【专题讨论】超详细包涵体复性常见问题分析
包涵体复性常见问题分析1. 对于尿素和盐酸胍该怎么选择?
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
2. 怎样洗涤包涵体？
通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接
洗脱效果好。
3. 8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?
在4度放置半个月，都没什么问题。在室温放置超过48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理BI溶液比较好。
4. 包涵体复性有什么原则？
低浓度，平缓梯度，低温。
5. 复性时的蛋白浓度是？
一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。
6. 复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？
出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。
若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；
另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样
品中也可加适量甘油。包涵体复性效率和检测复性是一个
非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，
如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。其效果检测方法如下：
1. 凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2. 光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3. 色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4. 生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5. 黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时
由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6. 免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构
决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。包涵体复性的方法一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
1. 透析、稀释和超滤复性法：
这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复
性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性
凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。复性过程始终发生在溶液中。蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒
内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。此法为蛋白质复性提供了一个较温和的环境，实现了线性去除变性剂，对高浓度变性蛋白质的复性效果十分显著。对初始浓度为17mg／ml的还原变性溶菌酶，在40min内可以得到高达9O%的活性回收率。此外在脲梯度SEC的基础上发展了pH和脲浓度双梯度SEC法用于蛋白复性，效果很好。
在SEC复性的基础上设计的连续基质辅助蛋白复性系统能使变性蛋白定量地转换成复性的天然态蛋白。此复性方法能够将复性过程中产生的蛋白聚集体再次复性，使蛋白最大程度地得到回收。伴侣溶剂塞(Chaperon solvent
plug)SEC复性法在一定程度上解决了变性蛋白进入柱顶端之前发生沉淀这一问题。此外，抗体、小分子添加剂如L一精氨酸和环糊精等共价结合到SEC固定相上也可能会提高某些蛋白的复性效率，同时又能使这些物质得以重复利用，降低生产成本。
3. 高蛋白浓度下的复性方法：
一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得
到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。
4. 添加促进剂的复性方法：
包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：
a) 共溶剂：如PEG6000~20000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；
b) 去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；
c) 氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加
入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG 等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率；
