SSR标记鉴定玉米品种真实性及纯度的研究

ICS 65.020.20B 21备案号：21532-2007 DB Array北京市质量技术监督局发布前 言本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。

本标准由北京市农业局提出。

本标准由北京市农业标准化技术委员会种植业分会归口。

本标准起草单位：北京市种子管理站、北京市农林科学院玉米研究中心、全国农业技术推广服务中心。

本标准主要起草人：贾希海、郭景伦、辛景树、律宝春、田雷、吴明生、赵久然、王凤格、云晓敏、郭慧杰。

I玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法1 范围本标准依据SSR分子标记原理，规定了进行玉米单交种和亲本自交系的品种纯度及真实性检测方法的仪器设备及试剂、引物筛选、试验步骤、纯度检测和真实性鉴定。

本标准适用于玉米单交种及亲本自交系的纯度及真实性检测。

2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。

2.1品种纯度 varietal p u rity品种在DNA分子标记带型方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表示。

2.2品种真实性 varietal genuineness供检品种与标准品种的符合程度。

2.3SSR分子标记 simple sequence repeat marker由寡核苷酸为单位的简单串联重复序列。

2.4引物 primer结合在模板DNA上的互补短链，提供3＇-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。

3 原理在玉米基因组中普遍存在着由寡核苷酸为基本单位的简单串联重复序列，品种间因其重复次数不同而存在多态性，据此可以利用适宜引物进行PCR扩增，从而检测出特定SSR位点的多态性，以鉴别品种的纯度及真实性。

4 仪器设备及试剂4.1 仪器设备PCR扩增仪；DNA序列分析电泳槽；高压电泳仪（3000V, 400mA, 400W）；电子天平（感量0.01g, 0.001g）；冰箱；微量加样器（0.5µL～10µL, 20µL～200µL, 100µL～1000µL）；磁力搅拌器；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计等。

