NK 252_Nrf2激活剂_1414963-82-8_Apexbio

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Reference:FreeRadicalBioMed.2012,52,973-982.
附：泛素与泛素化
泛素是一类低分量的蛋白质，泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程。

泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应:首先在ATP供能的情况下酶E1粘附在泛素分子尾部的Cys残基上激活泛素；接着,E1将激活的泛素分子转移到E2酶上；随后,E2酶和一些种类不同的E3酶共同识别靶蛋白,对其进行泛素化修饰。

E3酶的外形就像一个夹子,靶蛋白连接在中间的空隙内，酶的-侧结构域决定靶蛋白的特异性识别,另一侧结构域定位E2酶以转移泛素分子。

蛋白质泛素化的结果是使得被标记的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。

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ISSN 100727626CN 1123870P Q中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2009年4月25(4):297~303#综述#氧化和化学应激的防御性转导通路)))Nrf2P ARE蔡维霞, 张 军, 胡大海*(第四军医大学西京医院全军烧伤中心,西安 710032)摘要 Nrf2P ARE 是近年新发现的机体抵抗内外界氧化和化学等刺激的防御性转导通路.生理条件下,NF 2E2相关因子2(Nrf2,NF 2E22related factor 2)在细胞质中与Keap1结合处于非活性、易降解的状态.在内外界自由基和化学物质刺激时,Keap1的构象改变或者Nrf2直接被磷酸化,导致Nrf2与Keap1解离而活化.活化的Nrf2进入细胞核,与抗氧化反应元件(ARE)结合,启动ARE 下游的Ò相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶体P 分子伴侣等基因转录和表达以抵抗内外界的有害刺激.M APK 、PI3K P A K T 、PKC 等信号通路分子广泛参与了Nrf2的活化和核转位过程,但是具体何种通路被激动、何种通路发挥主导作用,取决于刺激物种类、刺激方式和细胞类型.本文就N rf2分子结构、Nrf2活化机制、Nrf2P ARE 调控的下游基因、与Nrf2相关的信号通路分子以及其在肿瘤、炎症、衰老等应用领域的最新进展进行综述.关键词 N F 2E2相关因子2;Keap1;氧化和化学应激;细胞保护中图分类号 Q291;R34Defensive Pathway of Nrf2P ARE Involved in Oxidative and Chemical StressC AI Wei 2Xia,Z HANG Jun,HU Da 2Hai*(Burns C ente r o f PL A ,Xi jing Hos pital ,Fourt h Military Medic al Universit y ,Xi .an 710032,C hina )Abstract Nrf2(N F 2E22related fac tor 2)P ARE(antioxidant response element)is a novel def ensive pathwayinvolved in oxidative and chemical stress of cells.Under physiological conditions,Nrf2binds to kelch 2like ECH 2associated protein 21(Keap1)in the cytoplasm,remains inactivated and easy to be degradated.Under oxidative or chemical stress,Keap1modification or Nrf2phosphorylation result in activation of Nrf2through its dissociation from Keap1.The ac tivated Nrf2translocates into the nucleus and interacts with ARE.The e xpression of cytoprotective targe t genes,including phase Òdetoxif ying enzymes,antioxidant proteins and the molecular proteasome P chaperones is then transac tivated in response to the stress.Signal molecules,such as M APK,PI3K P A KT,PKC,etc.,extensively involved in the process of N rf2activation and translocation to the nucleus,however,which pathway to be activated and play a key role depends on the type of stimuli or cells and the way of stimulation applies.This article summarizes the latest research progresses regarding the molecular structures and the activation mechanisms of Nrf2,the signaling molecules and do wnstrea m genes of Nrf2P ARE pathway and their implications in tumor therapy,inflammation and aging.Key words NF 2E22related factor 2;Keap1;oxidative and che mical stress;cytoprotection 收稿日期:2008208220;接受日期:2008210221*联系人 Tel:029*********;E 2mail:burns@fm m Recei ved:August 20,2008;Accepted:October 21,2008*C orres pondi ng author Tel:029*********;E 2m ail:burns@fm 自由基介导的氧化应激广泛参与众多病理生理变化,缺血再灌注损伤是氧化应激的急性表现,慢性氧化应激导致的氧化还原状态失衡是肿瘤、炎症、衰老等发生过程中的重要原因.