d) 小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg 能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键
变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。
e) 添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质。折叠酶有二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等。分子伴侣和折叠酶都能在体外调节蛋白质的正确
折叠，提高蛋白质的合成效率。但这类蛋白在折叠复性后要除去，而且十分昂贵，因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。
f) 人工伴侣：为模仿分子伴侣而发展的一种方法：首先，变性蛋白被复性液中的去污剂捕获，形成蛋白-去污剂复合体，复合体的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入环糊精从复合体中去除去污剂，使得蛋白质正确折叠。
g) 单克隆抗体：待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限于此蛋白才能获得明显的助折叠作用。
h) 其它：多聚离子化合物如肝素可以促进蛋白质的复性，具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会，减少错配以提高复性效率；适量的盐浓度可以降低某些带电基团间的斥力，有利于蛋白质的折叠；辅助因子、短链醇、高渗物等能有效的降低聚集体的形成，对蛋白有稳定的作用。
5. 液相色谱（LC）复性法：
液相色谱是一种最有效的纯化蛋白质的方法，已成为基因
重组蛋白质纯化的必不可少的手段，现有报道，疏水相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱（IEC）、凝胶排阻色谱（SEC）、亲和色谱（AFC）已成功的对变性蛋白进行了复性。与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：
a) 在进样后可很快的除去变性剂；
b) 由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；包涵体形成原因及减少策略形成原因
1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
3. 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4. 重组蛋白是大肠杆菌(Escherichia coli)的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
5. 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。
减少包涵体形成的策略
1. 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。
2. 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养
E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质
的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。
3. 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。包涵体复性原理包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达时，形成的由膜
包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素
有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。
个股期权业务常见问题解答 个人投资者参与条件： 1.股票账户资产不低于人民币50万元； 2.指定交易在我司6个月以上，并已开通融资融券业务或金融期货交易经历；或者在期货公司开户6个月以上并具有金融期货交易经历； 3.具有上海交易所认可的期权模拟交易经历; 4.通过上海交易所个股期权知识考试（全程录像闭卷考试）基本概念： 1.什么是个股期权？ 期权是交易双方关于未来买卖权利达成的合约。就个股期权来说，期权的买方（权利方）通过向卖方（义务方）支付一定的费用（权利金），获得一种权利，即有权在约定的时间以约定的价格向期权卖方买入或卖出约定数量的特定股票或ETF。当然，买方（权利方）也可以选择放弃行使权利。如果买方决定行使权利，卖方就有义务配合。2.个股期权包括哪些基本要素？ (1)、合约类型：分为认购期权和认沽期权两种。 (2)、合约标的：个股期权合约标的为在交易所上市挂牌交易的单只股票或ETF。 (3)、合约到期日：是合约有效期截止的日期，也是期权买方
可行使权利的最后日期。合约到期后自动失效，期权买方不再享有权利，期权卖方不再承担义务。 (4)、行权价：行权价也称执行价或履约价，是个股期权买方买进或卖出合约标的的价格。 (5)、合约单位：是一张个股期权合约对应的合约标的数量。一张个股期权合约的交易金额＝权利金×合约单位 (6)、行权价格间距：是相邻两个个股期权行权价格的差值，一般为事先设定。 (7)、交割方式：分为实物交割和现金交割两种。 实物交割是指在期权合约到期后，认购期权的权利方支付现金买入标的资产，认购期权的义务方收入现金卖出标的资产，或认沽期权的权利方卖出标的资产收入现金，认沽期权的义务方买入标的资产并支付现金。 现金交割是指期权买卖双方按照结算价格以现金的形式支 付价差，不涉及标的资产的转让。 3.个股期权有哪些类型？ 按照不同标准，个股期权分为很多种，下面为大家介绍以下几种分类。 (1)、按期权买方的权利划分，分为认购期权和认沽期权 认购期权是指期权的买方（权利方）有权在约定时间以约定价格从卖方（义务方）手中买进一定数量的标的资产，买方享有的是买入选择权。