玉米品种真实性ＳＳＲ分子检测体系优化林显凤１，２，罗友明３，尚玥２，赵长坤２，龚辉２，杨腾３，白体坤３，毛若涵４，李仕伟１，游宇１，２∗㊀（１．南充市农业科学院，四川南充６３７０００；２．南充市种子质量监督检验站，四川南充６３７０００；３．南充市种子管理站，四川南充６３７０００；４．中国农业大学农学院，北京１００１６３）摘要㊀对南充市农业科学院提供的２份玉米品种，随机选用ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１‘主要农作物品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测玉米“中的１２个ＳＳＲ位点，利用琼脂糖凝胶电泳检测法㊁变性ＰＡＧＥ银染检测法和毛细管电泳分析法，分析了不同的扩增程序㊁仪器设备和反应体系等对ＰＣＲ产物质量的影响㊂结果表明：６０ħ退火温度和ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡ聚合酶有利于玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测；２种ＰＣＲ扩增仪对扩增结果并无较大区别㊂６０ħ－ＰＣＲ１－Ｅ１，即６０ħ退火温度，ＰＣＲ扩增仪１［ＴＰ－９６Ａ（Ｆ）］，ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡ聚合酶，毛细管电泳法相结合为最优组合，可作为四川品种真实性快速检测候选方法㊂关键词㊀ＳＳＲ标记；玉米；真实性；检测体系中图分类号㊀Ｓ５１３㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）０６－００９３－０７ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．０６．０２３㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＳＳＲＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＭａｉｚｅＶａｒｉｅｔｙＡｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙＬＩＮＸｉａｎ⁃ｆｅｎｇ１，２，ＬＵＯＹｏｕ⁃ｍｉｎｇ３，ＳＨＡＮＧＹｕｅ２ｅｔａｌ㊀（１．ＮａｎｃｈｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｃｈｏｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ６３７０００；２．ＳｅｅｄＱｕａｌｉｔｙＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎａｎｄＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎＳｔａｔｉｏｎｏｆＮａｎｃｈｏｎｇ，Ｎａｎｃｈｏｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ６３７０００；３．ＳｅｅｄＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅＳｔａｔｉｏｎｏｆＮａｎｃｈｏｎｇ，Ｎａｎ⁃ｃｈｏｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ６３７０００）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｈｅ２ｍａｉｚｅｖａｒｉｅｔｉｅｓｐｒｏｖｉｄｅｄｂｙＮａｎｃｈｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ．１２ＳＳＲｌｏｃｉｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＧＢ／Ｔ３９９１４－２０２１ＶａｒｉｅｔｙＧｅｎｕｉｎｅｎｅｓｓａｎｄＰｕｒｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇｏｆＭａｉｎＣｒｏｐｓｗｉｔｈＳＳＲＭａｒｋｅｒｓ⁃Ｍａｉｚｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇＰＡＧＥａｎｄｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ｅｑｕｉｐｍｅｎｔａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．６０ħａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄＮｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｗｅｒｅｍｏｒｅｃｏｎｄｕｃｉｖｅｔｏｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳＳＲｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｍａｉｚｅｖａｒｉｅｔｙａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ；ＴｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．