大鼠α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)酶联免疫分析
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抑制TRAF6的E3泛素连接酶活性减轻野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺血管重构*许正秋, 邱莉华, 陈睿, 马倩, 李冰冰△(南京中医药大学附属鼓楼临床医学院麻醉科,江苏 南京 210008)[摘要] 目的:探讨抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的E3泛素连接酶活性对野百合碱(MCT )诱导的肺动脉高压(PH )大鼠肺血管重构以及相关信号通路的影响。
方法:采用随机数字表法将42只SPF 级健康成年雄性Sprague -Dawley 大鼠分为4组:对照组(n =6)、MCT 模型组(n =15)、C25-140(TRAF6特异性E3泛素连接酶活性抑制剂)组(n =6)和MCT+C25-140组(n =15)。
MCT 及MCT+C25-140组大鼠于实验开始时颈后皮下单次注射MCT 60 mg/kg ,建立PH 模型,其他2组大鼠皮下注射5% DMSO 作为对照。
C25-140组及MCT+C25-140组大鼠于第14天、21天和28天腹腔注射9.8 mg/kg C25-140。
第28天行超声心动图检测评估大鼠肺动脉压力和心室收缩力变化,之后对大鼠进行安乐死并取肺组织。
通过HE 染色和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA )免疫荧光染色评估大鼠肺血管形态;采用免疫共沉淀检测大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs )中信号转导及转录激活因子3(STAT3)的K63泛素化水平;Western blot 检测大鼠肺组织中TRAF6、STAT3、p -STAT3及cyclin D1的表达水平;免疫荧光染色观察大鼠肺血管TRAF6和STAT3的共定位情况。
结果:(1)与对照组比较,MCT 组大鼠肺动脉血流加速时间(PAAT )和三尖瓣环平面收缩期位移(TAPSE )明显减少(P <0.05),血管中膜厚度明显增加(P <0.05),α-SMA 免疫荧光染色显示肺小血管明显肌化,提示造模成功。
(2)与对照组相比,PH 大鼠PASMCs 中STAT3的K63泛素化明显升高。
安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2021Mar ,25(3)α-平滑肌肌动蛋白、上皮钙黏素在腹膜透析大鼠腹膜组织中的表达及意义彭霞a ,徐家云a ,王朋朋b作者单位:河南科技大学第一附属医院,a 肾脏内科,b心血管内科,河南洛阳471000基金项目:2016河南省科技攻关计划项目(162102310216)摘要:目的探讨α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA )、上皮钙黏素(E -cadherin )在腹膜透析大鼠腹膜组织中的表达及意义。
方法SPF 级SD 大鼠45只,抽签选取26只采用5/6肾切除法制备大鼠尿毒症模型,将造模成功的21只再抽签选取20只分为模型组和腹膜透析组各10只;另剩余19只大鼠抽签选取10只作为假手术组。
术后5周建立腹膜透析模型;腹膜透析组每天灌注4.25%腹膜透析液20mL ,持续6周。
停止透析24h 后测定腹膜超滤量、透出液肌酐(D -Scr )、血肌酐(P -Scr )、初始腹透液糖(D0)及透出液糖(D1)浓度;苏木精-伊红(HE )和Masson 染色观察腹膜组织病理变化;反转录聚合酶链反应(RT -PCR )和免疫组化测定腹膜组织α-SMA 、E -cadherin 蛋白和mRNA 的表达;Pearson 相关性分析α-SMA 和E -cadherin 表达量之间的相关性,α-SMA 、E -cadherin 与腹膜结构和功能之间的相关性。
结果与模型组相比,腹膜透析组大鼠的腹膜超滤量和D1/D0明显下降(P<0.05),D/P -Scr 、腹膜厚度明显增加(P <0.05);与假手术组相比,模型组和腹膜透析组大鼠α-SMA 的mRNA 水平明显上调[(0.56±0.05),(0.92±0.09),(1.38±0.12),P <0.05],E -cadherin 的mRNA 水平明显下调[(0.41±0.04),(0.35±0.04),(0.24±0.03),P <0.05],且相比模型组,腹膜透析组大鼠α-SMA 的mRNA 水平明显上调,E -cadherin 的mRNA 水平明显下调(P <0.05),各组大鼠α-SMA 和E -cadherin 的mRNA 水平呈负相关关系(P <0.05);与假手术组相比,模型组和腹膜透析组大鼠α-SMA 的蛋白表达明显上调[(0.42±0.05),(0.83±0.08),(1.25±0.11),P <0.05],E -cadherin 的蛋白表达明显下调[(0.32±0.04),(0.28±0.03),(0.21±0.03),P <0.05],且相比模型组,腹膜透析组大鼠α-SMA 的蛋白表达明显上调,E -cadherin 的蛋白表达明显下调(P <0.05),各组大鼠α-SMA 和E -cadherin 的蛋白表达呈负相关关系(P <0.05);大鼠腹膜组织中α-SMA 的mRNA 水平与腹膜厚度和D/P -Scr 呈正相关关系(P <0.05),与腹膜超滤量和D1/D0呈负相关关系(P <0.05),E -cadherin 与腹膜厚度和D/P -Scr 呈负相关关系(P <0.05),与腹膜超滤量和D1/D0呈正相关关系(P <0.05)。