包涵体的形成以及处理方法 1 包涵体形成的原因 (1)表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体L2]。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。(2)重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成]。(3)重组蛋白分泌序列的存在阻碍折叠，导致错误折叠分子的产生。(4)重组蛋白的氨基酸组成，一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。(5)包涵体形成动力学研究表明，包涵体是由部分变性的中阃体聚合而成。因此，任何影响中间体稳定的因素，如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚合反应。(6)在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。(7)有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体? 。 包涵体的处理 包涵体的形成具有有利的一面，也有不利的一面。有利的一面是包涵体的形成去除了几乎全部的细胞内可溶性蛋白质。同时，因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物的降解而大大提高产率，通常其表达量可占菌体总蛋白的10％～30％，甚至高达50％。不利的一面是溶解包涵体进行复性折叠的过程中需要加变性剂和去垢剂，而引起蛋白质的不可逆修饰以及性质改变，这些试剂价格昂贵，且复性的操作过程不好控制；另一方面复性过程常伴有蛋白质水解和沉淀，有些还形成异构体【s] 5。因此复性是蛋白质工程中最关键、最复杂的问题。包涵体
的处理一般有如下几个步聚。 破碎细菌细胞 提取包涵体时，首先要裂解细菌，为了防止在裂解细菌的过程中目的蛋白质变性，常常采取一些保护措施：合适的缓冲体系，如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液；加 入保护剂，如还原剂DTT(2一巯基苏糖醇)、2一巯基乙醇；加防止水解酶作用的试剂，如酶的抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。破菌的方法很多，主要包括以下几种：(1)渗透破碎法： 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。(2)冷热交替法：把待碎样品投人90℃左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内，可使大部分细胞破碎。可用于提取蛋白质和核酸。 (3)反复冻融法：把待碎样品冷却到一2O℃，冻固后取出，缓慢解冻，如此反复操作，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破导致部分细胞及胞内的颗粒破碎，但也可使生物活性物质失活。这种方法虽简单方便，但对温度变化敏感的蛋白质却不宜采用。(4)超声波法：使用超声波仪使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。根据不同待碎样品采用不同频率，不同时间；另外，超声波处理时溶液温度升高会使不耐热的物质失活，因此使用时为防止温度升高，除间歇开机外，还需人工降温。避免溶液内存在气泡，这样会使蛋白质变性【6】。(5)溶菌酶处理法：多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100 g至1 mg溶菌酶，37℃保温10 min，或者室温作用30 min，细胞就破坏了。 洗涤包涵体 洗涤包涵体前先8 000 r／rain，412离心15 rain，可使大多数包涵体沉淀，
板块一、大肠杆菌 （这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。） 一、关于菌体的量 大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。 二、关于是否包涵体表达 包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？ 说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。 我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。 三、关于表达量 我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。 有一个指标与表达量密切相关，那就是单位体积的菌体量。两者的乘积才是单位体积发酵液的目标蛋白产率。 与表达量相关的指标还有纯化倍数、纯化收率等，这些指标我们也常常在发表的文章中看到。同样，我也认为都是不准确的。除非你用的是活性测定的方法，用蛋白活性收率来表征。 纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。 四、菌体破碎