如何有效清除过量自由基是许多领域研究的共同热点.近年发现,NO 、H 2O 2等多种自由基是重要的信号转导分子.而传统上利用维生素C 等还原性物质的抗氧化治疗并没有在体内实验中取得预期效果,使人们意识到:单纯过度补充还原性物质在清除过量有害自由基的同时亦会影响自由基作为信息分子的正常生理功能.而Nrf2P ARE 是迄今为止最为重要的抗氧化应激通路,由于其内源性特点,对于它的调节为实现适度、可控的抗氧化治疗开辟了新途径.1Nrf2P ARE转导通路分子基础111NF2E2相关因子2(Nrf2)结构基础Nrf2P EC H(NF2E22related fac tor2或chicken erythroid2derived CN C2homology factor)是包括P452 NFE2、Nrf1、Nrf2、Nrf3、Bach1(the B TB and CNC homolog1)和Bach2在内的C NC(cap/n0collar)转录因子家族成员,是其中活力最强的转录调节因子[1]. Nrf2含有6个不同的功能区,分别被命名为Neh l~ Neh6(见Fig.1).Nehl区包含1个C端亮氨酸拉练结构bZ IP(leucime zipper),bZIP与细胞核内小M af蛋白(small M af proteins,包括Maf G、Maf K、M afF)形成异二聚体,使Nrf2能够识别、结合抗氧化反应元件(antioxidant response ele ment,ARE)上的(A P G)TG A (C P T)nnn G C(A P G)D NA基序从而启动目标基因转录.Neh2区是Nrf2与胞浆蛋白Keap1结合区,Neh2上的E TG E基序在这一过程中有重要作用,E TG E缺失或突变会导致Nrf2丧失与Keap1结合的能力[2]. Neh3结构域位于羧基端,具有高度保守性,C HD6 (chromodomain helicase D NA binding protein6)与其结合,可上调N rf2靶基因的表达[3].Neh4,Neh5是参与启动下游基因转录的结构域,当进入细胞核的Nrf2以Nrf22M af的形式与A RE结合后并不能立即启动转录,尚需要其他辅助蛋白例如CREB(cA M P responsive eleme mt binding protein)结合蛋白(CB P)等转录激活剂与N rf2的Neh4,Neh5两个结构域结合后,才能启动转录过程[4].Neh6结构域是氧化还原非敏感区,对氧化应激状态下Nrf2降解有重要作用[5].112Keap1基本结构和功能Keap1蛋白是Nrf2在细胞质中的结合蛋白,通过结合Nrf2使之无法进入细胞核从而抑制Nrf2活性.该蛋白因与果蝇肌动蛋白结合蛋白Kelch (D rosophila actin2binding protein Kelch)相似而得名Keapl(Kelch2like EC H2associated protein1)[7].它是包含624个氨基酸的多肽,共有5个结构域:N TR(N端结构域)、B TB P PO Z、IV R(插入结构域)、D GR和C TR (C端结构域)(见Fig.1).D G R包含6个双链Gly (甘氨酸)重复片段,是与Nrf2结合的位点,同时也是与胞浆内肌动蛋白结合的位点[8].B TB P POZ结构域与Keap1自身形成同蛋白二聚体有关.Z ipper等[9]证实,在B TB P POZ结构域中存在1个高度保守的Ser104(丝氨酸),当此Ser104突变后将导致Keap1同二聚体形成障碍进而减弱与Nrf2分离的能力.Keap1与亲电子化合物及氧化剂的反应发生在插入区IV R,在外界氧化或化学物质刺激下富含Cys(半胱氨酸)的IVR区发生构象变化导致与Nrf2解离[10].Fig.1Schema tic r epr esentation of the r egions conserved in Nrf2and Keap1[6,11]The co nserved regi ons were identified fro m sequence alignment of chicken and human Nrf2, and mouse,rat and human Keap12Nrf22的激动机制211Keap1构象变化亲电子物质与Keap1的半胱氨酸残基反应引起Keap1构象变化,导致Nrf2与之解离是Nrf2最普遍的活化方式.其主要感受氧化反应的是Keap1的Cys257、C ys273、Cys288、Cys297、Cys613.其中在IVR 的Cys273和Cys288作用更为重要,如果这2个位点的半胱氨酸变异为丙氨酸和丝氨酸,将引起依赖Keap1的Nrf2的泛素化降解程度下降,导致Nrf2稳定性增加[12].B TB(brord comple x,tramtrack,and bric2 brac P poxvirus and zinc finger)结构域的Ser104在形成keap1同二聚体过程中发挥重要作用,当Ser104突变将影响同二聚体的形成导致Nrf2的释放障碍[13].2.2Nrf2直接磷酸化蛋白激酶是通过直接磷酸化Nrf2的方式促使其与Keap1分离,激活Nrf2.在Ò相解毒酶诱导剂刺激后M APK2P38(促分裂源活化蛋白激酶P38)、PKC (蛋白激酶C)和PERK(胰腺内质网激酶)等蛋白激酶被激活,进而导致Nrf2以磷酸化方式活化引起ARE(抗氧化反应元件)的表达增加[14].