*基金项目:内蒙古医学院科技研究重大项目资助(NY2005ZD007)收稿日期:2008 01 28;修回日期:2009 04 13作者简介:杨敬平(1964 ),男,河南唐河人,医学硕士,主要从事呼吸与危重症医学研究。
通讯作者,E mai l:yangron@.c n原代培养鼠肺成纤维细胞中 平滑肌肌动蛋白的表达*杨敬平,孙德俊 ,李姝楠,高 丽(内蒙古医学院第三附属医院呼吸与危重症科,内蒙古包头014010)摘要 目的:观察原代培养大鼠肺成纤维细胞(FB)中 平滑肌肌动蛋白( SMA )的表达情况。
方法:24只雌性Wistar 大鼠,随机分为正常组和模型组,气管内注入博莱霉素A2(B LM A2)(5mg/kg)建立大鼠肺间质纤维化(PF)模型,正常组气管内注入等量生理盐水。
实验周期第28d 腹主动脉放血法处死,肺组织HE 染色和透射电镜检查。
体外原代培养FB,传3~5代后流式细胞术检测 S MA 表达的细胞阳性率。
结果:HE 染色28d 模型组大片肺泡结构破坏,肺泡腔消失,有成纤维细胞灶形成,电镜观察肺组织超微结构发生改变,肺间质中可见胞浆内有微丝样结构的MF 。
流式细胞分析结果:正常组 SMA 表达的细胞阳性率为95.5% 4.68%,模型组 S MA 表达的细胞阳性率为96.2% 2.14%,与正常组相比P >0.05。
结论:原代培养的大鼠肺FB 中 SMA 的阳性表达率正常组和模型组均显著增高,体外培养的大鼠肺FB 传3~5代后可能有部分已经转化为肌纤维母细胞(MF)。
关键词: S MA;成纤维细胞;原代培养;表型转化中图分类号:R563 文献标识码:A 文章编号:1000 6834(2009)03 339 05成纤维细胞(fibroblasts,FB),尤其是肌纤维母细胞(myofibroblasts,MF)的增殖和转化在肺纤维化中的致病作用是目前肺纤维化的研究热点之一,但是MF 具体如何转化以及转化的量的多少仍然是有争议的。
肾病肾组织中α-平滑肌肌动蛋白的表达及其意义王川;陈威;刘彦仿;张志芬【期刊名称】《西北国防医学杂志》【年(卷),期】2002(023)003【摘要】目的:研究特发性膜性肾病(IMN)肾组织内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达及意义.方法:对15例IMN肾活检组织进行α-SMA免疫组化染色,染色结果半定量评分,并与相应肾小球及间质损伤程度比较.结果:各期IMN肾小球及间质α-SMA表达均增高,并分别与肾小球损伤程度正相关(r=0.628,P<0.05),与间质损伤程度显著正相关(r=0.932,P<0.01).结论:肾组织固有细胞-肌成纤维细胞转分化在IMN进行性进展中具有重要意义.【总页数】3页(P194-196)【作者】王川;陈威;刘彦仿;张志芬【作者单位】第四军医大学病理学教研室,陕西,西安,710032;第四军医大学西京医院肾脏内科;第四军医大学病理学教研室,陕西,西安,710032;解放军第一医院儿科【正文语种】中文【中图分类】R692【相关文献】1.α-平滑肌肌动蛋白和E-钙依赖性黏附素在肾间质纤维化大鼠肾组织中的表达 [J], 陆海英;张悦;刘煜敏;周娟;陆敏;刘克剑;李靖;林敏2.IgA肾病肾组织中肌动蛋白的异常表达 [J], 陈振斌;梁平;郑智勇;余英豪;庄永泽;谢福安;孙慧敏;陈莲云3.α-平滑肌肌动蛋白在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达 [J], 谢敏;周建华;朱国琴4.α平滑肌肌动蛋白和转化生长因子β1在小管间质纤维化模型大鼠肾组织中的表达 [J], 王军;邵传森;程晓霞;王永钧5.IgA肾病患者肾组织中鞘氨醇激酶1及α-平滑肌肌动蛋白表达观察 [J], 刘佳丽; 李沁芸; 杨琨; 刘晓惠因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
葛根素对大鼠酒精性肝纤维化的干预作用以及对肝星状细胞增殖活化的影响郝原青;郭晓雪;丁雅珊;王任远;苏剑清;常淼花;杜静;苏金玲【期刊名称】《天津中医药大学学报》【年(卷),期】2016(35)2【摘要】[目的]研究葛根素对大鼠酒精性肝纤维化的干预作用以及对肝星状细胞增殖活化的影响。
[方法]Wistar雄性大鼠85只被随机分为正常对照、模型、葛根素低、中、高剂量和阳性药(易善复)对照6组。
除正常对照组之外,其余给予大鼠灌胃白酒辅以玉米油、吡唑的混合食料制备酒精性肝纤维化模型,12周后采用苏木精-伊红(HE)、Masson染色观察大鼠肝脏组织纤维化状况。
采用免疫组化法检测大鼠肝组织内增殖细胞核抗原(PCNA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,根据PCNA 的表达,计算肝细胞的增殖指数。