业务部常见现象解决方案 一、撞单、争单 争单、撞单现象在各个企业中多有出现，经常会出现一个公司的电话有好几个业务员打，这样客户就会产生一种厌烦的心理，对我们后期和客户沟通时带来一定的影响！每个企业都可能有自己的解决办法，在这里我们的建议是：现在是一个科技和信息化时代，所以我们就要利用科技的产物之一电脑为我们的企业发展服务。通过一个智能化的客户管理系统，实行客户资料重复报警通知，即当业务员在录入新的客户资料时，该系统可以自动提示该客户已存在，由系统来审核客户的归属权，谁先录入就归谁，以后有同事在录入客户填写资料时，只要有和此客户资料的公司名称、电话号码等相同时，就录入不了。如图： 可以随时增加和 绿勾表示可 如有同时录入的情况，借用目前大部分企业采用的方式，以公司利益为重的解决方案：看跟进的人的在决策中的关键性，比如张三跟进的是公司的采购，而李四直接在和老板谈合作了，最好就把该客户给李四跟进，因为他跟进的人更有决策权。不同的企业有不同的方法，总之适合自己的就是最好的，我们提出的只是最通用的方法，希望能给到贵公司参考。 二、同样的困难在团队中重复出现，经验难积累 目前，由于业务本身就是一个流动性很大的群体，所以业务人员的流失是正常而且无法避
免的，不过令所有企业头痛的不只是业务员的流失，是企业辛苦培养的业务员不仅走了，把公司教他的经验，方法也全带走了，新业务员又要从零开始培训，周而复始，企业在这方面花了大量的时间、人力和财力。我们给出的建议如下： 既然人员流动这个现象是我们无法避免的，那我们能做的就是通过独特的方式去增强自己企业的经验积累，不求做到最好，至少比同行要好。我们的建议是：企业对新员工从培训开始，就可以记录他在学习或工作中所遇到的问题和问题的解决方法。这个问题可能是整个业务团队共同努力解决或者请教别的专家解决的。这些信息可以永远保存下来，给其他的新员工作为参考和借鉴，同时，有的员工比较典型或者值得学习的成功经验和经历要记录下来，这样，长期累积的困难和解决方法加上成功经验和经历，实际就是公司记录的员工的成长过程和经验，可以让新员工在学习时就能了解许多常见问题及解决办法，并可以学到一些成功的方法，在新员工的快速成长以及能力提升方面无疑都是十分有帮助的。 同样，把一个员工遇到的困难记录下来后，其它业务员碰到该问题就有了可以参考的解决办法。这样，团队重复出现的问题都能用已有的解决方案，也就可以大大提高业务员成长速度和解决问题的效率了。有了这样的好方法，一段时间后，谁敢跟我这样的公司团队匹敌他们的公司团队经验是没积累的，我们的经验是不断增长的，手工是做不到的，做思想工作是做不到的，你不可能要求每个业务员在离职之前写本书，把他的工作经验都写下来把不可能的事，但是通过这种强制经验积累的方法，我们就可以做到了。在强大的经验积累下，我们的业务员也就会信心十足，勇往直前了。具体图示如下： 给以帮助，全员
包涵体表达的蛋白的复性 摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。 关键词包涵体蛋白质复性 Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules. Key words inclusion body , protein , renaturation 外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体： 包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为，具有很高的密度（约ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR 等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1] 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以
从新的角度进行 电子产品稳定性及可靠性测试（1）现有电子产品稳定性测试偏重于环境和机械测试，产品企业相关的测试流程已经完善。从现在的行业来看，包括三星的爆炸事件与苹果的异常关机事件都在表明，供电系统的稳定及可靠是亟待解决的问题。 一款产品要达到客户端，一般分为功能测试，性能测试及稳定性测试。从普遍经验来看，产品的损坏或者异常大部分出现在开关机及特殊状态（干扰或者意外）。正常工作状况下损坏几率微乎其微。 从电子产品的维护经验来看，元器件问题导致的损坏在20%左右，生产工艺问题导致的损坏一般在20%-30%（与生产规模相关），供电及特殊状态导致的损坏高达50%以上。前两者的讨论及改善我们已经做了很多和深入的研究，有各种有益的结果。现在更大的改善空间在于对供电及特殊状态的适应改善。 现有的可靠性测试一般分为环境测试和机械测试，环境测试一般进行温度、湿度、盐雾、粉尘对产品的影响，机械测试一般进行各种外力、震动及跌落等对产品的影响。现在社会上影响比较大的事件却跟供电部分的保护与供电适应范围有关系，那么电子产品的供电对产品有哪些影响，怎么测试呢？ 电子产品的供电部分分为充电>电池----工作电路，三星的事件与充电与电池及其保护有关，苹果的事件与电池及其保护与工作电路的配合有关。 供电部分一般进行的测试项目：
开关机：功能性测试，测试产品能否正常开关机；性能测试，测试产品的开机电压，关机电压，开机时间，关机时间，电源的变化速度对产品的影响，开关机是否会导出产品的性能或者功能异常；稳定性测试，测试产品的相应功能是否在开关机时偶发性逻辑或者功能异常，不同的开关机配合环境测试，是否会导致异常。 电源瞬时跌落或者中断：电源的电压因为接触，或者其他原因会导致到工作电路部分的电源瞬时供应不足或者中断。这种异常状况会导致芯片本身的数据存储，处理，芯片间的通讯，芯片和元器件的控制及逻辑进行影响。要进行产品在允许的供电异常状态下，能够正常工作。 电源供电保护：电源的供电电压长时间过压欠压，短时间过压欠压，保护动作，保护时间，保护状态，保护逻辑及保护稳定性的测试。 电源干扰：所有的电路布线及连接对于干扰来说都是天线，一个供电有多个用电器（汽车，飞机，舰艇）时的供电互相干扰。比如汽车电子，就有ISO18650的行业测试标准，来专门测试供电部分对电子产品的影响。 其他异常：其他行业性的特色测试要求。或者实际使用又特殊环境的要求 电池保护及配合：具有电池的电子产品，在进行相关测试的时候，模拟电池的充放电特性及过充过放状态，来进行相关的配合充电器及与工作部分的配合。 以上测试配合环境测试同时进行，更能充分模拟产品在实际使用时的工作状况。 具体详细测试，请参考后续应用文章：