而特异性激酶抑制剂可以阻滞这种激活.Nrf2的Ser40是PKC 作用靶点,若用Ala代替Ser40,上述PKC激活N rf2程度将严重下降[15].Numaza wa等[16]研究发现,当Nrf2的Ser40被谷氨酸代替,即使没有N rf2激动剂刺激,也同样出现Nrf2磷酸化的系列变化,Nrf2在细胞核含量大幅度增高.酪氨酸激酶FYN可以通过磷酸化Tyr2568(酪氨酸568)引起N rf2构象变化,使Nrf2与Keap1分离而活化Nrf2.Nrf2磷酸化是另一主要的Nrf2激活方式[17].298中国生物化学与分子生物学报25卷2.3减少Nrf2的降解正常情况下,Nrf2以Keap12Nrf2异二聚体的形式存在细胞质中,以Keap1介导的蛋白酶体泛素化反应的方式所降解,处于低浓度的非活性状态.利用蛋白酶体抑制剂可以减少对Nrf2的降解,增加其在细胞核的蓄积.在HepG2细胞利用蛋白酶体抑制剂后发现:细胞核内Nrf2蛋白含量增加,Nrf2下游基因ARE编码C2GCL(C谷氨酰半胱氨酸合成酶)的mRNA增加[18].在小鼠的角质细胞观察到同样结果:早期应用蛋白酶体的抑制剂M G132可增加细胞Nrf2含量[19].2.4竞争性抑制方式Karapetian等[20]报道,前胸腺素A可以和Keap1直接特异性结合,其结合能力超越Nrf2,导致Nrf2与Keap1分离而活化.在体内实验中,利用基因过表达和RNA干涉证明:Nrf2进入细胞核的多少与前胸腺素A含量密切相关.除前胸腺素A外,FAC1蛋白(AL Z250活性克隆1蛋白)亦是通过与Nrf2竞争性结合keap1的方式来影响Nrf2活化程度的重要因子.在人类的阿耳茨海默氏病等神经退行性变疾病中发现:胎儿FAC1蛋白改变引起Nrf2活化障碍是其发病重要原因[21].与发生在细胞质中竞争性抑制Nrf2不同的是Bach1,它是细胞内固有的负性调控ARE的转录因子,尽管它不影响Nrf2的释放和核转位,但是因为其具有与Nrf2同样的C NC结构,可以在细胞核内与Nrf2竞争ARE结合位点,从而下调ARE下游基因的表达[22].以上是目前所知的Nrf2主要激活机制(见Fig.2),其中许多细节尚需要进一步完善,对于Nrf2激活机制的了解有助于特异性干预药物的研制.3Nrf2调节的下游基因Nrf2P A RE之所以重要是因为激活后能够启动下游多种保护性基因的表达.到目前为止,大约发现200个基因是被Nrf2激活调控的,其在不同的条件下被不同的激活物激活,其激活的基因种类和程度决定于激活剂类型,激活方式和被激动的对象. 3.1Ò相解毒酶基因致癌物质在Ñ相解毒酶(如细胞色素P450)作用下转化为有活性的致癌物,而Ò相解毒酶则可以增加这些活性致癌物质的亲水性,促进其排出体外.莱菔硫烷(sulforaphane)是N rf2典型激动药物,以40 L mol P d莱菔硫烷剂量连续喂养小鼠5d,可以提高肝脏、胃、小肠和肺等脏器的苯琨还原酶1(NQ O1)和Fig.2Schematic over view of Nrf2P A RE activation by ROS[23]N rf2is retained in the cytoplas m by actin2bound Keap1.Upon o xidative stress the Keap12Nrf2co mplex is disrupted and Nrf2i s translocated to the nucleus,w here it activates ARE2mediated gene transcriptio n o f antioxidant enzy mesG S T(谷胱甘肽2S2转移酶)的含量;而增加程度是与Nrf2蛋白表达增加呈现正相关[24].Kim等[25]证实, Nrf2与ARE结合的位点位于Prx1(peroxiredoxins1,过氧化物还原酶1)启动子近位的(-536~-528),和远位的(-1429~-1421).在缺氧再复氧的人肺癌A549细胞模型中,发现Nrf2在野生型细胞核含量增加,Prx1的表达增强,而在Nrf2基因敲除细胞中无法观察到这种变化.目前,在Nrf2能够促进Ò相解毒酶系统的表达上达成共识,但是不同实验报道的Ò相解毒酶种类和范围不尽相同,可能是由诱导剂种类,细胞类型和作用时间的不同而引起.3.2抗氧化蛋白类基因机体抵抗自由基损害因素主要包括维生素C 等非酶类还原性物质和众多的抗氧化酶类.其中抗氧化酶类通过催化自由基转化为无毒物质和增加其水溶性利于自由基排除而发挥作用,是维持机体氧化还原平衡的重要因素.利用500L mol P L H2O2刺激大鼠肝脏原代细胞24h,在刺激之前给予浓度50 L mol P L白藜芦醇共培养24和48h,发现24h治疗组C AT(过氧化氢酶)增加幅度最高,而SO D(过氧化物歧化酶)在48h治疗组活性最高.利用PC R发现治疗组Nrf2的RN A水平最高,可以达到非治疗组1.4倍;利用免疫荧光,发现Nrf2存在治疗组的细胞质和细胞核中,在非治疗组只存在细胞质中.此实验说明,白藜芦醇可激活Nrf2,Nrf2促进S OD,C A T的表达[26].Kim等[27]检测T AM(tamoxif en,三苯氧胺)耐药299第4期蔡维霞等:氧化和化学应激的防御性转导通路)))Nrf2P A RE的M CF27肺癌细胞系和普通M CF27肺癌细胞中GS H(谷胱甘肽)和C2G CL的差异,发现在耐药细胞组此两种蛋白和细胞核的Nrf2含量均高于普通M CF27肺癌细胞.把Nrf2显性负相的质粒转染进耐药的M CF27肺癌细胞系,发现G SH和C2GC L蛋白含量大幅度下降.此实验除了证明耐药性与Nrf2活性增高有关外;而且直接证明Nrf2是G S H和C2G CL的表达转录因子.313蛋白酶体P分子伴侣类基因蛋白酶体是细胞调控特定蛋白质和降解错误折叠蛋白质的主要场所.包括热休克蛋白在内的分子伴侣家族,一方面可以标记受损蛋白,一方面增加蛋白酶体系统降解蛋白的活性.研究发现,26S蛋白酶体亚单位蛋白合成能力随着衰老和氧化应激的发生而下降,进而导致其降解蛋白的能力的降低[28]. psmb5,是26S蛋白酶体20S核心颗粒中的关键催化亚单位,其基因启动子附近存在A RE元件,可以被Nrf2激活.