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信号分子与叶锈菌诱导下小麦病程相关蛋白1基因的表达分析作者：栗小英等来源：《江苏农业科学》2015年第09期摘要：病程相关蛋白1（pathogenesis-related proteins1，PR1）是一类以基因家族形式存在的重要病程相关蛋白，在前期研究中，在小麦抗叶锈病近等基因系材料TaLr35中成功获得了1个小麦病程相关蛋白1基因TaLr35PR1，具有植物防御体系中的SCP保守结构域。
利用生物信息学方法进一步明确，该基因含有信号肽，定位于细胞间隙，可能含有跨膜结构域，相对分子量为17.3 ku，与多个植物病程相关蛋白1序列具有较高同源性；利用半定量RT-PCR方法结合genetools、SPSS软件分析TaLr35PR1基因表达模式，结果表明，信号分子水杨酸（salicylic acid，SA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）明显诱导该基因表达，且用信号分子预处理后接种叶锈菌，基因表达量明显增加；构建了TaLr35PR1基因的原核表达载体pEASY-PR1，在大肠杆菌中高效表达分子量约为17 ku的融合蛋白，明确其最佳诱导条件为在 0.8 mmol/L IPTG下于25 ℃诱导8 h。
关键词：叶锈菌；信号分子；病程相关蛋白1；表达分析；原核表达中图分类号： Q756文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0028-04收稿日期：2014-08-27基金项目：国家重点基础研究发展计划（编号：2013CB127700）；河北省自然科学基金（编号：C2012204005）。
作者简介：栗小英（1988—），女，河北张家口人，硕士研究生，研究方向为分子植物病理。
E-mail：506112516@。
通信作者：王海燕，副教授，主要从事分子植物病理学研究。
E-mail：ndwanghaiyan@。
植物在长期的进化过程中，为了抵抗病害对自身生长的不良影响，在一定程度上发展了感受生物胁迫信号的机制，通过体内的信号传导途径，激发转录因子与相应的顺式作用元件的结合，进而启动特定基因的转录和表达，最后导致植物对胁迫作出反应[1]。
小麦抗赤霉病品种NBS同源序列克隆与分析魏芳;马鸿翔【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)002【摘要】根据二穗短柄草NBS-LRR类基因的保守序列设计同源引物,以小麦抗赤霉病品种苏麦3号、宁7840和望水白基因组DNA为模板,通过PCR扩增,得到43条序列,其中4条为非编码序列或结构域不完整;39条与植物抗病基因同源,其中的7条内部存在终止密码子,可能是假基因,经过比对分析,其余32条具有连续的开放阅读框和保守结构域,推导的氨基酸序列均具有Kinase-1a、Kinase-2和Kinase-3a及GLPL区等几个保守区,在GenBank中均能找到与之高度同源的其他物种的核酸序列,并且Kinase-2的最后一个氨基酸均为色氨酸(W),属于non-TIR 类NBS基因.32条序列可分为4大类,它们之间核苷酸同源性为64％-98％,编码氨基酸同源性为22％-98％.根据序列分析随机设计5对不同基因特异性引物,并利用RT-PCR技术进行表达分析,结果表明,7-1、s-3、s-4和w-2均能表达,说明这些片段可能是功能性抗病基因的部分序列;7-13不表达,再次证明属于假基因.32条序列在之前未被报道过,这些RGA可以作为筛选赤霉病功能性抗病基因的候选序列.【总页数】8页(P128-135)【作者】魏芳;马鸿翔【作者单位】江苏省农业科学院农业生物技术研究所,南京210014;江苏省农业科学院农业生物技术研究所,南京210014【正文语种】中文【相关文献】1.小麦抗赤霉病品种宁7840中抗病基因TaLRG的cDNA克隆和特性分析 [J], 魏芳;马鸿翔2.菠菜NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析 [J], 折红兵;范桂彦;张合龙;王晓武;武剑;钱伟;徐兆生3.烟草(红花大金元)NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析 [J], 魏环宇; 陈小龙; 钟宇; 余磊; 邓小鹏; 童文杰; 蔺忠龙; 莫笑晗; 张丽芳; 何元胜; 郑元仙; 王继明; 许银莲4.番茄NBS-LRR抗根结线虫基因同源序列的克隆与分析 [J], 陆秀红;张雨;秦舒婷;黄金玲;张禹;刘志明5.