包涵体的纯化和复性总结 二、包涵体的洗涤? 1、包涵体的洗涤问题? 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。? 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。? 2、如何得到比较纯的包涵体? 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3?mM。去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。? 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。? 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。? 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实
行政事业单位资产管理信息系统有关问题解答 1、同一个行政事业单位如果分别执行“行政”和“事业”二套会计制度时，数据如何报送？ 答：根据行政事业单位财务、会计制度的有关规定，行政事业单位的各类资金和财产都应实行统一的财务管理和会计核算。因此，行政事业单位原则上应执行一种会计制度，将全部资产财务纳入一套制度反映。 因此，同一个行政事业单位，如分别执行“行政”和“事业”二套会计制度时，应按规定进行纠正，以一套数据进行报送。 2、二个或二个以上行政事业单位的财务和资产在一起统一核算时，如何填报？ 答：行政事业单位的财务和资产无论是否实行独立核算，均应纳入行政事业单位资产管理信息系统，独立填报相关信息。填列中需注意： （1）管理财务和资产的单位应填列资产管理信息系统中所有信息，其中《单位情况表》和《人员机构情况表》只填列本单位信息，表中的“独立编制机构数”和“独立核算机构数”均为1个。在《单位情况表》的“备注”中，需注明“XX、XX单位财务、资产和我单位在一起统一核算”。 （2）没有财务和资产的单位在资产管理信息系统中除不需填列“资产卡片”和《资产负债表》外，应填列《单位情况表》和《人员机构情况表》等本单位的信息，表中的“独立核算机构数”不应填数，“独立编制机构数”填1个。在《单位情况表》的“备注”中，需注明“本单位的财务、资产和XX单位在一起统一核算”。 3、预算管理中，单位人员分行政、全供事业、差供事业和经费自理事业等分别编报时，资产管理数据如何报送？ 答：按一个单位统一填报。 4、单位内设机构财务和资产实行独立核算时，如何填报？ 答：同一个行政事业单位的内设机构，无论财务和资产是否实行独立核算，内设机构都不能做为独立填报单位，内设机构的财务和资产应并入本单位填报。 5、主管部门财务处管理的系统财务和资产如何填报？ 答：主管部门财务处因不是独立单位，其管理的系统财务和资产应并入主管部门机关本级填报，在“单位情况表”的备注栏内予以说明。 6、单位情况表中单位基本性质的填报。 行政事业单位填写单位情况表时，行政单位的基本性质如果填写了“行政机关”“审判机关”“检察机关”，则需要根据实际情况进行对应到“政府机关”、“群众团体”、“公安”、“检查”、“法院”、“司法行政”、“监狱”、“劳教”。具体在单位情况表中“备注”栏填写。 7、土地与房屋价值在一起核算时如何录入卡片？ 答：土地与房屋无论价值是否在一起核算，在录入资产管理卡片时，应分别录入“土地”和“房屋与构筑物”卡片。资产价值能拆分的进行拆分，不能拆分的，“土地”卡片中的“价值类型”可选“无价值”。分别在卡片的备注中予以说明。 8、一些特殊资产，在软件中的“资产分类名称”找不到对应代码，如何填写？ 答：在该大类资产项下，选择类似的资产分类或者选择该类资产的“其他类”，在“资产名称”中写明资产的具体名称，在卡片“备注”中予以说明。 9、软件中《单位情况表》里的“单位层次代码”和“同级财政单位层次代码”如何填写？ 答：按照培训时下发的相关填写单位层次代码的培训资料填报。同级财政单位层次代码填写：907125 10、资产管理卡片中的“采购组织形式”如何填列？ 答：“采购组织形式”共有下列四种形式，单位应根据实际情况区别填写： 一是“政府集中采购”：由本地区政府部门统一组织的采购；二是“部门集中采购”：由本单位上级主管部门统一组织的采购；三是“分散采购”：由本单位自行组织的采购。四是“其他”，上述三种形式之外的，如接受捐赠等取得的资产。 11、卡片信息内是否要求添加资产照片？