实验证明应用Nrf2诱导剂D3T(3H21,22 dithiole232thione,氚二硫杂环戊二烯硫酮),可引起构成20S核心颗粒14个中的12个亚单位蛋白表达升高[29].Cullinan等[30]实验证明,未折叠蛋白可以激活EI F2A(真核起始因子2A)激酶家族的PERK,而PE RK可以激活N rf2,增强分子伴侣蛋白的翻译表达和提高蛋白酶体活性,此实验部分解释了Nrf2基因缺乏型细胞比野生型细胞更容易在错误蛋白刺激下发生死亡的原因.3.4抗炎因子类基因有研究表明,Nrf2诱导剂角叉菜胶(carrageenan)可以增加细胞内HO21(血红素加氧酶)和Prx1的表达,HO21可以通过产生低浓度一氧化碳来中和L PS (脂多醣)诱导的促炎因子TNF2A(肿瘤坏死因子A)和I L21(白介素1),而Prx1是抑制M IF(巨噬细胞游走因子)的抗炎症因子[31].诱导的另一重要抗炎基因是白三烯B412磷酸化酶.此激酶可以减少白三烯B4刺激导致的中性粒细胞的移动,降低过氧化物阴离子的产生[32].3.5其它基因M RP2(多向性抗药蛋白2)的产生是肿瘤细胞对化疗药发生耐药性的重要机制.有研究显示:应用BHA(叔丁对甲氧酚)激活Nrf2后,小鼠肝脏M RP2转录活性显著增加;同样结果可以在三氯苯氧乙酸刺激人肝脏瘤细胞(HEPG2)实验中观察到.Nrf2参与M RP2基因表达的分子基础是:在小鼠M RP2基因启动子附近存在2个分别为ARE1(-95~-85),ARE2(-1391~-1381)的A RE样序列[33].4与Nrf2相关信号通路分子4.1MAPK(丝裂原活化的蛋白激酶)M APK是一组可以被多种信号激活的蛋白丝P 苏氨酸激酶,主要参与细胞生长、分化和外界刺激条件下细胞适应的重要转导通路.主要包含:ERK, JNK,P38等.Song等[34]利用吲哚美辛导致的猫回肠平滑肌损伤模型,在给予吲哚美辛前先用异泽兰黄素(eupatilin)预防治疗12h,结果显示:异泽兰黄素导致Nrf2表达增加可减轻吲哚美辛的炎症损伤.但是给予ERK的抑制剂PD98059作用后,异泽兰黄素保护作用消失同时细胞核提取物的免疫印迹技术显示细胞核Nrf2表达明显减弱.此实验说明了ERK在此实验中是Nrf2上游通路.Kim等[35]利用顺铂作用于肺癌细胞A549时发现,Nrf2表达增加会提高顺铂耐药的发生率.分别用M APK的3种抑制剂ERK的PD098059、P38的SB203580、JN K的SP600125与细胞共培养后再用10 L mol P L顺铂刺激,Western印迹显示,HO21表达减少50%~70%;Nrf2表达减少50%的同时,对顺铂的耐药性也明显下降.此实验证明,在此条件下,ERK、JNK、P38等3种M A PK都参与了Nrf2的调控.4.2PI3K(磷脂酰肌醇232激酶)PI3K P Akt信号转导通路具有调控细胞迁移、增殖和存活等多种生物学功能,是体内重要的存活途径.在大鼠嗜铬细胞PC12氧化应激模型中,H2O2和倍半萜内酯(sesquiterpene lactones)共同作用能够引起Nrf2和其调控的基因HO21增加,同时PI3K P A K T 表达增加;在培养液中加入PI3K抑制剂L Y294002和细胞共培养1h,细胞核提取物的Western印迹结果显示,Nrf2表达下降20%~30%.可以说明在此实验条件下,Nrf2的激活是部分依赖于PI3K P AK T途径[36].用姜黄素干预血管平滑肌细胞发现:利用Western印迹检测到磷酸化A K T增加,同时荧光素酶标记的ARE基因活性增加.若予抑制剂L Y294002作用细胞15min后再给予姜黄素干预,发现A RE的活性显著降低.当共同应用L Y294002和P38抑制剂SB203580则能完全阻止姜黄素引起的A RE活性增加的表现.此实验说明,NRF22的激活是依赖于PI3K P AK T和P38途径的[37].4.3PKC(蛋白激酶C)PKC是目前公认在细胞内外都具有Nrf2激动能力的激酶,其机制是PKC能够磷酸化Nrf2的丝氨300中国生物化学与分子生物学报25卷酸40,引起N rf2从Keap1释放.利用T2B HQ诱导细胞发现Nrf2转移到细胞核,用PKC的抑制剂十字胞碱处理后,细胞核Nrf2含量显著减少[15].Kim等[38]利用荧光素酶基因标记的ARES转染到巨噬细胞系RAW26417,通过荧光分光光度计测量荧光数值来反应ARE表达活性的高低.发现氯硝柳胺刺激RAW26417可以诱导ARE活性增加,HO21蛋白表达增加.PKC非特异性抑制剂GF109203X和PKC D的抑制剂rottlerin可以明显抑制ARE活性表达和HO21的表达.但是A特异性的抑制G O6976却没有此效果.在同样的条件下,不利用抑止剂而是把PKC D钝化形式PKC D(K376)的基因转染入细胞发现可以同样抑止ARE基因的活性表达;而转染PKC A钝化形式(K368)基因则无此作用.更直接证明激活N rf2的是PKC D,不是PK C A.目前对于影响Nrf2的相关转导通路研究结果不尽相同.例如在白藜芦醇刺激PC12细胞诱导Nrf2实验中,显示Nrf2的激活是通过ERK通路[39].但是在白藜芦醇作用于大鼠主动脉平滑肌细胞的细胞中则证实是通过NF2J B而不通过M APK[40].对于这些不同的结果,考虑可能与刺激方式和细胞类型有关.5Nrf2与相关疾病5.1肿瘤的化学预防和化疗的耐药性嵌二奈苯是潜在的强致癌物,经过生物转化后形成D NA加合物导致胃和肺脏等器官发生癌变. Romas2G omez等[6]利用嵌二奈苯刺激Nrf2野生型和基因敲除型2种小鼠,同时验证Nrf2激动剂奥本普拉的肿瘤预防的药效.结果显示:在嵌二奈苯刺激下,Nrf2野生型组的喷门窦D NA加合物的含量低于基因敲除组;应用奥替普拉(peroxiredoxin)的野生型明显低于未应用组.4周后检测喷门肿瘤发生率显示:野生型比敲除型低56%;应用奥替普拉的野生型则比未应用组下降48%.Aoki等[41]利用汽车尾气暴露于野生型和基因敲除型小鼠,10h P d,发现基因敲除型动物肺脏中表示细胞癌变指标的D N A加合物量,是野生型2~3倍.以上实验均说明,Nrf2通路在预防肿瘤发生中具有重要作用.肿瘤化疗药物的耐药性是肿瘤治疗中棘手的问题.