微毛樱桃NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及进化分析 [J], 刘厚宇;吴敏芳;乔光;文晓鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小麦 TaNADP-ME1基因在大肠杆菌中的融合表达及可溶蛋白纯化付振艳;张正斌;王晓军;徐萍【摘要】NADP-dependent malic enzyme(NADP-ME)is a key enzyme in C4 photosynthesis,the objective is to construct the TaNADP-ME1 gene into prokaryotic expression vector ,express fusion protein in E.coli and purify the fusion protein.The TaNADP-ME1 gene was constructed into expression vector pET 32a by recombination technolo-gy,recombination plasmid was identified by digestion with restriction enzymes and PCR amplification ,and trans-formed into BL21(DE3) pLysS by CaCl 2 method,fusion protein was induced by IPTG and purified by Ni agarose column.This research successfully acquired the recombination vector pETE 1,and TaNADP-ME1 gene was accurately expressed in BL21(DE3)pLysS,SDS-PAGE revealed that the molecular weight of purified fusion protein was about 80 kDa and successfully acquired the fusion protein .This study laid a good foundation for identification the gene function of TaNADP-ME1 gene.% NADP依赖的苹果酸酶（NADP-ME）是C4光合途径关键酶。
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(8): 1392 1402/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01392小麦自噬相关基因ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的ATG10的表达张微1孙鸿1邢莉萍2卫晓静1王华忠1,*1 天津师范大学生命科学学院 / 天津市动植物抗性重点实验室, 天津 300387;2 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏南京 210095摘要: 细胞自噬是一种保守的真核生物细胞内物质分解和循环利用机制, 在植物生长、发育和逆境响应等过程中均扮演了重要角色。
自噬相关蛋白ATG10是参与自噬小体形成的关键因子之一。
利用同源克隆方法, 从经白粉病菌诱导48 h的小麦材料92R137/扬麦1587中克隆了ATG10基因家族3个成员(TaATG10a、TaATG10b和TaATG10c)。
序列特征分析、物种间的比较和进化分析, 以及酵母功能互补实验结果证实, 这3个基因均为酵母ATG10的功能性同源基因。
TaATG10a和TaATG10b的基因组序列具有相似的6外显子-5内含子基因结构。
RT-PCR分析还发现这2个基因都具有2种可变剪接产物。
TaATG10a和TaATG10b的GFP融合蛋白被定位于洋葱表皮细胞的细胞质中。
白粉菌侵染能够诱导TaATG10a和TaATG10b表达, 因此推测, 小麦针对白粉菌侵染的免疫反应涉及对TaATG10及其参与的自噬过程的调控, 其调控模式因小麦抗、感白粉病反应、不同类型抗病基因介导的免疫反应和不同遗传背景下的感病反应而差异明显, 说明TaATG10及其参与的自噬过程与小麦—白粉菌互作反应关系的复杂性。
从外源激素处理诱导的表达情况还发现, 抗、感白粉病的表型差异可能涉及抗、感材料TaATG10基因对同种激素(SA、乙烯或ABA)信号的不同响应模式。
小麦条锈病抗性基因定位及分子标记技术研究进展作者：杨芳萍曹世勤郭莹杜久元鲁清林吕迎春白斌周刚张文涛马瑞何瑞来源：《寒旱农业科学》2024年第01期摘要：条锈病流行对小麦生产造成巨大损失，选育和种植持久抗性品种是防治小麦条锈病最经济有效的策略。
为达到多基因聚合培育持久抗病品种的目标，必须不断发掘抗病种质、解析其抗病遗传机制并开发分子标记。
基于文献，对条锈病抗性基因发掘涉及的抗病性、分子标记、基因定位方法和定位进展及其在育种中的应用进行了综述，明确了小麦条锈病基因定位涉及技术的现状、局限性及优势，从而为后续的条锈病抗性基因发掘、多基因聚合和持久抗性小麦品种的选育与生产布局提供技术指导，以降低西北麦区和小麦主产区条锈病流行的频率，进一步促进国家粮食安全。