1、ELISA试验的稳定性问题 做ELISA实验时，结果老是重复性不上，相同的材料和相同的操作方法做出的结果就截然不同，上午做时其OD在1.5，下午做时就是0.9了，所以都没有办法下结论，为什么会差异这么大呀？ （1）多设平行空孔，请别人代劳，以判断究竟是否操作问题 （2）对于活性非常高的包被物和酶标记物，如果第一次选择的范围恰好在其平台位置边缘，那么在重复的时候，每次取样带来的微量误差就很容易导致大的偏差了，特别是线性比较好的原料试剂，这个就很正常了。建议每次取样的时候只使枪尖一点点位于液面下，以免吸嘴外面沾有少量抗原or抗体or酶而使结果重复不上。 2、酶不稳定，有何高招？ （1）保存浓度尽量高些， （2）另外可以添加牛血清白蛋白等蛋白保护剂，以避免其被吸附或沉降以及被蛋白酶所降解。 （3）加入50%甘油-20度保存、避免反复冻融。 （4）还可以加入防腐剂防止长菌（注意不能用叠氮钠，其对HRP活性有很大影响）（5）现在一些公司也有商品化的酶标保护剂供应，可以考虑一下 酶类的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可。液态稳定性较差，贮藏时应注意以下几点：1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易降解、变性。2、一般需加入防腐剂和稳定剂，酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。3、贮藏温度要求低，避免反复冻融。 3、ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？ 做夹心法ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？ 最大的原因是封闭的效果不好，应该调整封闭液； 可以尝试不同的封闭剂（BSA、胶脂奶粉、明胶等）、不同的封闭浓度、时间，试试哪个效果好 阴性的里面的其他蛋白起到了封闭的效果 4、边缘的阴性OD值老是比中间的偏高，什么原因呢？ 我做ELISA时，有一段时间在板的最后一条板孔的阴性的OD值经常比在中间的高，有时候高出0.1个OD，导致实验经常重复，但原因也找不到在哪里？ 这可能是由于ELISA的边缘效应造成的。ELISA的边缘效应是指边缘孔与中心孔反应条件不一致，由于边缘效应的影响，同一标本在边缘孔测定的结果明显高于中央孔，且随边缘孔与中央孔的距离的增加而增强。原因在于试验过程中边缘孔与中央孔的温度、液体蒸发程度不同以及各孔表面存在光洁度等物理性状的差异有关。为克服其影响，应尽可能使用中
活性蛋白整体方案包涵体复性注意事项和常见问题解析 包涵体复性注意事项 1)最适pH值范围为8.0-9.0之间； 2)温度适宜选择4℃； 3)复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL； 4)复性时间一般为24-36小时； 5)低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在 非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解； 6)首先要获得较高纯度的包涵体； 7)包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施； 8)透析前后均要离心； 9)包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100； 10)包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性； 11)复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h； 12)复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定 13)TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。用Triton洗涤有些包涵体 效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。 14)复性时的蛋白浓度一般为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白 在低浓度时不稳定，很容易变性。 包涵体复性常见问题分析 包涵体复性原则 低浓度，平缓梯度，低温。n(O5~0q8D; 怎样洗涤包涵体？ 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。 对于尿素和盐酸胍该怎么选择 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度
问题：流程实施过程中缺乏对员工必要的指导和监督 措施：流程要以业务为主线，对该线条上的员工进行辅导，对工作结果进行监督 流程，企业运行顺畅时你不觉得他的存在，他已经融入企业运营的各个角落，已经变成了员工的一种习惯；企业运行不畅时，他就成为了各个部门、岗位相互推诿扯皮的借口。 流程，就应该是成为员工的工作习惯，融入到员工的日常工作中去，如果流程中每一个环节的执行者都能达到这一点，那各个环节的配合就是紧密的、连贯的，整合业务流程就是高效的。 企业在流程实施过程中经常遇到的问题是：有流程不执行、没流程乱执行。有流程不执行，很多情况下不是员工不想执行，主要原因是流程上的某些节点员工不按照流程的要求执行，结果就是真个流程没有办法执行；没流程乱执行，说的有点夸张，主要原因还是因为流程的显性化不足或者没有定义明确的流程，解决方法要不就是根据自己的判断去执行、要不就是请求上级领导甚至总经理给出指示后执行，如果流程执行出错了就变成了乱执行。 不管是“没执行”还是“乱执行”，从流程实施的角度还是对于流程的辅导、监督工作执行不到位，造成了员工对于流程不了解、不接受，在流程执行时各种问题就会暴露出来。 1.存在问题： 第一，对优化后的流程缺乏必要的辅导，流程环节上各岗位之间就不能就流程执行达成一致和默契 流程实施过程中，对流程执行岗位员工的辅导缺失是普遍存在的问题，经常的做法就是将流程只是简单的发放给部门负责人或员工，由部门负责人负责推动内部培训或者由员工自学，实践中，发现这两种方式实际上都很难解决流程落实的问题，实际情况是部门负责人不了解流程，最好的情况按照只是组织部门人员集中讨论或读一遍流程，更多是员工没有自学、部门负责人没有采取有效的形式组织自学。 这种情况下，虽然流程进行了优化，也进行下发，但是部门负责人和员工实际上是对流程都不了解的，那只能是按照原来的工作习惯处理流程，新流程要求的处理的业务没有开展、新流程要求的处理方式也没有改变，流程执行存在的问题还会继续存在，出现问题后就需要管理者进行协调。 A客户，订单承接以后会有内部的订单评审流程，经常的情况是评审需要几天的时间，甚至需要十几天的时间，各方都觉得流程有问题需要改变，改变的方案流程管理部门也进行了设计，但是由于沟通的问题，各方对该方案都不理解，3个月以后新的流程还没有运行，
