包涵体复性注意事项和常见问题解析

第24卷第5期河北工业科技Vol.24,No.5 2007年9月Hebei Journal of Industrial Science and Technology Sept.2007 文章编号:100821534(2007)0520314203包涵体蛋白复性及其影响因素于文国,陶秀娥(河北化工医药职业技术学院制药工程系,河北石家庄　050026)摘　要:针对包涵体需经过细胞破碎、变性溶解、复性处理后才能形成具有一定空间构象的生物活性蛋白,且复性处理是一个非常复杂的生化反应过程,只有选择合理的方法,控制适宜的条件,才能提高蛋白的复性效率,综述了包涵体蛋白复性的方法,分析了影响复性的有关因素。

关键词:包涵体;溶解;复性;影响因素中图分类号:Q512 文献标识码:AWays and influence factors for renat uration of protein inclusion bodiesYU Wen2guo,TAO Xiu2e(Department of Pharmaceutical Engineering,Hebei Chemical and Pharmaceutical Vocational Technology College,Shijiazhuang Hebei050026,China)Abstract:To form active protein with an active conformation,processes such as crushing,dissolving and renaturalizing are needed.The renaturation is a very complicated biochemistry process.Only by selecting the proper way and controlling suitable conditions can we raise the efficiency of protein renaturation.This paper summarizes the strategies for renaturation of inclusion bodies,and analyses the factors that influnce renaturation of protein inclusion bodies.K ey w ords:inclusion body;dissolve;renaturation;influnce factors 包涵体是指大肠杆菌高效表达的重组蛋白在细胞内凝集,形成不溶的、无活性的固体颗粒。

包涵体复性
结合液80mm 300mm
Tris: 0.4 0.1 0.1
咪唑：0.1 0.4 1.5
氯化钠： 2 0.5 0.5
尿素：9.6g 2.4g 2.4g
水：补足至20mL 补足至5mL 补足至5mL
1.菌体用裂解液重悬，加入溶菌酶，冰上30min或者时间更长一点。

2.破碎，离心，收集沉淀。

加入包涵体溶解液，10min左右包涵体会溶解。

在冰上进行，可放在摇床上。

3.处理镍柱，放出酒精，水洗2遍，结合液3ml平衡2遍。

4.将包涵体蛋白加入柱子中，结合1小时左右。

5.结合液冲洗柱子。

6.80mm 洗脱蛋白
7.300mm洗脱蛋白，收集2ml洗脱蛋白。

8.准备2个超滤管，分别加入1ml洗脱蛋白液，再加入不含尿素的PBS （可加入EDTA等），离心。

再次加入PBS，离心，收集大约2ml的液体分装保存。

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3 mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

包涵体的纯化和复性包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。

对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。

4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。

包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴！zbbnet wrote:最近实验遇到了大麻烦，说出来大伙帮忙想想法。

实验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。

最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但实验发现主要是包涵体表达。

菌体超声破碎后12000rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于部分溶解状态，对沉淀再作如下处理：1、2M尿素洗涤，pH8.5，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀能够牢固的贴在管底。

2、4M尿素洗涤，pH9.0，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀为半溶状态的冻状物。

3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。

上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。

对3中的溶液取样调pH至12溶液依然混浊。

0.22um过滤，无法去除混浊物。

考虑到混浊物是多聚体，样品中加入1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。

做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，因为目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。

主要想请教这样几个问题：1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？2、我所描述的包涵体的状态说明了什么问题？3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？暂不讨论分泌表达的问题。

回答：1. 你的情况很正常，根据三次沉淀处理情况，应该可以肯定你的蛋白在8MUrea中是完全可以裂解的。

并且该蛋白如若作复性应该可溶性较佳。

但根据我个人的经验。

如果MBP融合蛋白还是以包含体表达的话是很没有意思的，建议作单独表达，除非单独表达不行。

否则即使完全复性，目的蛋白活性也大打折扣。

另可优化表达条件，有可能可容表达的，不要放弃，你的破菌上清也可以跑胶看看有没有目的蛋白。

2. 说明蛋白蔬水性不强。

3。

有些蛋白裂解后有浑浊非常正常，尤其是MBP融合的，即使做到可容也会有白乎乎浑浊的现象，只要不影响使用就行，没必要在意。

IFN-α重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性一、表达产物处理1、表达菌液8000rpm 4℃离心10min2、菌体沉淀按10:1（菌重5g，加50ml）裂解缓冲液，冰上超声至清亮（250W，超声5s，间歇5s，功率35%）3、取样取100ul 超声菌液并离心，标记超声上清，超声沉淀4、12000g 4℃离心15min，上清备用，标记超声上清5、超声沉淀用含2M 尿素的裂解缓冲液，以20:1 比例重悬，继续超声5min6、12000g 4℃离心20min7、超声沉淀用含1% Triton X-100 的裂解缓冲液重悬，4℃放置10min8、12000g 4℃离心15min，获得包涵体9、获得包涵体用Binding Bufer 重悬，4℃放置过夜二、包涵体的纯化1、放置过夜包涵体4℃高速离心，收集上清备用2、取样取离心上清，标记柱前3、使用Ni-NTA 基质进行纯化，用Binding Buffer 平衡Ni 柱，柱子平衡后低流速上样，整个上样过程使样品处于冰上，上样后用3~5 个柱体积的Wash Buffer 进行漂洗，最后用Elution Buffer 洗脱4、取样取柱后，标记柱后三、包涵体复性1、透析袋处理方法：把透析袋剪成适当长度（10~20cm）小段，在大体积的2% （W/V）NaHCO 3 和1mM EDTA (PH8.0)中将透析袋煮沸10min。

