实验4-氨基酸类物质的荧光光谱分析

氨基酸类物质的荧光光谱分析【摘要】荧光物质吸收特定频率辐射能量后会产生荧光，不同荧光物质的最大吸收波长、最大激发波长以及荧光谱图不同，以此可以鉴定未知物质。

荧光还与物质浓度在一定范围内有线性关系，可以通过测定未知浓度的已知物荧光吸收强度来测定浓度。

【实验目的】1、熟悉荧光分析法的基本原理；2、了解RF–5301 型荧光分光光度计的构造、原理，掌握荧光分析法的基本操作；3、掌握荧光分析技术应用于定量分析的原理及方法。

【基本原理】原理概述：利用荧光物质分子在吸收特定频率辐射能量后，由基态跃迁至激发态的任一振动能级，在溶液中以热的形式损失部分能量后回到第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。

荧光的产生：荧光物质分子在吸收特定频率辐射能量后，由基态跃迁至第一电子激发态（或更高激发态）的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。

然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。

能产生强荧光的物质分子，一般都具有大的共轭π 键结构或具有刚性平面结构等特征。

发射光谱与吸收光谱：荧光分析法的特点：优点：灵敏度高、选择性好、工作曲线线性范围宽，能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量 子产率、荧光偏振等诸多信息；缺点：由于能够产生强荧光的物质相对较少，荧光分析法的应用不太广泛；改进：对于没有强荧光或没有荧光的物质的测定可设计相应的反应使其生成具有荧光特性的配合物进行测定。

氨基酸：含有氨基和羧基的一类有机化合物，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。

色氨酸（Try）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有能发射荧光的组分，可以用荧光法测定。

【仪器与试剂】1、仪器：F-4600 型荧光分光光度计，10 mL 带玻璃塞的比色管10 只，移液管图1荧光光谱仪结构示意图2、试剂：标准溶液a：4×10-4mg/mL的酪氨酸溶液；标准溶液b：1×10-3mg/mL的苯丙氨酸溶液；标准溶液c：1×10-3mg/mL的色氨酸溶液；色氨酸待测样；去离子水。

【实验步骤】1、配制实验样品：（1）分别移取标准溶液a、标准溶液b 和色氨酸待测样于10 mL 比色管中，待用。

（2）分别移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL标准溶液c于7个10 mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。

2、仪器操作：（1）打开计算机和分光光度计主机，双击分光光度计图标“FL-Solutions”,等系统自检结束。

预热15-30分钟待仪器稳定后方可使用。

（2）选择光谱测量界面（“Method”—“General”—“Measurement”—“Wavelength scan”），绘制上述步骤（1）中各溶液的激发光谱和发射光谱，并确定各自的λEmmax和λExmax。

（3）选择定量测定界面（“Method”--“General”--“Measurement”--“photometry”），依据上述步骤中测得的酪氨酸的λEmmax 和λExmax ，设定定量测定的参数，测定系列标准溶液的荧光强度Is 值，然后在相同条件下测量未知样的相对荧光强度I x ，并记录实验数据。

【数据处理与实验结果分析】1、 色氨酸的荧光分析：调整狭缝宽度至最佳值：d ex =5.0nm ，d em =5.0nm 。

首先预扫。

取 λEm =350nm图2 色氨酸激发光谱选择最大强度对应的波长约 220nm 处，得到色氨酸的发射光谱：050010001500200025003000荧光强度波长 (nm)5001000150020002500荧光强度波长 (nm)图3 色氨酸发射光谱由色氨酸的发射光谱可以看到，色氨酸的最大发射波长在348nm 左右。

2、 酪氨酸的荧光分析：取 λEm =301nm图4 酪氨酸激发光谱选择最大强度对应的波长约 225nm 处，得到酪氨酸的发射光谱：图5 酪氨酸发射光谱由酪氨酸的发射光谱可以看到，酪氨酸的最大发射波长在303nm 左右。

1000200030004000500060007000荧光强度波长 (nm)240260280300320340360380400420-100001000200030004000500060007000荧光强度波长 (nm)3、 苯丙氨酸的荧光分析：取 λEm =383nm ，得到激发光谱如图 4：图6 苯丙氨酸激发光谱选择最大强度对应的波长约 208nm 处，得到苯丙氨酸的发射光谱：图7 苯丙氨酸发射光谱由苯丙氨酸的发射光谱可以看到，苯丙氨酸的最大发射波长在283nm 左右。

5001000150020002500荧光强度波长 (nm)24026028030032034036005001000150020002500荧光强度波长 (nm)4、 将测得的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的激发光谱叠加在一个坐标系中：图8 三种氨基酸的激发光谱从图 8可知，苯丙氨酸的最大激发波长在 210nm 左右，另外在 257nm 处也有峰值；酪氨酸的最大激发波长在 225nm 左右，另外在 275nm 处也有峰值；色氨酸的最大激发波长在 221nm 左右，另外在 275nm 处也有峰值。

酪氨酸和色氨酸的最大激发波长比较接近。

图9 三种氨基酸的发射光谱从图 9 可知，苯丙氨酸的最大发射波长在 283nm 左右，色氨酸的最大发射波长在348nm 左右，酪氨酸的最大发射波长在 303nm 左右。