常见问题及回答 1. 价格怎么这么高？ 答：你认为高在那里呢？和哪个产品比使你看起来我们的产品显的更贵呢？在现有市场上，同档次的产品还没有比我们更便宜的，如果您说的是那些小厂的品牌，确实是比我们的还低，但那决不是和我们一个档次的。 2. 你们的价格是多少？ 答：您对我们的产品已经了解了吗？如果您还不是很了解，那您也就不能判断我们的产品是不是贵了，您对价格的考虑不外是能否赚钱，有多少利润率？听完我们的产品介绍，了解了我们的产品和营销策略，我想你才能了解我们的价格。 3. 价格为什么这么低？ 答？：您问的正是我们产品的关键，这正是我们的卖点和产品策略的结果。首先：是我们的规模优势，我们是集团化采购，降低了整体成本。其次：我们的公司运营健康合理，无不良资产，经营效率能最大化。最后：是我们的经营思路就是坚持走性价比的道路，我们的利润是最低，所以价格才最低啊！如果您真的打算合作，那我们可以在谈价格，因为我不想我们的价格穿底，毕竟我的价格还是有相当的优势的。 4. 你们的产品好不好，质量能保证吗？
答：当然有保证，连质量都不能保证，我还敢上门啊？我想寻求的可不是短期的生意，我们需要的是长期的合作。我可以从两个方面来说明我们的质量保证，首先是我们的内在优势: A、我们公司的公司规模实力，我们的核心竞争力就是技术开发能力，这点在业内都是有口碑的。 B、在汽车漆市场说到我们公司没有不知道的，我们公司就是靠做汽车漆市场起来的。不但我们的产品本身通过了如ISO9001，14001，GB581等质量环境认证，成品也是经的起检测的。 C、油漆最重要的原料之一是树脂，我们总部有自己的树脂生产基地，是全球500强企业之一，在同行业中排名更是遥遥领先。可以说有着绝对的质量保证，在外来说：我们的技术服务队伍技术雄厚，随时能为你解决质量上的后顾之忧。 5. 出了质量问题怎么办？ 答：当然谁都不希望出问题，但是因为涂料本身只是个半成品，任何一个施工环节，基材处理，施工环境，涂料配比，油工水平都有可能影响施工质量，所以我们会仔细分析，如果确实是我们的质量问题，您放心，那就按合同协议办事，决不让您有任何后顾之忧，我们的服务队伍也会竭诚为您服务。 6. 怎么没听过这个牌子？ 答：现在涂料市场上有近8000家涂料生产厂家，品牌就更多了，这里没什么名气很正常，还没有那一家国内品牌敢说它是全国品牌，都有一定的区域性，如果
目录 一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用 二、包涵体变复性 三、包涵体洗涤纯化——7~10 四、包涵体提出、纯化和复性
一、
二、包涵体变复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。 基本信息 中文名称 包涵体变复性 复性方法 稀释复性 原因 基因工程菌的表达产率过高 包涵体变性 破菌洗涤溶解 目录 1包涵体 2包涵体变性 3包涵体复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 包涵体的形成原因 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决 包涵体的纯化和复性总结 包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤： 包涵体的洗涤 包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。 包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。 包涵体的溶解 变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不
溶的包涵体。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。 另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。 常用变性剂对比 尿素（8-10M） 较盐酸胍慢而弱，溶解度 为70-90% 用尿素溶解具有不电离，呈中 性，成本低，蛋白质复性后除去不会 造成大量蛋白质沉淀 溶解的包涵体可选用多种色谱 法纯化 盐酸胍（6-8M） 溶解能力达95%以上，且 溶解作用快而不造成重组蛋白 质的共价修饰 成本高、在酸性条件下易产生沉 淀、复性后除去可能造成大量蛋白质 沉淀 对蛋白质离子交换色谱有干扰 包涵体的复性 复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束；盐酸胍可以从4M开始，到1.5M 时结束。复性方法主要采用稀释复性，透析复性和柱上复性，具体对比如下：
电脑故障传统诊断、奇冠诊断与稳定性测试卡 使用讲明书V1.1 （适用于台式机和笔记本电脑） 全球唯一，用卡必读 中国发明专利号：03126857.9
