正文：平滑肌肌动蛋白技巧是一项重要的生物学研究方法，它涉及到对平滑肌组织中的肌动蛋白进行观察、分析和操作。

平滑肌肌动蛋白是一种与运动有关的蛋白质，在维持生物机体正常运作中起着至关重要的作用。

通过研究和应用各种平滑肌肌动蛋白技巧，我们可以更深入地了解平滑肌组织和相关功能，并为解决相关问题提供有力的支持。

在正文部分，我们将从以下几个方面详细介绍和探讨平滑肌肌动蛋白技巧的应用和方法：首先，我们会介绍平滑肌组织与肌动蛋白的关系。

平滑肌组织是一种特殊类型的肌肉组织，其构成单位即为平滑肌细胞。

毕业论文文献综述生物技术α-肌动蛋白基因研究现状摘要：肌动蛋白(actin)是所有真核生物细胞内的重要结构蛋白，有6种亚类，心脏α-actin、骨骼肌α-actin、平滑肌α-actin 是其中的三种，在机体内执行着不同的功能，本文通过阅读大量相关文献综述了它们各自的功缺失、突变后会引起的某些疾病以及一些疾病发生与该种基因表达的影响，所以我们可以通过克隆其基因并进行序列的分析，并研究清楚肌动蛋白基因有利于其他各领域对该基因的应用。

关键字：肌动蛋白；心脏α-actin基因；骨骼肌α-actin基因；平滑肌α-actin基因；研究现状0前言肌动蛋白(actin)基因大量存在于几乎所有物种的有核细胞中，是一种高度保守蛋白，与一些管家蛋白的基因一样，在物种内持续恒量表达，因而在很多量化的实验技术如实时定量PCR、Northern 杂交、免疫蛋白印迹中被当作内参照。

它是肌肉细胞的一个重要的收缩蛋白，也是细胞骨架的主要组成部分，参与细胞发育进程的多个方面，包括细胞运动、新陈代谢、有丝分裂、肌肉收缩等，在脊椎动物中，actin 家族根据氨基酸序列的不同可分为6 种类型：包括2 种细胞质actin（β 型和γ型），2 种横纹肌型α-actin，即骨骼肌α-actin、心脏α-actin 和2种平滑肌actin，即α-血管平滑肌型、γ-型内脏平滑肌型。

近来的研究表明，尽管这些亚型在氨基酸序列上同源性非常高（> 90%），但是不同的actin 基因在功能上是不可互换的[1]。

α-肌动蛋白是一种具有2个亚基的蛋白质，其主要作用显然是将肌动蛋白微丝锚定在肌节Z线上，以下是对心脏α-actin基因、骨骼肌α-actin基因、平滑肌α-actin基因这三种分别进行阐述。

1心脏α-actin基因与相关疾病及其研究机理心脏α-肌动蛋白基因(cardiac alpha-actin, CAA)近年逐渐被认识的在心脏发育过程中起重要作用的一个基因。

牙周膜肌成纤维细胞的体外培养及其标志物的表达时效目的探讨人牙周膜肌成纤维细胞（MFB）体外培养及其标志物表达的时效性。

方法体外培养人牙周膜成纤维细胞（hPDLF），72 h内以5ug·L-1终质量浓度的转化生长因子（TGF）-B1诱导hPDLF向MFB转化，免疫细胞化学和免疫组织化学染色检测MFB标志物a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）表达情况。

分别进行12、24、48、72、96和120 h的MFB观察，采用流式细胞术观察MFB长时间培养的细胞活性，采用免疫细胞化学观察MFB长时间培养后的a-SMA表达情况。

结果经TGF-B1诱导后a-SMA呈阳性；诱导至120 h，a-SMA仍呈阳性，72 h内其表达稳定。

结论5 ug·L-1终质量浓度的TGF-B1成功诱导人牙周膜细胞向MFB转化。

MFB体外培养具有时效性，培养0-72 h，其状态稳定。

标签：人牙周膜成纤维细胞；肌成纤维细胞；a-平滑肌肌动蛋白本研究的前期体内试验证实，正畸牙牙周膜张力侧肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）可能参与了牙周膜改建和成骨细胞的成骨过程；但牙周膜内生物学环境复杂，在正畸生物力学的影响下，多种牙周膜细胞都可能出现类似于MFB标志物的表达情况；因此，要明确MFB在牙移动过程中可能发挥的作用，就需要进行体外试验，以明确MFB分泌细胞外基质及成骨的机制。