关键词：小麦；抗条锈基因；分子标记；连锁和关联分析；测序技术；育种应用中图分类号：S512.1 文献标志码：A 文章编号：2097-2172（2024）01-0001-10doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.01.001Research Progresses on Mapping of Wheat Stripe RustResistance Genesand Molecular MarkersYANG Fangping 1， 2， CAO Shiqin 2， GUO Ying 2， DU Jiuyuan 2， LU Qinglin 2， LV Yingchun 3， BAI Bin 2，ZHOU Gang 2， ZHANG Wentao 2， MA Rui 2， HE Rui 2（1. Institute of Agricultural Economics and Information， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;2. Wheat Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;3. Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu730070， China）Abstract： The epidemics of stripe rust cause significant yield losses in wheat production. Breeding and cultivation of durably resistant varieties are the most cost-effective strategy forcontrolling wheat stripe rust. To achieve the goal of breeding durably resistant varieties through multi-gene pyramiding， it is necessary to continuously explore disease-resistant germplasms， decipher their resistant genetic mechanisms and develop molecular markers. This paper summarized the research progresses of stripe rust resistance， molecular markers， gene mapping methods， and their application in breeding related to the identification of stripe rust resistant genes to further clarify the status， limitations， and advantages of association mapping technologies for mapping of stripe rust resistance genes. This paper aims to provide technical guidance for the subsequent discovery of stripe rust resistance genes， multi-gene pyramiding， and the breeding and production arrangement of durably resistant wheat varieties to reduce the frequency of stripe rust epidemics in the northwestern wheat region and major wheat producing areas to further guarantee national food security.Key words： Wheat; Resistance gene to stripe rust; Molecular marker; Linkage and association analysis; Sequencing technique; Breeding application小麦是世界上分布最广、种植面积最大、总贸易额最多的粮食作物，为人类提供了20%的热量和25%的蛋白质。
pQE-TGF-β1原核表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达孙大铭;侯树勋;张春莉;杜桂鑫;付小兵【期刊名称】《中国矫形外科杂志》【年(卷),期】2003(11)21【摘要】目的 :为了解人的TGF β1基因的功能及生物学活性 ,制备具有生物学活性的TGF β蛋白。
方法 :用基因重组技术构建pQE30 TGF β1原核表达载体 ,并在M1 5大肠杆菌中进行表达 ,利用Ni NTA琼脂柱纯化TGF β1单体 ,通过复性得到双体蛋白 ,利用MTT方法对复性的蛋白进行活性测定。
结果 :经酶切鉴定及测序结果证明 pQE30载体上成功地插入了TGF β1成熟肽基因片段。
pQE30 TGF β1原核表达载体在大肠杆菌中得到了高效表达 ,表达量约占全菌蛋白的 2 0 % ,表达得TGF β1单体蛋白经纯化后进行SDS PAGE电泳显示均得到了一条蛋白带 ,分子量为 1 5KD左右。
MTT测活证明TGF β1单体蛋白经复性后具有良好的活性。
结论:pQE30 TGF β1原核表达载体的构建及重组TGF β1蛋白的制备 ,为深入了解TGF β1的生物学功能奠定了基础。