01000200030004000500060007000荧光强度波长 (nm)-10001000200030004000500060007000荧光强度波长 (nm)下面从理论分析不同氨基酸具有不同最大激发、发射波长的原因： 如图为三种氨基酸的结构：图 10 三种氨基酸的结构根据测得的荧光数据：最大发射波长 λEmmax ：苯丙氨酸 < 酪氨酸 < 色氨酸，最大激发波长 λExmax ：苯丙氨酸 < 酪氨酸≈色氨酸。

三种氨基酸均具有苯环、吲哚环等大的不饱和基团，其中具有吲哚基团的色氨酸的不饱和键数量及其面积最大，故发生红移，具有最大发射波长和最大激发波长，大于苯丙氨酸和酪氨酸的波长；而酪氨酸中的羟基存在给电子共轭效应，其相对苯丙氨酸发生了红移，最大激发波长和最大发射波长大于苯丙氨酸。

从共轭角度看，体系的共轭度增强，荧光效率一般也增大。

这是由于增大了荧光物质的摩尔吸光系数，π 电子更容易被激发，产生了更多的激发态分子，使荧光增强。

由于不同氨基酸溶液的浓度以及使用的激发电压不同，荧光强度不好直接比较。

5、 色氨酸未知溶液的定量测量：选择对应激发波长 220nm 和发射波长 350nm ，狭缝宽度与实验步骤 1 的相同：d ex =5.0nm ，d em =5.0nm 。

根据系列标准酪氨酸溶液的荧光强度 Is 及浓度 c,绘制 Is –c 工作曲线，如图 10：5001000150020002500荧光强度浓度 (×10^-4 mg/ml)荧光强度Linear Fit of Sheet1 B"荧光强度"Equation y = a + b*x Plot 荧光强度Weight No Weighting Intercept 96.62357 ?37.87238Slope408.09786 ?10.50391Residual Sum of Squares 15446.49221Pearson's r0.99835R-Square(COD)0.9967Adj. R-Square 0.99604图11 色氨酸Is–c 工作曲线由线性拟合得出线性方程强度Is = 408.9786 c + 96.62357，相关度R2=0.99604，拟合效果较好，测量未知色氨酸溶液的荧光强度Ix=1137，代入线性方程，得到其浓度为2.544×10-4mg·mL-1。

【思考题】1、本实验中定量测定的条件参数是如何选择的，为什么？答：定量测定的条件参数有：激发波长，发射波长，狭缝宽度d ex，d em；通过预扫以及激发光谱和发射光谱的荧光测试，确定了这些参数。

其中狭缝宽度与前面定性测量寻找最大激发波长和发射波长所使用的宽度一致，选择的激发波长为最大激发波长，选择的发射波长为最大发射波长（近似为整数值）。

2、影响荧光特性的因素有哪些？请列举说明。

答：（1）具有至少一个芳环或多个共轭双键的物质一般具有荧光，具有刚性结构的共轭体系的荧光更强；（2）取代基的性质：芳环上的取代基会引起荧光峰的改变，给电子基（-OH、-NH2）会使荧光增强，最大吸收波长红移；吸电子基（-NO2、-Cl）会使荧光减弱，使最大吸收波长蓝移甚至荧光消失；（3）大部分无机盐金属离子不产生荧光，而金属螯合物常具有很强的荧光；（4）溶剂的性质：例如有机物和金属的有机络合物，在乙醇溶液中的荧光比在水中强；（5）温度：溶液温度下降时，介质的粘度变大，荧光物质与分子碰撞减小，荧光增强；温度升高，荧光减弱；（6）pH：例如酚羟基、氨基等，在不同酸碱性下会有不同的存在形式：酚羟基在碱性条件下变为-O-，给电子能力加强，使最大吸收波长红移；-NH2在酸性条件下变为-NH3+，从给电子基团变为吸电子基团，使最大吸收波长蓝移、荧光减弱甚至消失；3、根据常规的荧光法能够实现混合物中这三种氨基酸的分别测定吗？若能，请说明原因；若不能，请提出可行的测定方案。

答：不能，因为这三种氨基酸的最大发射波长有一定交集，相互重叠，即荧光测量时产生的峰会相互影响；可能的方案：通过同步荧光法，即在混合溶液中加入缓冲液（pH为7.4左右）、稀释后，选择一定的△λ（一般在55nm左右），通过等波长差同步扫描的方法得到荧光光谱，再将光谱进行一阶导数处理，可得到三种氨基酸的最大吸收波长。

【讨论与体会】荧光分析实验是表征含不饱和键化合物常用的分析手段之一，实验原理较简单，操作也较轻松，通过荧光分析法定性、定量分析了三种含苯环氨基酸的最大激发波长、最大发射波长，并确定了未知色氨酸溶液的浓度。

下面是本实验的一些经验教训与体会：（1）测试前应该进行充分的预习，要清楚实验下一步要做什么；（2）从预扫描可以得到激发和发射波长的初步结果，利用我们得到的初步结果对参数进行设置，然后再测量它们的荧光激发、发射荧光光谱；（3）要注意谱图中在固定的波长附近会有瑞利散射峰，只要改变固定的波长瑞利散射峰也会改变，不要与荧光的吸收峰弄混（4）比色皿要清洗干净，保证对氨基酸溶液荧光光谱测定的准确性；（5）本实验在使用移液管移取氨基酸溶液的过程中，锻炼了我们认真耐心、一丝不苟的态度，回顾了基础分析化学的相关实验操作；在处理数据和作图的过程中，提高了我们处理数据和定量分析的能力。