MFB 大多存在于组织处于外力环境时，而当外界张力因素去除掉后，MFB大多程序性死亡或退化消失。

研究MFB的功能，在成功诱导出MFB后还需明确MFB的活性，即MFB可以维持多久，这样才能确定MFB的体外观察时间。

本试验采用转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-B1诱导人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblast，hPDLF）向MFB转化，从12 h起，分6个时间点对hPDLF进行最长120 h的观察。

抗平滑肌肌动蛋白a-actin免疫荧光法鉴定细胞爬片制作(1)细胞生长融合时，用O 25％含EDTA的胰酶消化，制成细胞悬液。

(2)直径35mm的细胞培养皿中放置3张玻片。

(3)每张盖玻片滴加细胞悬液l 50ul的密度是1×104个／ml悬液．接种均匀。

（4）轻轻盖上盖子后．将其放入普通培养箱，待细胞贴壁后加入10％培养液2ml。

(5)培养24小时后，取出平皿，放在倒置相差显微镜下观察．挑选密度均匀玻片，用无血清的DMEM静止24小时后，即可用于实验。

免疫荧光结果：采用特异的平滑肌细胞表面标志物a-actin细胞免疫荧光染色后，胞浆着色为红色．表示细胞阳性。

高倍镜下可见胞浆内与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌a肌动蛋白丝。

物品准备：PBS溶液(pH 7．4)、4％多聚叫醛固定液(pH 7．4)、0 2％Triton打孔液、3％的山羊血清100ul、一抗a-actin (1：300)、兔抗小鼠的荧光二抗(1：1000)、Hoechst染液、90％甘油。

将平滑肌细胞制作成细胞爬片后，依照免疫荧光法说明书操作：(1)吸去培养液，用PBS清洗3次。

(2)4％多聚甲醛室温固定l 5～20min，PBS清洗3次，每次3min。

(3)0 2％Triton液进行细胞打孔5min，吸去．PBS清洗3次。

(4)滴加3％的山羊血清l 50ul于玻片上，湿盒内室温封闭孵爵lh，啵干。

(5)加入稀释的一抗Ⅱ．actinl 50ul，在室温孵育1.5h或4℃过夜．PBS清洗3次，每次5min。

(6)加入荧光二抗150ul，孵育1 5h，PBS清洗3次，每次5min。

(7)加A Hoechst液染核，室温孵育10—15min，PBS清洗3次，每次5min。

(8)90％的甘油封片，指甲油固定玻片四角。

(9)在荧光倒置显微镜下．平滑肌胞浆为红色。

2. α-actin免疫细胞化学法鉴定PASMCs纯度（1）将3张盖玻片放入培养皿中，将稀释好的细胞悬液（5×104 cell/ml）滴到盖玻片上。

第16卷第2期2007年4月中国组织化学与细胞化学杂志CH INESE JOU RNAL OF H ISTOCH EMIST RY AND CYTOCH EM IST RYVol.16.No.2Apr.2007组织贴块法培养小鼠气道平滑肌细胞卓致远 黄 茂* 崔学范 殷凯生(南京医科大学第一附属医院呼吸内科,南京 210029)1关键词2 小鼠; 气道平滑肌细胞; 原代培养; 组织贴块法; 差速贴壁法1中图分类号2 R3311文献标识码2 A1收稿日期22006-07-311修回日期22006-09-061作者简介2卓致远,女(1981年),汉族,硕士研究生。

*通讯作者(T o who m co rr espondence sho uld be addr essed)哮喘是慢性气道炎症性疾病,以气道高反应性和可逆性气道阻塞为主要临床特征,而气道重建作为哮喘的重要病理特征,对气道高反应性的形成起着重要作用。

而气道平滑肌增厚是产生气道阻塞的重要原因,与气道高反应性的发生密切相关[1]。

体外气道平滑肌细胞(airw ay sm ooth muscle cells,ASM C)的培养和细胞株的建立是研究细胞生物学行为,研究疾病发病机制及其防治手段的基础。

因此掌握一种简便、高效的平滑肌细胞培养技术对呼吸系统疾病方面的科研工作者而言具有重要意义。

ASM C 培养常用的培养方法有贴块法[2,3]和酶解离法[4]。

由于小鼠气管组织较少,故作者选择组织贴块法进行细胞的原代及传代培养,应用多种方法纯化细胞,短期内获得了大量较高纯度、生长状态良好的气道平滑肌细胞。

材料和方法1.实验动物和试剂4)8周龄雄性Balb/c 小鼠,购自上海动物中心。

DMEM 高糖培养基购自H yclone 公司;胰蛋白酶粉、D -H anks 液、PBS 干粉均购自美国JRH 公司;优级胎牛血清购自杭州四季青公司;青霉素钠、硫酸链霉素购自华北制药厂;小鼠抗A -actin 单克隆抗体,SABC -FITC 免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司。