[结果]模型组和各给药组肝纤维化程度显著高于正常对照组,各给药组肝纤维化程度要轻于模型组,但低剂量组肝纤维化程度重于其他各给药组。
模型组肝细胞增殖指数明显高于其他各组,各给药组肝细胞增殖指数高于正常组。
模型组α-SMA的表达高于其他各组,葛根素中、高剂量组和阳性药组α-SMA的表达低于模型组,葛根素低剂量组α-SMA的表达与模型组没有显著性差异,但从数据趋势上看低于模型组。
[结论]葛根素能通过抑制肝星状细胞的增殖活化从而达到防治酒精性肝纤维化的功效,以中、高剂量效果更明显。
【总页数】4页(P132-135)【关键词】葛根素;酒精性肝纤维化;肝星状细胞;增殖细胞核抗原;α-平滑肌肌动蛋白【作者】郝原青;郭晓雪;丁雅珊;王任远;苏剑清;常淼花;杜静;苏金玲【作者单位】天津中医药大学中西医结合学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5【相关文献】1.养阴柔肝活血法对大鼠酒精性肝纤维化肝星状细胞PDGF及其受体表达的影响[J], 赵鲲鹏2.丹芍化纤胶囊对肝纤维化大鼠肝星状细胞增殖、活化及凋亡的影响 [J], 胡爱荣;丁一生;程明亮3.清肝活血方对酒精性肝纤维化大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响 [J], 邢练军;季光;王磊;郑培永;柳涛4.Wnt信号通路对酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的影响以及整合素连接激酶的调节作用 [J], 苏金玲;姜希娟;郭茂娟;马东明;范英昌5.肝素对肝纤维化大鼠肝星状细胞增殖及分泌的影响及其作用机制 [J], 郝菁华;石军;马进才;张捷;任万华;朱菊人因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
α-平滑肌肌动蛋白在臀肌挛缩症中的表达及意义陈根强;潘志军;周燕;陈丽荣【期刊名称】《中国骨伤》【年(卷),期】2005(018)004【摘要】目的:观察α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)在臀肌挛缩症的表达、分布.方法:利用免疫组化染色辅以计算机图像定量分析技术,对26例臀肌挛缩症及12例正常臀肌标本α-平滑肌肌动蛋白的表达进行检测.结果:α-SMA在对照组中未见明显表达.12例臀肌挛缩症组织中α-SMA染色阳性,14例臀肌挛缩组织中染色阴性,病变组与对照组比较差异有显著性(P<0.001);7岁以上组臀肌挛缩症组织α-SMA表达明显减弱,与7岁以下组臀肌挛缩症组织(包括7岁)比较差异有显著性(t=2.364,P=0.028).结论:①肌纤维母细胞是臀肌挛缩症发病的关键病理因素;②臀肌挛缩症中肌纤维母细胞的表达强度与病程有关,7岁以上组病程较长,表达明显减弱,这给临床治疗提供了新思路.【总页数】3页(P219-221)【作者】陈根强;潘志军;周燕;陈丽荣【作者单位】金华职业技术学院医学院骨科,浙江,金华,321000;浙江大学医学院附属二院,浙江,杭州,310009;浙江大学医学院附属二院,浙江,杭州,310009;浙江大学医学院附属二院,浙江,杭州,310009【正文语种】中文【中图分类】R619.6【相关文献】1.α—平滑肌肌动蛋白在掌腱膜挛缩症中的表达及意义 [J], 潘志军;黄宗坚2.α-平滑肌肌动蛋白在呼吸道合胞病毒感染小鼠肺组织中的表达及意义 [J], 卢飞艳; 蒋铁汉; 宋文秀3.α-平滑肌肌动蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义 [J], 孙昭; 李哲; 谷俊杰; 杨莹; 白春梅; 管梅4.α-平滑肌肌动蛋白、上皮钙黏素在腹膜透析大鼠腹膜组织中的表达及意义 [J], 彭霞;徐家云;王朋朋5.口腔扁平苔藓组织中α-平滑肌肌动蛋白的表达及临床意义 [J], 王亚敏;孟文霞;周震;郭薇;谢宝仪因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
尼古丁对大鼠主动脉平滑肌细胞舒缩功能的影响刘继斌;秦小江;岳晗;伊淑贤;侯晓敏【摘要】目的:观察尼古丁对大鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)舒缩功能的影响.方法:体外培养大鼠原代主动脉VSMCs.用不同浓度尼古丁对大鼠主动脉VSMCs干预24 h后,用罗丹明-鬼笔环肽染细胞骨架,拍摄不同实验组的照片,通过测量不同细胞表面积的大小来反映细胞收缩水平;用胶原收缩法观察不同浓度的尼古丁对大鼠VSMCs收缩功能影响.结果:原代大鼠主动脉VSMCs被成功培养.用不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L)尼古丁处理VSMCs 24 h后,其骨架呈现显著收缩,细胞板状化明显增强,且呈浓度依赖性关系;10μmol/L为尼古丁对VSMCs的最适刺激浓度(P<0.01).胶原收缩法也显示,10μmol/L尼古丁对大鼠主动脉VSMCs有收缩作用,随着作用时间的增加,其收缩效应逐渐增强,作用60 min收缩作用最显著(P<0.01).