研究发现,Nrf2在肿瘤耐药中扮演重要角色. Shibata等[42]把胆管癌细胞Keap1基因沉默后,发现此细胞对52服尿嘧啶的耐药性增加;补充Keap1或者Nrf2的RNA干涉均能提高对52服尿嘧啶的敏感性.目前认为,Nrf2激活后耐药蛋白的产生是产生耐药性的重要原因.从上述两方面结果可以发现:N rf2具有降低肿瘤易感性和增加肿瘤耐药性的双重作用,提示在肿瘤预防和肿瘤化疗不同阶段对于N rf2的调控要区别对待.5.2炎症慢性神经炎症反应是神经变性疾病的标志,而神经小胶质细胞是神经系统主要的炎症细胞. Innamorato等[43]研究表明:在LPS(脂多糖)诱导小鼠海马的炎症模型中,Nrf2基因缺陷型的TN F2A(肿瘤坏死因子A),iNO S(诱生性NO合酶),IL26(白介素6)都比野生型高;同时小胶质细胞的标志物F4P80蛋白增加明显.而应用Nrf2诱导剂莱菔硫烷后发现:在野生型小鼠的海马中上述炎症因子表达和小胶质细胞含量均下降.O sburn等[44]报道,通过静脉注射刀球蛋白,一种T细胞介导的肝炎特异诱导剂,24h后建立小鼠肝炎模型,在注射刀球蛋白前3d,以30L mol P kg剂量给予Nrf2激活剂倍半萜化合物治疗.结果显示:野生型的肝细胞死亡的数量和其炎症程度都优于N rf2基因敲除型.而Keap1基因敲除型与应用倍半萜化合物的野生型对于肝细胞的保护具有类似的效果. 5.3衰老机体氧化损伤的累积,抗氧化能力下降是衰老的重要原因.Shih等[45]研究2月、1年、2年大鼠红细胞的溶血程度发现:2月大鼠的红细胞抵抗溶血能力最强.反映细胞膜氧化水平指标的M D A和反应蛋白功能失调的碳酰蛋白都随年龄增加而增加.通过肝细胞匀浆液检测抗氧化酶表达发现:2年大鼠G PX(谷胱甘肽过氧化物酶)、GR(谷胱甘肽还原酶)、C AT、N QO1(苯琨还原酶)比年轻老鼠分别下降23%、49%、26%、86%.而Nrf2含量下降46%.此实验说明Nrf2与机体的老化过程关系密切.在衰老过程中,接触性免疫反应和T细胞免疫都是下降的,而树状突细胞的氧化还原平衡状态是维持细胞免疫的关键因素,其氧化还原状态紊乱导致的接触性过敏反应和T细胞免疫能力下降是衰老在免疫系统的表现.Kim等[46]把老年大鼠的树状突细胞移植到年轻大鼠会导致年轻大鼠免疫能力下降,但是在体外经过Nrf2激动剂刺激过的树状突细胞(来源于衰老大鼠)移植到年轻老鼠则可以提高抗氧化酶和GS H合成能力,提高机体的接触性免疫反应和T细胞免疫能力.此实验表明,激活Nrf2可以对抗衰老引起的免疫能力下降.除以上方面以外,Nrf2在缺血再灌注损伤,抗细301第4期蔡维霞等:氧化和化学应激的防御性转导通路)))Nrf2P A RE胞凋亡等领域的应用研究也方兴未艾,多领域研究均表明Nrf2在抵抗外来刺激尤其是氧化P化学应激,保护机体功能方面具有显著效果.6结语与展望机体内氧化还原水平失衡是众多疾病的病理生理基础,调节体内氧化水平是改善上述病理生理变化的策略之一.不同于以往的外源性抗氧化剂,N rf22 ARE抗氧化系统由于是调控多种抗氧化酶转录表达的关键内源性通路,对于此通路的调控为实现有效、适度抗氧化治疗提供了新方法.而且Nrf22ARE 通路在抗化学物质毒性、内质网应激等方面亦显示了重要作用.通过对此通路全面,精确的了解,将为肿瘤,炎症,衰老等领域的预防和治疗开辟新的途径.参考文献(References)[1]Yu X,Kens ler T.Nrf2as a target for cancer chemoprevention[J].Mutat Res,2005,591(122):932102[2]Nioi P,Mc Mahon M,Itoh K,e t al.Identificati on of a novel Nrf22regulated antioxi dant response elem ent(ARE)in the mous e NAD(P)H:quinone oxidoreductas e1gene:reas sess ment of the AREconsens us s equence[J].B iochem J,2003,374(Pt2):3372348 [3]Nioi P,Nguyen T,Sherratt P J,et al.The carboxy2termi nal Neh3dom ai n of Nrf2i s required for transcripti onal ac tivation[J].Mol CellBiol,2005,25(24):10895210906[4]Katoh Y,Itoh K,Yoshi da E,et al.Two domains of Nrf2cooperatively bi nd CB P,a CREB binding protein,and s ynergisticall yac tivate transcripti on[J].Genes Cells,2001,6(10):8572868 [5]Mc Mahon M,Tho mas N,Itoh K,et al.Redox2regulated turnover ofNrf2is determi ned by at least two separate protein domains,the redox2sensi ti ve Neh2degron and the redox2insensitive Neh6degron[J].JBiol C hem,2004,279(30):31556231567[6]Ram os2Gom ezM,Dol an P M,Itoh K,et al.Interactive effects ofnrf2genotype and olti praz on benzo[a]pyrene2DN A adducts andtumor yield in mice[J].C arcinogenesis,2003,24(3):4612467 [7]Kobayashi M,ltoh K,Suz uki T,et al.ldenti fication of theinteractive i nterface and phylogenic conservation of the Nrf22Keap1system[J].Genes C