６０ħ⁃ＰＣＲ１⁃Ｅ１，ｉ．ｅ．６０ħａｎ⁃ｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｎｄＰＣＲ１ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ［（ＴＰ⁃９６Ａ（Ｆ）］ｗｅｒｅｔｈｅｂｅｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄａｓｃａｎｄｉｄａｔｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｖａｒｉｅｔｙａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎＮｏｒｔｈｅａｓｔＳｉｃｈｕａｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＳＳＲｍａｒｋｅｒ；Ｍａｉｚｅ；Ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ基金项目㊀南充市科技计划项目（２１ＹＦＺＪ００１９）㊂作者简介㊀林显凤（１９８９ ），女，吉林前郭尔罗斯人，农艺师，硕士，从事种子质量监督与检验研究㊂∗通信作者，助理研究员，硕士，从事花生遗传育种研究㊂收稿日期㊀２０２２－０５－２０㊀㊀玉米（ＺｅａｍａｙｓＬｉｎｎ．）是全球重要的粮食和饲料作物及工业生产原材料［１］，在我国农业生产中起着巨大的影响作用［２］㊂随着我国玉米育种技术的更新换代，审定品种数量呈现 井喷式 增长，但遗传基础却越来越狭窄［３］，以及玉米种子经营渠道多㊁乱㊁杂，各地普遍存在以假充真㊁以劣充优的现象，严重限制了农业生产的发展，使许多农户和经济组织遭受极大的经济损失［４－５］㊂玉米品种真实性和纯度检测的方法可以根据原理的不同，通过形态法㊁生理生化法㊁物理化学法㊁细胞学法㊁分子生物学法进行鉴定；还可以根据检验对象的不同分为种子测定法㊁植株测定法㊁幼苗测定法；还可以根据检验场所的不同分为田间小区种植鉴定和室内检验等［６］㊂国内一般采用田间小区种植鉴定和室内检验作为后控［６］㊂传统的品种真实性鉴定有形态鉴定法和田间小区种植鉴定法，这２种方法存在费工㊁费时㊁鉴定周期长㊁费用高等缺点，且这２种方法受环境和人为影响较大，鉴定者的观察经验也制约着鉴定的准确性［７］㊂用分子标记技术鉴别植物品种真实性［８－１１］，具有检测速度快，准确性高，重复性好，操作简单，且不易受季节和环境变化影响等特点［１２］，是一种快速㊁精准鉴定品种真实性的有效方法［１３］㊂微卫星ＤＮＡ（ｓｉｍｐｌｅｓｅ⁃ｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ），是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列［１４］，其重复单位为１ ６个核苷酸，由１０ ２０个重复单位串联组成［１５］㊂ＳＳＲ标记呈共显性遗传，可分辨出杂交种子的纯合体和杂合体，每个位点均有许多等位形式，多态性高，结果重演性和稳定性高，是目前较受欢迎的分子标记技术［１６－１９］㊂检测ＳＳＲＰＣＲ产物扩增结果的方法大致有以下５种：①琼脂糖凝胶电泳检测［２０］；②ＱＩＡＧＥＮ琼脂糖毛细管电泳检测［２１］；③ＰＡＧＥ－放射自显影检测；④利用ＰＡＧＥ－银染法进行检测［２２］；⑤利用全自动核酸蛋白分析系统进行结果分析［２３－２４］㊂目前已有学者利用琼脂糖凝胶电泳ＳＳＲ分子检测鉴定出玉米品种真实性和纯度检测最适宜的部位［２５］㊂笔者选取①㊁④㊁⑤３个方法分析扩增程序㊁仪器设备和反应体系等因素对四川玉米品种真实性ＳＳＲ分子测定结果质量的影响，筛选出适宜的试验条件以适应四川目前真实性室内分子检测工作开展的需要㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验材料㊀供试玉米种子样品，由南充市农业科学院玉米研究所提供㊂共２个种子样品，分别为南Ｎ２１４２㊁南Ｗ８１６㊂植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（Ａｉｄｌａｂ），ＴａｑＤＮＡ聚合酶：ｎｏ⁃ｖｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｅ１）㊁ＴＩＡＮＧＥＮ（Ｅ２）㊁四通道卡夹（Ｂｉｏｐｔｉｃ）㊂智能人工气候箱（ＲＴＯＰ－１０００Ｙ）；研磨仪（ＹＭＹ２００）；ＰＣＲ扩增仪１（ＴＰ－９６Ａ（Ｆ））；ＰＣＲ扩增仪２（ＢＩＯ－ＲＡＤ）；微量紫外分光光度计（ＴＰ－Ｌ－１０００）；全自动凝胶成像系统（ＢＩＯＴＯＰ）；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（ＢＩＯ－ＲＡＤ）；荧光毛细管电泳设备（Ｂｉｏｐ⁃安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（６）：９３－９９㊀㊀㊀ｔｉｃ－Ｑｓｅｐ４００）㊂１．２㊀试验方法１．２．１㊀ＤＮＡ提取㊂采取对玉米种子进行发芽试验，利用植物叶片直接提取的方法，每个试样取５ ７粒种子的叶片混株样品，使用研磨仪进行研磨，用ＤＮＡ提取试剂盒提取玉米全基因组ＤＮＡ，方法详见试剂盒说明书㊂提取的ＤＮＡ用微量紫外分光光度计检测ＤＮＡ质量和浓度，并稀释到５０ｎｇ／μＬ㊂１．２．