ICS 65.020.99 B 21
DB51
杂交玉米品种真实性和纯度 SSR 分子检测技术方法
Identifying genuineness and purity of maize hybrid using SSR molecular marker
四川省质量技术监督局 发布
目次
前言................................................................................ .II
1 范围............................................................................... .1
2 规范性引用文件..................................................................... .1
3 术语和定义......................................................................... .1
4 原理............................................................................... .2 5试验方法. (2)
6核心引物筛选 (2)
7品种纯度检测程序 (2)
8品种真实性检测程序 (2)
9结果计算 (3)
10检验报告 (3)
附录A（规范性附录）检验报告 ......................................................... .4
前言
本标准的附录A为规范性附录。
本标准由四川省农业厅提出并归口。
本标准由四川省质量技术监督局批准。
本标准起草单位：四川省种子站、四川省农业科学院作物研究所、成都市种子站。
本标准主要起草人：杨俊品、苏秀、何芳、林勇、谭君
杂交玉米品种真实性和纯度SSR分子检测技术方法
1范围
本标准规定了玉米(Zea mays L.)单交种、自交系的品种真实性和纯度的SSR分子标记检测方法和对检测结果的判定标准。
本标准适用于玉米单交种、自交系的品种真实性和纯度鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB 4404.1 粮食作物作物种子禾谷类
GB／T3543.4 农作物种子检验规程发芽试验
GB／T3543.5 农作物种子检验规程真实性和品种纯度
GB/T19557.1 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则
NY/T1432 玉米品种鉴定 DNA指纹方法
BMT guidelines(proj.3) 分子标记选择与DNA指纹库构建指南
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1简单重复序列SSR （Simple Sequence Repeats）
又称微卫星序列或短串联重复序列，是由几个核苷酸（1-5个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100-200bp）的串联重复序列。
3.2 聚合酶反应 PCR （Polymerase Chain Reaction）
一种用于在体外扩增DNA序列的技术程序。
模板DNA经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜温度下，两条引物分别与DNA模板两条链上的一段互补序列发生退火，并在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸）为底物，使退火引物延伸从而合成DNA。
如此变性退火和合成DNA反复循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。
3.3 引物 Primer
具有游离的3’-OH末端及特定序列的寡核苷酸短片段，与DNA模板结合后启动PCR反应。
3.4 核心引物 Core Primer
多态性、稳定性、重复性等综合特性好，适用于真实性和纯度鉴定优先选用的引物。
核心引物的选择参考BMT guidelines(proj.3)。
4 原理
简单重复序列（SSR）分布于玉米整个基因组，每个位点上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。
由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术进行扩增，扩增产物利用电泳进行分离。
不同玉米品种由于遗传结构的差异，当利用一对或多对引物经PCR扩增后会形成不同分子量大小的扩增产物，通过染色形成不同玉米品种的SSR电泳图谱，进行玉米品种真实性和纯度鉴定。
5试验方法
按NY/T1432-2007《玉米品种鉴定 DNA指纹方法》进行。
6核心引物筛选
在玉米每条染色体的长臂和短臂上各选取1对引物，共计20对引物作为基本核心引物；在每条染色体的近着丝点上和根据检测实践选取20对引物作为扩展核心引物，共计40个核心引物。
并筛选出代表每个引物不同谱带的标准品种。
7纯度检测程序
7.1 样品数
从供检样品中随机取400粒玉米种子按GB/T3543.4 《农作物种子检验规程发芽试验》标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机取不少于300株幼苗进行检测。
7.2 检测程序
从核心引物中筛选供检杂交种显性差异的引物3对，对供检样品进行检测。
8 真实性检测程序
8.1 样品数目
供检样品为杂交种时，随机取200粒玉米种子按GB/T3543.4 《农作物种子检验规程发芽试验》标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机取不少于100个个体进行检测。
供检样品为自交系时，随机取20粒种子按GB/T3543.4《农作物种子检验规程发芽试验》标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机选取10个个体进行检测。
8.2 检测程序
8.2.1供检样品为杂交种时，按7.2对供检样品进行纯度检测。
8.2.2 杂交种选择有代表性的5个个体，自交系选取10个个体，用20对基本核心引物与对照样品进行检测。
8.2.3 供检样品与对照样品引物位点差异数≦1时，用20对扩展核心引物进行检测。
9 结果计算
9.1 纯度
鉴定电泳谱带的特征和一致性，计数供检样品幼苗株数和非本品种幼苗株数，并按下列公式计算电泳测定值（品种纯度）X.
供检样品幼苗株数—非本品种幼苗株数
X（%）= ———————————————————×100
供检样品幼苗株数
9.2 真实性判定
9.2.1对供检样品与对照样品的20个位点的DNA指纹谱带数据进行比较：
引物位点差异≥2，判定两个品种为不同品种；
引物位点差异＝1，判定两个品种为相近品种；
引物位点差异＝0，判定两个品种为疑同品种；
9.2.2对相近品种和疑同品种，对供检样品与对照样品的40个位点的DNA指纹谱带数据进行比较：
引物位点差异≥2，判定两个品种为不同品种；
引物位点差异＝1，判定两个品种为近似品种；
引物位点差异＝0，判定两个品种为相同品种或极近似品种；
10 鉴定报告
鉴定报告格式见附录A。
附录A（规范性附录）
NO：2008——×××
×××检验机构
检验报告
产品名称：
送检单位：
检验类型：
本报告共四页
报告编制日期：二00×年月日
注意事项
一、报告无“检验专用章”和“检验单位公章”无效。
二、复制报告未加盖检验单位公章无效。
三、报告无检验（制表）、审核、批准人签字无效。
四、报告涂改无效。
五、对检验报告若有异议，应于收到报告之日起十五日内向检验单位提出，
逾期不再受理。
六、被（送）检单位对提供信息的真实性负责，检验机构对该样品的检测数据负责。
七、未经书面同意，本报告不得用于任何商业目的。
××农作物种子检验机构检验报告NO：2008——×××
共4页第3页
××农作物种子检验机构检验报告
批准：审核：检验（制表）：
共4页第4页。