ells,2002,7(8):8072820[8]Kang M I,Kobayashi A,W akabayashi N,et al.Scaffoldi ng ofKeap1to the actin cytos keleton control s the function of Nrf2as keyregulator of c ytoprotective phase2genes[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2004,101(7):204622051[9]Zipper L M,Mulcahy R T.The Keap1B TB P POZ dim erizationfunc tion is required to seques ter Nrf2in cytopl as m[J].J Biol Che m,2002,277(39):36544236552[10]Di nkova2Kostova A T,Holtzclaw W D,C ole R N,et al.Directevidence that s ulfhydryl groups of Keap1are the sensors regulatinginduction of phase2enzymes that protect agains t carcinogens andoxidants[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(18):11908211913[11]W akabayas hi N,Itoh K,W akabayas hi J,et al.Keap12null m utati onleads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2acti vation[J].NatGenet,2003,35(3):2382245[12]W akabayas hi N,Dinkova2Kostova A T,Holtzclaw W D,e t al.Protection against electrophile and oxidant stres s by i nduc tion of thephase2response:fate of cysteines of the Keap1sens or m odifi ed byinducers[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(7):204022045 [13]Eggler A L,Liu G,Pezzuto J M,et al.Modifying s peci fic c ys teinesof the electrophilesensing human Keap1protein i s ins uffici ent todisrupt bindi ng to the Nrf2dom ai n Neh2[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2005,102(29):10070210075[14]C ullinan S B,Diehl J A.PERK2dependent activation of Nrf2contributes to redox homeos tasis and cell s urvi val follo wi ngendoplas mic reticulum stres s[J].J Bi ol Che m,2004,279(19):20108220117[15]Bl oom D A,Jais wal A K.Phosphorylation of Nrf2at Ser40by proteinkinase C in response to antioxidants leads to the releas e of Nrf2fromINrf2,but is not required for Nrf2s tabiliz ation P accum ulati on in thenucleus and transcriptional activati on of anti oxidant res ponse ele ment2mediated NAD(P)H:quinone oxidoreductase21gene express ion[J].JB iol Chem,2003,278(45):44675244682[16]Numaza wa S,IshikawaM,Yoshi da A,et al.Atypical protein ki naseC medi ates acti vation of NF2E22related factor2in res ponse tooxidative s tress[J].A m J Physi ol C ell Physiol,2003,285(2):C3342342[17]Jain A K,J ais wal A K.GSK23beta acts ups tream of Fyn kinas e inregulati on of nuclear export and degradation of N F2E2related fac tor2[J].J B iol Chem,2007,282(22):16502216510[18]Sekhar K R,S ol tani nassab S R,B orrelliM J,e t al.Inhibi tion of the26S proteas ome i nduces expression of G LC LC,the catalytic subunitfor ga m ma2glutam ylc ys teine synthetase[J].B ioc hem Bi ophys ResC om mun,2000,270(1):3112317[19]K wak M K,Itoh K,Yam amoto M,et al.Enhanced expression of thetranscription factor Nrf2by cancer