２㊀ＰＣＲ扩增㊂反应采用２０μＬ体系，２ˑＴａｑＰＣＲＭｉｘ１０μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ上㊁下游引物各１μＬ，ＤＮＡ１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ７μＬ㊂引物使用ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１‘主要农作物品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测玉米“中的１２对引物（表１）进行ＰＣＲ扩增［２６］㊂ＰＣＲ反应程序：９４ħ预变性３ｍｉｎ；９４ħ变性３０ｓ，５３／６０ħ退火３０ｓ，７２ħ延伸１ｍｉｎ，共３０个循环；７２ħ延伸７ｍｉｎ，４ħ保存㊂表１㊀１２对ＳＳＲ引物名称与序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｎａｍｅｓａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ１２ｐａｉｒｓｏｆＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ引物编号Ｐｒｉｍｅｒｎｕｍｂｅｒ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ染色体位置Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｐｏｓｉｔｉｏｎ等位变异范围Ａｌｌｅｌｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｒａｎｇｅ引物序列（５ᶄ ３ᶄ）ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅＰ１９ｕｍｃ１４３２ｙ６１０．０２２２０ ２５７Ｆ：ＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＧＧＴＧＣＧＡＧＣＡＴＣＲ：ＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＡＡＧＣＰ２０ｕｍｃ１５０６ｋ１２１０．０５１６６ １９０Ｆ：ＧＡＧＧＡＡＴＧＡＴＧＴＣＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＲ：ＴＴＣＡＧＴＣＧＡＧＣＧＣＣＣＡＡＣＡＣＰ２１ｕｍｃ１１４７ｙ４１．０７１５４ １６８Ｆ：ＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＧＧＴＧＣＧＡＴＡＣＲ：ＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＣＧＣＰ２２ｂｎｌｇ１６７１ｙ１７１．１０１７５ ２３０Ｆ：ＣＣＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＧＡＣＣＴＧＲ：ＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＰ２３ｐｈｉ９６１００ｙ１２．００２４５ ２７７Ｆ：ＴＴＴＴＧＣＡＣＧＡＧＣＣＡＴＣＧＴＡＴＡＡＣＧＲ：ＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＡＣＣＣＰ２４ｕｍｃ１５３６ｋ９２．０７２１６ ２３８Ｆ：ＴＧＡＴＡＧＧＴＡＧＴＴＡＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＴＡＴＣＧＲ：ＧＡＧＣＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＧＧＴＴＡＡＴＡＴＧＧＡＧＣＰ２５ｂｎｌｇ１５２０Ｋ１２．０９１６０ １９５Ｆ：ＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＣＲ：ＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＰ２６ｕｍｃ１４８９ｙ３３．０７２３１ ２６５Ｆ：ＧＣＴＡＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＲ：ＧＣＣＴＡＣＴＣＴＴＧＣＣＧＴＴＴＴＡＣＴＣＣＴＧＴＰ２７ｂｎｌｇ４９０ｙ４４．０４２７１ ３３０Ｆ：ＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＲ：ＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＡＰ２８ｕｍｃ１９９９ｙ３４．０９１７６ ２００Ｆ：ＧＧＣＣＡＣＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＴＴＴＧＣＲ：ＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＣＧＰ２９ｕｍｃ２１１５ｋ３５．０２２７０ ２９３Ｆ：ＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＡＣＣＣＡＴＣＧＲ：ＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＡＴＡＧＧＰ３０ｕｍｃ１４２９ｙ７５．０３１２６ １４４Ｆ：ＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＣＲ：ＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧ１．２．