结论:尼古丁对大鼠主动脉VSMCs具有较强收缩作用,其收缩作用具有浓度依赖性和时间依赖性.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2019(035)006【总页数】5页(P1142-1145,1152)【关键词】尼古丁;主动脉;血管平滑肌细胞;收缩功能【作者】刘继斌;秦小江;岳晗;伊淑贤;侯晓敏【作者单位】山西医科大学教务处,山西太原 030001;山西医科大学公共卫生学院,山西太原 030001;山西医科大学公共卫生学院,山西太原 030001;山西医科大学公共卫生学院,山西太原 030001;山西医科大学基础医学院,山西太原 030001【正文语种】中文【中图分类】R329.2+5;R541.9吸烟是加速心脑血管疾病发生的重要危险因素之一。
流行病学和实验研究表明,吸烟可增加机体炎症水平,导致高血压、脑血栓和动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发生[1-3]。
肺间质纤维化大鼠肺组织Q平滑肌肌动蛋白及工型胶原的表达杨敬平李妹楠孙德俊高丽【摘要】目的探讨a平滑肌肌动蛋白(a-smoothmuscleactin,a-SMA)在肺问质纤维化中的意义。
方法将64只Wistar大鼠随机分为对照组和博莱霉素模型组。
在第3天、第7天、第14天和第28天,HE染色观察大鼠肺组织结构的改变。
免疫组织化学法测定肺组织a-SMA和I型胶原的表达,同时用流式细胞术检测肺组织单细胞悬液a-SMA的相对含量。
结果博莱霉素模型组大鼠肺组织a-SMA和I型胶原的表达在各时间段均高于对照组(P<O.05),并且两种因子表达呈正相关。
同时,博莱霉素模型组各时间段两种因子测定结果均结果的差异有统计学意义(P<o.05)。
结论肺问质纤维化大鼠肺组织a-SMA表达增高,预示肌纤维母细胞的形成,导致I型胶原堆积,从而引起肺纤维化。
【关键词】肺问质纤维化;肌纤维母细胞;a平滑肌肌动蛋白;I型胶原Expressionofa-smoothmuscleactinandI—collageninlungtissuesofpulmonaryinterstitialfibrosisratsYANGJing-ping,LIShu—nan,SUNDe-jun,GAoLi.DepartmentofRespiratoryandCriticalMedicine,theThirdAffiliatedHospital,InnerMongoliaMedicalCollege,Baotou014010,Cihina[Abstract]0bjectiveToinvestigatetheexpressionofa-smoothmuscleactin(a-SMA)andI—collagen(col-I)inpathogenesisofpulmonaryinterstitialfibrosis.MethodsSixty-fourWistarratsweredividedintotWOgroups,controlgroup:instillednormalsalineintotracheaandbleomycin(BM)group:instilledBMintotrachea.Thecoursewassacrificed3,7,14,28daysandateachtime-point,thelungtissuemorphologicalchangeswereexaminedbyhistopathology.a-SMAandcol-Iexpressionswerestudiedbyimmunohistochemistry.FlowcytometrywasutilizedtOquantitativelydetecttheprecisionofa-SMAinacellsuspensionoflungtissues.ResultsAtalltime-points,lungtissuesofa-SMAandcol-IincreasedsignificantlyinBMgroupthanthatincontrolgroup(P<0.05).Expressionofcol-1waspositivelycorrelatedwiththatofa-SMA.Therewassignificantdifferencebetweenexpressionofa-SMAandthatofcol-IinBMgroupatalltime-points(P<0.05).ConclusionsTheincreaseofa-SMAinpulmonarytissuesofBM—inducedpulmonaryfibrosisratssuggeststheformationofmyofibroblast,whichmaybeinvolvedinaccumulationofcol-IandcontributedtOpulmonaryfibrosis.[Keywords]Pulmonaryinterstitialfibrosis;Myofibroblast;q-smoothmuscleactin;I-collagen肺问质纤维化是多因素引起的肺间质弥漫性疾病,为多种肺疾病的共同结局。