chemopreventive agents:role ofanti oxidant response elem ent2like s equences in the nrf2prom oter[J].Mol Cell Bi ol,2002,22(9):288322892[20]Karapetian R N,Evstafi eva A G,Abaeva I S,et al.Nuclearoncoprotei n prothymosin alpha is a partner of Keap1:im plicati ons forexpression of oxi dative stress2protecting genes[J].Mol Cell B iol,2005,25(3):108921099[21]S trachan G D,Morgan K L,Otis L L,e t al.Fetal Alz250clone1interacts with the human orthol ogue of the Kelch2like Ech2associatedprotein[J].B iochem istry,2004,43(38):12113212122[22]Ishikawa M,Num azawa S,Yoshida T.Redox regulation of thetranscriptional repres sor B ach1[J].Free Radic Bi ol Med,2005,38(10):134421352[23]Schreibelt G,van Hors sen J,van Ross um S,et al.Therapeuticpotenti al and biol ogical role of endogenous anti oxidant enzymes inmul tiple sclerosis pathol ogy[J].B rain Res Rev,2007,56(2):3222330302中国生物化学与分子生物学报25卷[24]Munday R,Munday C M.Induction of phase II detoxi ficationenz ymes in rats by plant2derived isothiocyanates:comparison of all ylisothiocyanate wi th sul foraphane and related compounds[J].J AgricFood C hem,2004,52(7):186721871[25]Ki m Y J,Ahn J Y,Liang P,et al.Hum an prx1gene is a target ofNrf2and i s up2regulated by hypoxi a P reoxygenation:im plicati on totumor biology[J].Cancer Res,2007,67(2):5462554[26]Rubi olo J A,Mithieux G,Vega F V.Resveratrol protects pri mary rathepatocytes agains t oxidati ve s tress dam age:Activati on of the Nrf2transcripti on factor and augmented activities of antioxidant enz ymes[J].Eur J Pharmacol,2008,591(123):66272[27]Ki m S K,Yang J W,Ki m M R,et al.Increased expressi on of Nrf2PARE2dependent anti2oxidant proteins in tam oxifen2resis tant breastcancer cells[J].Free Radic Bi ol Med,2008,45(4):5372546 [28]B ul teau A L,Sz weda L I,Friguet B.Age2dependent decli nes inproteas ome activity in the heart[J].Arch Biochem B iophys,2002,397(2):2982304[29]Kwak,M K W akabayas hi N,Itoh K,et al.Modulati on of geneexpress ion by cancer chemopreventive dithiolethiones through theKeap12Nrf2pathway.Identification of novel gene clus ters for cellsurvival[J].J B iol Chem,2003,278(10):813528145[30]Cullinan S B,Zhang D,Hannink M,e t al.Nrf2is a direct PERKsubstrate and effector of PER K2dependent cell s urvi val[J].Mol CellBiol,2003,23(20):719827209[31]Otterbein L E,B ac h F H,Alam J,et al.C arbon monoxide has anti2inflam m atory effects involvi ng the mi togen2activated protein kinasepathway[J].Nat Med,2000,6(4):4222428[32]Prim iano T,Li Y,Kensler T W,et al.Identification ofdithi olethi one2inducible gene21as a leukotriene B4122hydroxydehydrogenas e:i mplications for chem oprevention[J].Carci nogenesis,1998,19(6):99921005[33]Vollrath V,Wielandt A