【总页数】3页(P1490-1492)【关键词】TGF-β1基因;原核表达质粒;大肠杆菌;生物学活性;基因重组;MTT法;融合蛋白;骨损伤修复【作者】孙大铭;侯树勋;张春莉;杜桂鑫;付小兵【作者单位】解放军第304医院全军骨科研究所【正文语种】中文【中图分类】R378.21;R687【相关文献】1.绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达 [J], 霍海龙;赵跃;王锐;侯慧芳;李卫真;张永云;刘丽仙;王配;霍金龙2.构建原核表达质粒pGEX-4T-2-GFP并鉴定其在大肠杆菌中的表达 [J], 陆琤;周晨辰;张鹏飞;张硌3.尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH和fimC基因原核表达质粒的构建及表达[J], 尹晓琳;石新丽;魏林;王秀荣;马翠卿;冯惠东4.大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因人白细胞介素-2在大肠杆菌和卡介苗中的表达 [J], 汪谋岳5.hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 刘智敏;陈俊杰;林佳;王若菡;游乐然;东云华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2021, 47(12): 2371 2378 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.01094病毒介导的GFP-ATG8在小麦上的表达和在自噬活性监测上的应用胡蕊洁杨向芸贾磊李玉如项月岳洁瑜王华忠*天津师范大学生命科学学院 / 天津市动植物抗性重点实验室, 天津 300387摘要: 自噬相关因子ATG8定位于自噬结构的膜上, 荧光蛋白标记的ATG8在过表达细胞内所呈现的点状荧光常用于表征自噬结构和监测自噬活性。
病毒介导的过表达(virus-mediated over-expression, VOX)是一种简便、快速制备目的基因过表达植株的技术。
采用基于狗尾草花叶病毒FoMV的VOX技术(FoMV-VOX)在小麦植株中表达GFP标记的小麦ATG8家族成员TaATG8a, 建立小麦活体植株的自噬活性监测技术平台。
构建了融合基因GFP-TaATG8a的FoMV-VOX载体, 采用Agroinfiltration方法在本氏烟草叶片中表达携带GFP-TaATG8a的FoMV基因组RNA和组装病毒粒子, 将烟草汁液中的病毒粒子摩擦接种于小麦幼苗植株叶片, 对接种植株叶片和根组织中的荧光信号进行观察和特征鉴定。
结果表明, 采用FoMV-VOX技术在小麦植株上不仅可以实现GFP-TaATG8a在接种叶片中的高效表达, 还可以借助病毒的系统侵染实现该融合基因在未接种叶片和根组织中的高效表达。
经饥饿处理激活自噬, 融合蛋白GFP-TaATG8a在植株叶表皮、叶肉以及根细胞中呈现表征自噬结构的点状荧光。
采用FoMV-VOX技术获得的GFP-TaATG8a过表达植株可以应用于小麦多种组织类型中的自噬活性调节机制和生理功能研究。
关键词:小麦; 病毒介导的过表达; ATG8; 细胞自噬Virus-mediated expression of GFP-ATG8 for autophagy monitoring in wheatHU Rui-Jie, YANG Xiang-Yun, JIA Lei, LI Yu-Ru, XIANG Yue, YUE Jie-Yu, and WANG Hua-Zhong*School of Life Sciences, Tianjin Normal University / Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin 300387, ChinaAbstract: ATG8 is an essential autophagy-related factor decorating on the membranes of autophagic structures. Fluorescenceprotein-tagged A TG8 expressed in live cells has been widely used to visualize autophagic structures and to monitor the activity ofautophagy. Virus-mediated over-expression (VOX) is a simple technique for rapid expression of genes of interest in plants. Herethe foxtail mosaic virus (FoMV)-based VOX was adopted for preparation of wheat seedlings over-expressing the GFP-taggedform of the wheat ATG8 family member TaATG8a. An FoMV-VOX vector was constructed for expression of the recombinantFoMV genomic RNA