2010版药典细菌、霉菌下的薄膜过滤法

微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。

验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。

原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。

2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。

试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。

验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。

试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。

3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。

3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。

环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。

操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。

3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。

3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。

3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。

医疗器械灭菌方法、灭菌工艺验证及无菌检查程玲;徐玉茵;高勇;周静;张娟丽【摘要】文章阐述了湿热灭菌、干热灭菌、环氧乙烷灭菌、辐射灭菌、低温等离子体灭菌等5种医疗器械灭菌方法,并介绍了灭菌工艺验证和无菌检查方面的内容.%This paper describes five sterilization methods for medical devices, such as moist heat sterilization, dry heat sterilization, EO sterilization, radiation sterilization, low-temperature plasmas sterilization etc. The method of validation of sterilization process and sterility testing are introduced.【期刊名称】《价值工程》【年(卷),期】2011(030)029【总页数】2页(P272-273)【关键词】灭菌;医疗器械;验证;无菌检查【作者】程玲;徐玉茵;高勇;周静;张娟丽【作者单位】河南省医疗器械检验所,郑州450003;河南省医疗器械检验所,郑州450003;河南省医疗器械检验所,郑州450003;河南省医疗器械检验所,郑州450003;河南省医疗器械检验所,郑州450003【正文语种】中文【中图分类】R20 引言灭菌是用适当的物理或化学手段杀灭产品中一切活的微生物的方法；而消毒是杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。

无菌是指产品中不含任何活的微生物（包括细菌、真菌、病毒及芽孢）。

然而，对于任何一批灭菌产品来说，绝对无菌是无法保证。

已灭菌产品的无菌标准一般以物品灭菌后微生物存活的概率-无菌保证水平SAL（Sterility Assurance Level）表示。

最终灭菌产品微生物存活的概率不得高于10-6（即100万件产品灭菌之后，只能允许有1件或以下可能有活的微生物存在），已灭菌产品的无菌保证状况可以通过验证实验证明[2]。

附录Ⅺ J 微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。

检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。

除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。

检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。

检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。

除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。

要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。

一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。

供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。

供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。

1.液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。

油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。

水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。

微生物限度检查法应用指导原则为更好应用微生物限度检查法（附录ⅪJ），特制定本指导原则。

微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。

本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。

1.微生物限度检查过程中，如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。

2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法，且应避免损伤供试品中污染的微生物。

对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。

3. 微生物限度检查法（附录ⅪJ）收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌（细菌）检查用的供试液，规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。

采用该方法时，供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小，转速等直接影响着样品中微生物的回收， 易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。

因此，供试液制备时尽量避免使用该方法，更不宜采用高速离心沉降集菌。

4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查。

由中国药品生物制品检定所研制及分发。

5. 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。

此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1：10-3。

微生物限度检查标准操作规程⏹ 1. 目的：建立微生物限度检查的基本操作，为微生物检查人员提供正确的操作规程。

⏹ 2. 依据：《中华人民共和国药典》2010年版二部。

中华人民共和国卫生部《药品卫生检验方法》⏹ 3. 范围：本标准适用于QC化验室的微生物限度检查。

⏹ 4. 职责：QC微生物检验员对本标准的实施负责。

⏹ 5. 程序：⏹ 5.1. 定义：微生物限度检查法：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。

⏹ 5.2. 实验用具：⏹电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。

⏹ 5.3. 培养基：⏹ 5.3.1. 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、麦康凯琼脂培养基、枸橼酸盐培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、蛋白胨水培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸（MUG）培养基。

⏹ 5.3.2. 培养基的管理、配置应符合检定菌、培养基管理规程、培养基配置规程。

⏹ 5.4. 试液：甲基红试液、а-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。

⏹ 5.5. 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液、PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

⏹ 5.6. 供试品溶液的制备：取供试品（供试品如为固体，置研钵中研磨成细粉）放入试管中，加入适量的稀释剂制成1：10浓度的供试品溶液。

⏹ 5.7. 对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，对照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）44102]。

⏹ 5.8. 检查法：⏹除另有规定外，细菌的培养温度为30-35℃，霉菌的培养温度为23-28℃，控制菌的培养温度为35-37℃。

⏹ 5.8.1. 细菌、霉菌计数：⏹ 5.8.1.1. 平皿法⏹采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。

⏹取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

无菌检查SOP（薄膜过滤法）1.目的为规范无菌检查方法及无菌检查全过程的操作，最大限度防止试验操作过程造成的污染，确保结果准确。

2.范围本SOP适用于生物制品的中间产品（包括原液、纯化产物、半成品、生产中的液体、辅料等）、成品的无菌检查。

只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。

3.定义无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

4.职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行；4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核；4.3.质量总监负责批准本规程；4.4.QA负责本规程执行的监督。