M,Iruretagoyena M,et al.Role of Nrf2inthe regulati on of the Mrp2(AB CC2)gene[J].Bi ochem J,2006,395(3):5992609[34]Song H J,Shi n C Y,Oh T Y,et al.The protec tive effect ofeupatilin on indom ethaci n2induced cell dam age in cultured feline ilealsm ooth m uscle cells:Involvem ent of HO21and ERK[J].JEthnopharmacol,2008,118(1):942101[35]Ki m H R,Ki m S,Ki m E,et al.S uppres sion of Nrf22dri ven hemeoxygenase21enhances the chem os ensitivity of lung cancer A549cellsto ward cis platin[J].Lung Cancer,2008,60(1):47256[36]U mem ura K,Itoh T,Hamada N,e t al.Preconditioning byses qui terpene lactone enhances H2O22i nduced Nrf2P ARE activati on[J].Bioche m B iophys Res C om mun,2008,368(4):9482954 [37]Kang E S,Woo I S,Kim H J,et al.Up2regulati on of aldosereductas e expression m ediated by phos phatidylinosi tol32kinase P Aktand Nrf2is involved in the protective effec t of curcum in agains toxidative dam age[J].Free Radic B iol Med,2007,43(4):5352545 [38]Kim B C,Jeon W K,Hong H Y,et al.The anti2inflam m atoryactivi ty of Phellinus linteus(Berk.&M.A.C urt.)is mediatedthrough the PKC-P Nrf2P ARE signaling to up2regulation of hem eoxygenase21[J].J Ethnopharmacol,2007,113(2):2402247 [39]C hen C Y,Jang J H,Li M H,et al.Resveratrol upregulateshemeoxygenas e21e xpressi on via activati on of NF2E22related factor2in PC12cells[J].Bi oche m Bi ophys Res C om mun,2005,331(4):99321000[40]Huang H M,Liang Y C,C heng T H,et al.Potential mechanis m ofblood vessel protec tion by res veratrol,a com ponent of red wine[J].Ann N Y Acad Sci,2005,1042:3492356[41]Aoki Y,S ato H,Ni shi mura N,et al.Accelerated DNA adductform ation in the lung of the Nrf2knockout m ouse e xposed to dieselexhaust[J].Toxicol Appl Pharm acol,2001,173(3):1542160 [42]Shibata T,Kokubu A,Gotoh M,e t al.Genetic alteration of keap1confers cons ti tutive nrf2activation and res istance to che motherapy ingall bladder cancer[J].Gas troenterology,2008,135(4):135821368[43]Inna morato N G,Rojo A I,Garcia2Yague A J,et al.Thetranscription fac tor Nrf2is a therapeutic target against braininflam mation[J].J Im m unol,2008,181(1):6802689[44]Os burn W O,Yates M S,Dolan P D,et al.Genetic orpharmacologic ampli fication of nrf2signaling inhi bits acuteinflam matory liver i njury in mice[J].Toxicol Sci,2008,104(1):2182227[45]Shih P H,Yen G C.Differential e xpressions of antioxidant status inaging rats:the role of transcriptional factor Nrf2and MAPK si gnali ngpathway[J].Biogerontology,2007,8(2):71280[46]Kim H J,Baraj as B,Wang M,e t al.Nrf2activation by sulforaphanerestores the age2related decrease of T(H)1i m munity:role ofdendritic cells[J].J Allergy C lin Im munol,2008,121(5):125521261303第4期蔡维霞等:氧化和化学应激的防御性转导通路)))Nrf2P A RE。