carrying the GFP-TaATG8a sequence. Expression of FoMV genomic RNA and assembly of FoMV virionswere accomplished in Nicotiana benthamiana leaves through agroinfiltration. N. benthamiana leave extract containing FoMVvirions was used to inoculate leaves of wheat seedlings. Fluorescence microscopy of virus-inoculated wheat seedlings showed theefficient expression of GFP-TaATG8a was in not only inoculated leaves but also systemic uninoculated leaves and roots. More-over, punctate fluorescence of GFP-TaATG8a representing autophagic structures was clearly observed in leaf epidermal cells,mesophyll cells, and root cells of wheat seedlings subjected to autophagy-stimulating starvation stress. The autophagy activity inthese cells could be evaluated by quantifying the GFP-TaATG8a-labeled autophagic structures. These results lay a foundation forstudies of the regulating mechanisms and physiological roles of autophagy in various wheat tissues.Keywords: wheat (Triticum aesticum L.); virus-mediated over-expression (VOX); ATG8; autophagy细胞自噬(autophagy, 简称自噬)与植物生长、发育、衰老、细胞死亡和逆境响应等过程密切相关[1-3]。
【 中国农业科学 2014,47(9):1657-1669 Scientia Agricultura Sinicadoi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.09.001小麦重要自噬相关基因 ATG18 的鉴定和表达分析孙鸿，张微，卫晓静，王华忠（天津师范大学生命科学学院/天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）摘要：【目的】克隆小麦重要自噬相关基因ATG18，分析其编码产物的序列特征和高级结构，了解其在生物、 非生物胁迫及激素处理条件下的表达模式，阐明其生物学功能。
【方法】利用EST 拼接和RT-PCR 方法从白粉菌侵 染的小麦叶片中克隆ATG18cDNA 序列，利用生物信息学方法进行基因的外显子-内含子结构分析、编码蛋白的结 构域和保守氨基酸预测、高级结构分析和物种间同源蛋白的进化分析。
采用实时荧光定量PCR 方法研究基因表达 对白粉菌侵染和外源激素处理的响应模式及对高盐、干旱、低温黑暗和缺氮培养等逆境胁迫处理的响应模式。
结 果】获得了4个小麦ATG18家族成员（TaATG18a 、TaATG18b 、TaATG18c 和TaATG18d ）cDNA 。
4个基因高度相似， 均含有1158bp 开放阅读框（ORF ），编码385个氨基酸的蛋白质。
4个基因的编码蛋白在一级结构上均含有典型 的WD-40结构域、磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P ）结合基序和保守的ATG2结合位点氨基酸残基。
4个基因均具有2 种转录后的可变剪接方式，2种剪接产物mRNA 分别编码完整的有功能蛋白和N 端截短导致结构域和功能位点缺失 的无功能蛋白。
TaATG18a 蛋白在高级结构上折叠成与其他WD-40蛋白类似的β-推进器样构象，PI3P 结合基序位 于推进器第五叶片的折叠4和第五、六叶片的连接部分，ATG2结合位点位于连接第二叶片和第三叶片的loop 上。
TaATG18s 能够被白粉菌侵染诱导表达，但具体的诱导表达模式在抗、感白粉病反应之间存在明显差异。
收稿日期：2018-12-18基金项目:天津市自然科学基金（17JCZDJC33800）；天津市高校中青年骨干创新人才培养计划（135305JF78）；天津师范大学中青年教师学术创新推进计划（1353P2XC1604）作者简介:刘彦妮（1993—），女，山西人，在读硕士生，主要从事植物遗传学研究。
通讯作者简介:王华忠（1976—），男，天津人，教授，博士，主要从事遗传学研究。