5.引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部6.材料6.1.无菌检查用物品、物料要求：所有物品、物料进入无菌室前，均应经过高压蒸汽灭菌（121℃40分钟，放灭菌指示卡）或180℃干烤2小时或其它经过验证的方法消毒后传入无菌室；如不能用前者消毒方式消毒的物品，须经消毒液浸泡、擦拭后传入无菌室。

6.2.无菌检查环境要求：应在环境洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

6.3.仪器、设备与设施集菌仪、显微镜、台式灭菌器、无菌试验室（万级）、超净工作台（万级背景下的局部百级）：每月环境检测（沉降菌、浮游菌、尘埃粒子）合格后，方可使用。

20-25℃培养房或培养箱、30-35℃培养房或培养箱。

6.4.试验用具：洁净工作服（洁净底服、十万级工作服、万级工作服、鞋套）、工作鞋、口罩及帽子；无菌医用手套或一次性乳胶医用手套：试验前及试验过程中用消毒液浸泡消毒；封闭式集菌培养器（双针头、三联及单针头、三联）：薄膜孔径不大于0.45μm，直径约为 50mm。

根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。

微生物实验室检测设备配置方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。

3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。

4.验证实施：4.1.1试验前的准备：4.1.1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃,灭菌30 min,在3天内使用。

4.1.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制微生物实验室检测设备配置方案说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃, 灭菌15 min，在3周内使用。

4.1.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。

薄膜过滤法微生物限度检查操作要点1. 设备、仪器1.1 无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。

1.1.1 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。

环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。

操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pa。

操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。

1.1.2 缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。

缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。

1.1.3 在每次操作前、后，用75%乙醇溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。

然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。

1.1.4 无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～350C预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min 后将盖盖上。

在30～350C培养箱内倒置培养48h，取出检查。

3个平板生长的平均菌落数不超过1个。

1.2 仪器1.2.1 恒温培养箱（30～350C）、生化培养箱（23～280C）、电冰箱、蒸汽灭菌器。

1.2.2 玻璃器皿烧杯、培养皿、量筒、试管及塞、吸管。

玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。

玻璃器皿均应用牛皮纸（或双层报纸）严密包裹置蒸汽灭菌器高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干。

或于160℃干热灭菌2h，备用。

2培养基及其制备方法2.1 营养琼脂培养基：取营养琼脂培养基34g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。

2.2 玫瑰红钠琼脂培养基：取玫瑰红钠琼脂培养基30.5g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。

2.3 胆盐乳糖培养基：取胆盐乳糖培养基36g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。

2010版《中国药典》纯化水标准及检验项目2013-07-22 19:36作者: 水处理之家网来源: 本站浏览: 8,054 views我要评论字号: 大中小注：总有机碳和易氧化物两项可选做一项。

一、纯化水（Purified Water ）纯化水H2O 18.02本品为饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。

二、2010年版药典检验项目1.性状本品为无色的澄清液体；无臭，无味。

取本品10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色；另取10ml，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，不得显蓝色。

3.硝酸盐取本品5ml置试管中，于冰浴中冷却，加10%氯化钾溶液0.4ml与0.1%二苯胺硫酸溶液0.1ml，摇匀，缓缓滴加硫酸5ml，摇匀，将试管于50℃水浴中放置15分钟，溶液产生的蓝色与标准硝酸盐溶液[取硝酸钾0.163g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，再精密量取10ml，加水稀释成100ml，摇匀，即得(每1ml相当于1μgNO3)]0.3ml，加无硝酸盐的水4.7ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深(0.000 006%)。

4.亚硝酸盐取本品10ml，置纳氏管中，加对氨基苯磺酰胺的稀盐酸溶液(1→100)1ml及盐酸萘乙二胺溶液(0.1→100)1ml，产生的粉红色，与标准亚硝酸盐溶液[取亚硝酸钠0.750g(按干燥品计算)，加水溶解，稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，摇匀，再精密量取1ml，加水稀释成50ml，摇匀，即得(每1ml相当于1μgNO2))0.2ml，加无亚硝酸盐的水9.8ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（.0000 02%)。

5.氨取本品50ml，加碱性碘化汞钾试液2ml，放置15分钟；如显色，与氯化铵溶液(取氯化铵31.5mg，加无氨水适量使溶解并稀释成1000ml)1.5ml，加无氨水48ml与碱性碘化汞钾试液2ml制成的对照液比较，不得更深(0.000 03%)。