用蒸馏水彻底清洗透析袋。

放在1mM EDTA(PH8.0)中将之煮沸10min。

冷却后存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。

从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净2、复性采用梯度透析法，纯化后包涵体用含4M 尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约100ug/ml，从4M、2M、2M、0.5M 依次降低透析液中尿素浓度，每个浓度均4℃透析，4~6h 换新鲜透析液一次，高速离心去除沉淀。

最后用PBS(PH7.2) 4℃透析过夜。

一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

此法适用于动物脏组织、植物肉质种子等。

2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。

对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。

4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0),2mM EDTA,100mM NaCl,0.5%Triton X-100,1mg/ml溶菌酶。

(溶菌酶在这个pH围比较好发挥作用)但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体.如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了.但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间.沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的."取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE.这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体?"而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。

[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦第八章工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。

大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。

但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。

包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解;包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高;包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化;包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。

但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。

现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。

第一节包涵体形成的原因,(什么是包涵体所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构(如Cys含量高)，如低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质(如核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、ompF和ompA等)，以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。

包涵体一般大小为0.1~3.0 μm，具有很高的密度(约1.3 mg/ml)，无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。

包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。

有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的β结构而较少的,结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。

包涵体复性
透析袋处理：
1、2%碳酸氢钠和1mmoL/L EDTA（pH8.0）中煮10min；
2、用蒸馏水彻底洗净；
3、放在1mmoL/L EDTA（pH8.0）中煮沸10min；
4、放在4℃，浸在ddH2O。

试剂配制
0.5M CAPS：称取CAPS 5.53g，溶于ddH2O，定容50mL；
30%十二烷基肌酸纳：称取3g十二烷基肌酸纳，溶于ddH2O，定容10mL；
0.5M Tris-HCl（pH8.5）：称取6.05g Tris，溶于ddH2O，盐酸滴定至pH8.5，定容100mL；
1M DTT：称取DTT
包涵体溶解液：0.5mL CAPS + 166uL 30%十二烷基肌酸纳+ 5uL DTT + 4.3mL ddH2O，共5mL；
包涵体透析液1：12mL 0.5M Tris-HCl（pH8.5）+ 30uL DTT，加水至300mL。

包涵体透析液2：12mL 0.5M Tris-HCl（pH8.5），加水至300mL。

1、将bufferE洗脱的蛋白加入干净的透析袋里，4℃PBS透析过夜，期间换两次PBS，待蛋白包涵体析出；
2、吹打包涵体蛋白，收集在15mL或50mL离心管中，6000r/min离心5min。

3、加入5mL的包涵体溶解液，转移到干净透析袋里，在包涵体透析液1 4℃透析6-7小时。

4、换包涵体透析液2透析6-7小时。

5、把透析袋拿出来，放一干净板上，下面放干燥的PEG20000，吸收透析袋里面的水，达到浓缩的效果。

6、洗净透析袋表面，打开透析袋，回收蛋白。

洗干净用过的透析袋，放进酒精里浸泡。

包涵体复性注意事项和常见问题解析返回:包涵体复性介绍及包涵体复性操作方法包涵体复性注意事项1.最适pH值范围为8.0-9.0之间;2.温度适宜选择4℃;3.复性过程蛋白浓度不宜过大,一般为0.1-0.2mg/mL;4.复性时间一般为24-36小时;5.低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度;脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂,都可阻止蛋白聚集;Tris 对蛋白质复性有促进作用;EDTA可以防止蛋白降解;6.首先要获得较高纯度的包涵体;7.包涵体溶解要彻底,一般应使溶解液体量较大,不要怕蛋白被稀释,要有助溶措施;8.透析前后均要离心;9.包含体要彻底洗涤干净,洗涤液中加入适量Triton-X100;10.包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性;11.复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h ;12.复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定13.TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除,在制药行业中一般不允许采用。

用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。

包涵体洗涤是纯化极为重要的一步,改变培养条件,再洗涤包涵体,有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带,这样后续的纯化就很方便了。

14.复性时的蛋白浓度一般为0.1-1mg/ml,太高的浓度容易形成聚体沉淀,太低的浓度不经济,而且很多蛋白在低浓度时不稳定,很容易变性。

包涵体复性常见问题分析包涵体复性原则低浓度,平缓梯度,低温。

怎样洗涤包涵体?通常的洗涤方法一般是洗不干净的,可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分,过滤除去未溶解的物质,注意留样跑电泳,然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以一直稀释到合适的浓度,可以找到一个合适去除杂质的办法,其实这就是梯度沉淀的方法,比通常的直接洗脱效果好。

对于尿素和盐酸胍该怎么选择尿素和盐酸胍属中强度变性剂,易经透析和超滤除去。