α-SMA与TGF-β1在大鼠肝纤维化中的表达及相互关系原冬伟;刘秋瑾;刘宏睿;王晓雅;张佳韧;范文禄【摘要】为明确α-SMA和TGF-β1在肝脏纤维化过程中的作用和相互关系,研究首先利用CCl4腹腔注射的方法建立肝脏纤维化大鼠模型,通过组织学、免疫组织化学及蛋白组学方法检测肝脏纤维化过程中病理组织结构变化、α-SMA和TGF-β1的表达情况.结果显示肝脏纤维化模型造模成功,肝脏组织呈现明显纤维化病变特征,α-SMA和TGF-β1的表达呈阳性,且与肝脏纤维化程度呈正相关.α-SMA和TGF-β1是肝脏纤维化过程中的重要细胞因子,能够促进肝脏纤维化的形成,并可能协同参与.【期刊名称】《黑龙江八一农垦大学学报》【年(卷),期】2017(029)005【总页数】5页(P33-36,98)【关键词】肝脏纤维化;CCl4;α-SMA;TGF-β1;大鼠【作者】原冬伟;刘秋瑾;刘宏睿;王晓雅;张佳韧;范文禄【作者单位】黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319【正文语种】中文【中图分类】S852.34肝脏纤维化是以肝脏损伤后细胞外基质沉淀为特征,是肝实质细胞被进展性增生细胞外基质所替代的过程,最终导致肝脏小叶结构改变及血管紊乱[1,2]。
肝脏纤维化发生过程中沉积细胞外基质可来源于不同类型的细胞,肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)是肝脏纤维化过程中最关键的效应细胞[3]。
HSC在多种细胞因子的作用下被激活,进而转化为具有促纤维化、增生、趋化等功能的肌成纤维样细胞[4]。
细胞因子的作用可以影响肝脏纤维化的发生发展,特别是与HSC活化相关的α-平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)和促纤维化效应转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)。
大鼠α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围:96T
2.5ng/ml-80ng/ml
使用目的:
本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠人α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平。
用纯化的大鼠人α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),再与HRP标记的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)浓度。
试剂盒组成
1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融
2.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
操作步骤
1.标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀
2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、
待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。
加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此
重复5次,拍干。
6.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
7.温育:操作同3。
8.洗涤:操作同5。
9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色
15分钟.
10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11.测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
操作程序总结:
1.准备试剂,样品和标准品
2.加入准备好的样品和标准品,37℃反应30分钟
3.洗板5次,加入酶标试剂,37℃反应30分钟
4.洗板5次,加入显色液A、B,37℃反应10分钟
5.加入终止液
6.15分钟之内度OD值
7.计算
计算
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
注意事项
1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4.请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。
5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物请避光保存。
7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9.本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。
保存条件及有效期
1.试剂盒保存:;2-8℃。
2.有效期:6个月。