等电聚焦电泳

在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间 形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶 液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。 利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的 解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度 约50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且 不易稳定。
如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由 低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度， 则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI 值与所处位点的PH值的差别带上正电或负电。
IEF的分类


载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient) 等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是 利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时， 在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合， 形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率 可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度 凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等 电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的 区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯 度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等 电点而形成pH梯度。


加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、 甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改 变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的 pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖， 可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在 电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多 胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可 以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方 法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。

0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。

本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。

方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。

1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。

2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。

(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。

(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。

(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。

蛋白质分子的电聚焦过程
+
+
pH=pI
-
—
a
b
pI1 pI2 pI3
pIn
c
a. 蛋白质分子在负极端 b. 蛋白质分子在正极端
c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
在这个从正极到负极pH逐渐增加的 直流电场中，当蛋白质进入这个环境， 不同的蛋白质带上不同性质和数量的电 荷，向着一定方向移动，迁移到与其相 同的等电点位置上停留下来，即被聚焦 于一个狭的区带中 ，得以分离。
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复 性良好的pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分 离的样品不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区 带
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：
1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；
2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率
降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。 3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同
分子的两性电解质的混合物所组成的， 设 其 中 某 一 成 分 为 A， 它 的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。(图b)
pH
ApH=pH’
+
-
b

等点聚焦电泳等点聚焦电泳（Isoelectric Focusing，IEF）是一种高效的分离和分析生物大分子的方法。

它基于生物大分子在不同pH值下的等电点电荷，利用电场将这些分子分离出来。

IEF广泛应用于蛋白质、核酸和糖类等生物大分子的分离和纯化，被认为是生物技术领域的重要工具之一。

等点聚焦电泳的原理是基于生物大分子在不同pH值下的等电点电荷。

等电点是指溶液中某一物质的净电荷为零的pH值。

当生物大分子处于其等电点时，它们不会在电场的作用下发生移动。

因此，通过在凝胶上建立一系列pH梯度，可以将生物大分子分离出来。

等点聚焦电泳的步骤如下：1. 准备凝胶：通常使用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质。

凝胶的pH 值应根据样品的特性进行调整。

2. 加载样品：将待分离的生物大分子样品加载到凝胶上。

可以通过两端的电极施加电场来促使样品进入凝胶。

3. 施加电场：在凝胶两端施加电场，使生物大分子在凝胶中移动。

由于凝胶上的pH梯度，生物大分子会在等电点处停止移动。

4. 分析结果：根据生物大分子在凝胶中的迁移距离，可以得到它们的等电点值。

通过染色或其他检测方法，可以可视化和分析分离的生物大分子。

等点聚焦电泳的优点是可以分离和纯化复杂混合物中的生物大分子。

与其他传统的电泳方法相比，IEF具有更高的分辨率和更好的分离效果。

此外，它还可以用于研究生物大分子的异质性和修饰模式。

等点聚焦电泳在生物技术研究和应用中有着广泛的应用。

例如，在蛋白质组学研究中，可以使用IEF分离和鉴定复杂蛋白质混合物中的不同蛋白质。

在基因组学研究中，可以利用IEF分析和鉴定不同等电点的核酸片段。

此外，等点聚焦电泳还可以用于糖类分析和糖蛋白的研究。

尽管等点聚焦电泳在生物技术研究中有着广泛的应用，但它也存在一些限制。

首先，准备和运行等点聚焦电泳的条件需要一定的技术和经验。

其次，由于样品的复杂性和凝胶的限制，等点聚焦电泳可能无法分离所有的生物大分子。

此外，等点聚焦电泳的操作时间较长，需要几个小时甚至几天才能完成。