小麦选择性自噬关键基因NBR1的原核表达刘彦妮，杨文文，王华忠（天津师范大学生命科学学院天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）摘要：自噬参与了动植物的生长、发育、衰老和逆境胁迫响应等过程。
NBR1是选择性自噬的底物受体之一，其识别泛素化的特定蛋白底物并通过与自噬膜上的ATG8互作引导底物进入自噬降解过程。
在前期克隆了两个小麦NBR1基因的基础上，本研究通过常规的分子克隆技术构建了两个基因的原核表达载体并将其转化到大肠杆菌中，利用SDS-PAGE 方法鉴定了两个NBR1基因在大肠杆菌中的表达情况。
结果表明，导入大肠杆菌的两个小麦NBR1均能够被IPTG 诱导表达；表达重组蛋白两端含有His(6)标签，其表观分子量与理论分子量基本一致；重组蛋白在诱导后2h 即表现较高的表达量，并在诱导后4h 达到最高的表达量。
研究结果为后续小麦NBR1蛋白的纯化、抗体的制备以及该蛋白的互作性质、表达特征等功能研究工作奠定了基础。
关键词：选择性自噬；小麦；NBR1基因；原核表达中图分类号:S512.1文献标识码:A DOI 编码:10.3969/j.issn.1006－6500.2019.04.001Prokaryotic Expression of The Wheat Key Selective Autophagy Gene NBR1LIU Yanni,YANG Wenwen,WANG Huazhong(Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,School of Life Sciences,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China)Abstract :Autophagy plays an important role in the growth,development,aging and stress responses of plants and animals.NBR1functions in selective autophagy as a substrate receptor,which recognizes specific ubiquitinated proteins and presents them to the au ⁃tophagic degradation process through its interaction with ATG8on autophagic membranes.Previously,two wheat NBR1genes were cloned in Tianjin key laboratory of animal and plant resistance.In this study,prokaryotic expression vectors for the two wheat NBR1s were constructed and transformed into E.coli .Results from SDS-PAGE showed that wheat NBR1s could express efficiently in E.coli through IPTG induction.The expressed recombinant proteins had N-and C-terminal His (6)tags,and their molecular weights were consistent with the predicted values.High levels of recombinant proteins were detected at as early as 2h after IPTG induction,and the highest levels were reached at 4h after IPTG induction.These results laid a foundation for the preparation of recombinant wheat NBR1proteins and their antibodies for use in assays on the interaction and expression features of wheat NBR1s.Key words :selective autophagy;wheat (Triticum aestivum L.);NBR1gene;prokaryotic expression天津农业科学Tianjin Agricultural Sciences 圆园19,25(4):1-4自噬（autophagy ）是一种保守的真核生物细胞内物质降解过程。
在自噬过程中，细胞质物质被双层膜结构的自噬小体包裹，随后经自噬小体外膜与液泡或溶酶体膜的融合过程以内膜包裹的形式（此时称为自噬小泡）进入液泡或溶酶体腔中进行降解，降解产生的小分子可以作为营养物质重新利用[1]。
自噬过程的执行依赖于多种自噬相关因子ATG （AuTophaGy-related factor ）的参与[1]。
ATG8蛋白定位于自噬膜表面，在自噬小体的组装及其与溶酶体/液泡膜的融合过程中发挥重要作用[2-4]。
自噬分为批量自噬和底物特异性的选择性自噬，ATG8在选择性自噬的底物捕获过程中也发挥了重要作用[1]。