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前言 特不感谢您选择奇冠公司的传奇稳（传统诊断——BIOS POST代码、奇冠诊断、奇冠稳定性测试，简称“传奇稳”）系列产品，假如您有什么疑问，请登陆我司网站https://www.doczj.com/doc/7f36782.html,查询详情解答；您还能够将具体问题发E-mail 到p678@https://www.doczj.com/doc/7f36782.html,，我们会及时回复您。感谢您的信赖和支持！ 本卡采纳大规模IC集成模块，结构紧凑，稳定可靠，确保产品品质符合高标准要求。内部资源更丰富，抗干扰性能更优越，自身故障率极低。无须用户安装软件，软件全部内置，我们将前沿科技与使用者行为科学相结合，进行了人性化功能设计，使用特不方便。 本公司是一家专业研发、生产诊断卡的企业，生产的新一代、准确王、二合一卡系列及传奇稳系列产品已获CE认证并受中国国家专利爱护（专利号：03126857.9），侵权必究。我公司已不再生产传统诊断卡，请宽敞用户在购买时认准“奇冠”字样商标及防伪标识。本用户手册所提到的产品规格及资讯仅供参考，实际内容亦会随
时更新，恕不另行通知。假如您要了解最新产品资讯，请访问我公司网站。 本讲明书不断改进，欢迎用户向我司多提意见和建议。 免责声明：对使用本卡给用户造成的损失，本公司恕不承担。 欢迎访问广州奇冠电子公司网 https://www.doczj.com/doc/7f36782.html,
目录 一、用户必读 (1) （一）传统诊断部分 (1) （二）奇冠诊断部分 (1) （三）稳定性测试部分 (1) 二、传奇稳卡功能特点 (2) （一）传统故障诊断功能特点 (2) （二）奇冠诊断功能特点 (2) （三）稳定性测试功能特点 (2) 三、传奇稳卡部件介绍 (3) 四、传奇稳卡指示灯介绍 (4) （一）传奇稳卡指示灯含义 (4) 1.什么缘故CLK、FRAME、IRDY指示灯要改进， 改进后有何好处？ (4)
我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 首先，可以再多加一点透析液看看能否将之溶掉，这样可以减少由于免疫共沉淀的原因而与杂质一起沉淀的蛋白。 再次如果你的蛋白已经复性，并且能很好的溶解的话，那么沉淀要么是杂质，要么是不能复性的蛋白，我认为可以离心去除。 出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。 至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。 如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。TGE配法如下： 50mM Tris 0.5mM EDTA 50mM Nacl 5%或10％甘油 如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。 沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度? 046 wrote: 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 先过柱後复性。 蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白
浅谈业务流程实施常见问题及应对措施 企业管理中，很多工作都要走流程，对于业务流程实施中我们会遇到很多问题，你有什么好的解决方案？下面小编带来的是浅谈业务流程实施常见问题及应对措施。 问题：流程实施过程中缺乏对员工必要的指导和监督 措施：流程要以业务为主线，对该线条上的员工进行辅导，对工作结果进行监督 流程，企业运行顺畅时你不觉得他的存在，他已经融入企业运营的各个角落，已经变成了员工的一种习惯；企业运行不畅时，他就成为了各个部门、岗位相互推诿扯皮的借口。 流程，就应该是成为员工的工作习惯，融入到员工的日常工作中去，如果流程中每一个环节的执行者都能达到这一点，那各个环节的配合就是紧密的、连贯的，整合业务流程就是高效的。 企业在流程实施过程中经常遇到的问题是：有流程不执行、没流程乱执行。有流程不执行，很多情况下不是员工不想执行，主要原因是流程上的某些节点员工不按照流程的要求执行，结果就是真个流程没有办法执行；没流程乱执行，说的有点夸张，主要原因还是因为流程的显性化不足或者没有定义明确的流程，解决方法要不就是根据自己的判断去执行、要不就是请求上级领导甚至总经理给出指示后执行，如果流程执行出错了就变成了乱执行。 不管是“没执行”还是“乱执行”，从流程实施的角度还是对于流程的辅导、监督工作执行不到位，造成了员工对于流程不了
解、不接受，在流程执行时各种问题就会暴露出来。 1.存在问题： 第一，对优化后的流程缺乏必要的辅导，流程环节上各岗位之间就不能就流程执行达成一致和默契 流程实施过程中，对流程执行岗位员工的辅导缺失是普遍存在的问题，经常的做法就是将流程只是简单的发放给部门负责人或员工，由部门负责人负责推动内部培训或者由员工自学，实践中，发现这两种方式实际上都很难解决流程落实的问题，实际情况是部门负责人不了解流程，最好的情况按照只是组织部门人员集中讨论或读一遍流程，更多是员工没有自学、部门负责人没有采取有效的形式组织自学。 这种情况下，虽然流程进行了优化，也进行下发，但是部门负责人和员工实际上是对流程都不了解的，那只能是按照原来的工作习惯处理流程，新流程要求的处理的业务没有开展、新流程要求的处理方式也没有改变，流程执行存在的问题还会继续存在，出现问题后就需要管理者进行协调。 A客户，订单承接以后会有内部的订单评审流程，经常的情况是评审需要几天的时间，甚至需要十几天的时间，各方都觉得流程有问题需要改变，改变的方案流程管理部门也进行了设计，但是由于沟通的问题，各方对该方案都不理解，3个月以后新的流程还没有运行，原来的评审流程还继续存在，甚至还有岗位以改变该流程存在很大风险为由提出异议，其实还不知道该流程优化后没有运行，原来的方式还在持续。这就是流程实施部门沟通协调过程中存在的问题，也是各业务部门沟通协调中存在的问题。 第二，对优化后的流程缺乏必要的沟通，流程执行部门和岗