自噬膜表面的ATG8通过直接与特异性底物互作或与其受体互作的方式将底物捕获到自噬小体中[5]。
NBR1（Neighbor of BRCA1gene 1）是目前鉴定到的重要选择性自噬底物受体/ATG8互作蛋白之一。
NBR1含有泛素结合结构域和ATG8互作结构域，其一方面识别并结合泛素化蛋白，另一方面通过与ATG8的互作将其识别的底物引导进入自噬小体[6]。
动物上有关NBR1研究的报道较多，发现其参与了蛋白质聚集体自噬[6]和过氧化物酶体自噬[7]过程的底物识别。
植物NBR1先后在拟南芥[8]和烟草（称为Joka2）[9]上得到鉴定，证实了其与ATG8和泛素化蛋白质底物的互作，参与了胁迫条件下泛素化蛋白质聚集体和入侵病毒相关蛋白的选择性自噬过程[9-13]。
到目前为止，重要农作物小麦上还未见有关选择性•植物生理与生物技术天津农业科学第25卷自噬和NBR1研究的报道。
本研究在前期克隆了小麦两个NBR1基因TaNBR1-1和TaNBR1-2的基础上，构建了两个基因的原核表达载体，实现了两个基因编码蛋白在大肠杆菌中的诱导表达，为后续小麦NBR1蛋白的纯化、抗体的制备和该蛋白的互作性质、表达特征等功能研究工作奠定了基础。
1材料和方法1.1基因、载体及试剂克隆于质粒载体上的两个小麦NBR1基因TaNBR1-1和TaNBR1-2（均为全长cDNA）和原核表达载体pET30a由天津市动植物抗性重点实验室保存。
实验用高保真DNA聚合酶primeSTAR、普通Taq酶、限制性内切酶（Eco RⅠ、Bam HⅠ和XhoⅠ）以及大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）菌株感受态细胞均为TakaRa公司产品；快速连接试剂盒（LigaFast）购自Promega公司；引物合成委托北京六合华大基因科技有限公司完成；其他试剂均为国产分析纯。
1.2原核表达载体的构建设计合成用于扩增TaNBR1-1基因完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的引物对NBR1-F （GCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGTCCGGCCTGA GCGCG）/NBR1-R(GTG GTGGTGGTGGTGCTCGAG CTTGTCCTTCTTCTCCCTGGC)和扩增TaNBR1-2基因完整ORF的引物对NBR2-F（GCCATGGCTGATA TCGGATCCATGATGCCTCAACGGGACAC）/NBR2-R (GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCATCAGTTCCTTCA GCTCCGC)，扩增片段两端能够带上Eco RⅠ和Xho Ⅰ酶切位点（TaNBR1-1）或Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点（TaNBR1-2）。
使用引物对和高保真DNA聚合酶primeSTAR，分别以克隆有两个TaNBR1基因的质粒为模板进行PCR扩增。
对扩增片段进行Eco R Ⅰ/XhoⅠ或Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切，对载体pET30a 质粒进行相应的双酶切。
使用快速连接试剂盒（LigaFast）连接片段和载体。
连接产物转化大肠杆菌DH5α后，使用菌落PCR和酶切方法鉴定重组克隆即目标基因的表达载体。
鉴定到的表达载体经测序进行进一步确认。
采用热激法将表达载体导入到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中。
1.3原核表达接种含有表达载体质粒的大肠杆菌BL21（DE3）到2mL含50mg·L-1卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
按1%的比例扩大到10mL相同的液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期（3h左右）。
加入终浓度为0.5mmol L-1的IPTG，于28℃条件下震荡培养诱导目标基因的表达。
分别于诱导后0，2，4，6，8h取1mL菌液用于总蛋白的SDS-PAGE电泳分析。
1.4SDS-PAGE电泳将收集的1mL菌液于10000rpm条件下离心10min，倒掉上清，用80μL的ddH2O重悬沉淀，再加入20μL的5倍上样缓冲液并混匀，沸水浴10min 裂解细胞变性蛋白。
将裂解液于12000rpm条件下离心5min，取20μL上清进行SDS-PAGE电泳（12%分离胶，4%浓缩胶）。
电泳后用考马斯亮蓝R-250染色液染色1h，脱色液脱色至背景无色后观察并拍照。
2结果与分析2.1两个小麦NBR1基因原核表达载体的构建TaNBR1-1基因原核表达载体的构建流程如图1A所示，设计合成5’端分别添加了Eco RⅠ和Xho Ⅰ位点的正、反向引物，使用该引物对并以克隆有TaNBR1-1全长cDNA的质粒为模板进行PCR扩增获得两端添加了相应酶切位点的TaNBR1-1基因ORF片段，对ORF片段和pET30a载体进行Eco R Ⅰ/XhoⅠ双酶切和连接，连接产物转化大肠杆菌后通过菌落PCR方法初步鉴定重组克隆。