３㊀琼脂糖凝胶电泳检测㊂扩增产物需在ＰＣＲ仪上执行变性程序：９５ħ变性５ｍｉｎ，４ħ冷却１０ｍｉｎ以上㊂采用２．０％琼脂糖凝胶进行电泳，点样时同一引物的２个样品相邻，稳压稳流状态电泳后用全自动凝胶成像系统进行照相读带㊂１．２．４㊀变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测㊂采用ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１‘主要农作物品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测玉米“中的检测方法㊂扩增产物自带染料，无须加入ＬａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ㊂扩增产物需在ＰＣＲ仪上执行变性程序：９５ħ变性５ｍｉｎ，４ħ冷却１０ｍｉｎ以上㊂采用４．５％ＰＡＧＥ进行灌胶，点样时同一引物的２个样品相邻，９０Ｗ电泳８０ｍｉｎ后用银染法显带并观察结果㊂银染法显带步骤：固定 漂洗 染色 漂洗 显影 定影 漂洗㊂固定，１０％ＨＡｃ，１次，３ｍｉｎ；漂洗，ｄｄＨ２Ｏ，１次，＜１０ｓ；染色，０．２％ＡｇＮＯ３，１次５ｍｉｎ；漂洗，双蒸水，１次，＜１０ｓ；显影，３０ｇＮａＯＨ＋５ｍＬＨＣＨＯ定容至１０００ｍＬｄｄＨ２Ｏ中，摇床上轻轻晃动至纹带出现；定影，１０％ＨＡｃ定影，５ｍｉｎ；漂洗，ｄｄＨ２Ｏ，１次，＜１０ｓ㊂１．２．５㊀毛细管电泳检测㊂将样品在ＰＣＲ仪上９５ħ变性５ｍｉｎ取出，冷却１０ｍｉｎ以上㊂用Ｑｓｅｐ４００荧光毛细管电泳设备进行电泳检测㊂电泳步骤：联机与通气检查 放入缓冲液和Ｍａｒｋｅｒ 放入样品并复位 置入卡夹 卡夹锁定与校准 程序设定，程序设定好后点击Ｒｕｎ，开始电泳分离，可点击Ｒｅａｌｔｉｍｅ实时监测电泳过程㊂结果用Ｑ－ＡｎａｌｙｚｅｒｆｏｒＱｓｅｐ４００软件进行分析㊂１．３㊀试验设计㊀采用５３㊁６０ħ２个退火温度；２种不同来源的ＴａｑＤＮＡ聚合酶；２台不同企业不同年度购买的ＰＣＲ扩增仪；３种不同的电泳方法㊂为便于图片标记和数据处理，分别对试验数据进行编号（表２），并根据表３的试验条件进行试验㊂２㊀结果与分析２．１㊀ＤＮＡ模板质量检测㊀用植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（Ａｉｄｌａｂ）提取的ＤＮＡ模板，采用微量紫外分光光度计（ＴＰ－Ｌ－１０００）进行检测㊂检测结果显示（表４），所提取的ＤＮＡ模板质量较高，能够满足试验处理的质量要求㊂每个样品稀释至５０ｎｇ／μＬ备用㊂４９㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年表２㊀试验条件及编号Ｔａｂｌｅ２㊀Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｎｕｍｂｅｒｓ序号Ｎｏ．项目Ｉｔｅｍ试验条件Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎ编号Ｎｏ．１扩增程序：退火温度５３ħＩ２６０ħＩＩ３反应体系：ＴａｑＤＮＡ聚合酶ＴａｑＤＮＡ聚合酶－Ｅ１（ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）ａ４ＴａｑＤＮＡ聚合酶－Ｅ２（ＴＩＡＮＧＥＮ）ｂ５仪器设备：ＰＣＲ扩增仪ＰＣＲ扩增仪１［ＴＰ－９６Ａ（Ｆ）２０２１年购买］Ａ６ＰＣＲ扩增仪２（ＢＩＯ－ＲＡＤ２００６年购买）Ｂ７检测方法：电泳琼脂糖凝胶电泳甲８ＰＡＧＥ凝胶成像电泳乙９Ｑｓｅｐ荧光毛细管电泳丙２．２㊀琼脂糖凝胶电泳下不同处理对ＰＣＲ产物质量的影响㊀采用琼脂糖凝胶电泳的方法分析了扩增程序中不同退火温度㊁不同ＰＣＲ扩增仪和不同ＴａｑＤＮＡ聚合酶对玉米品种真实性ＳＳＲ标记扩增产物质量的影响㊂对比ＰＣＲ产物电泳谱带的清晰度和干净度可知，５３ħ退火温度条件下，电泳谱带拖带明显，特异性较低，非特异性产物较多，杂质多；６０ħ退火温度条件下，条带特异性高，杂质少，条带和背景较５３ħ退火温度图谱清晰㊁干净㊂利用ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｅ１）和天根（Ｅ２）ＴａｑＤＮＡ聚合酶得到的ＰＣＲ产物电泳条带特异性均较高，目标条带比较清晰㊁杂质少㊁背景较干净㊂但天根ＴａｑＤＮＡ聚合酶未能扩增出ＩｂＡ甲㊁ＩＩｂＡ甲㊁ＩｂＢ甲㊁ＩＩｂＢ甲中Ｐ２５目的条带㊂使用ＴＰ－９６Ａ（Ｆ）和ＢＩＯ－ＲＡＤＰＣＲ仪进行扩增，对比条带特性㊁背景清晰度可知，不同品牌仪器对结果的影响并不明显（图１）㊂因此，采用琼脂糖凝胶电泳方法，得到结果为６０ħ退火温度和ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡ聚合酶较有利于开展玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测㊂表３㊀试验条件组合及代号Ｔａｂｌｅ３㊀Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｎｄｃｏｄｅ组合编号ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＮｏ．试验条件ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎＩＩＩａｂＡＢ甲乙丙组合代号Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｃｏｄｅ１＋＋＋＋ＩａＡ甲２＋＋＋＋ＩａＢ甲３＋＋＋＋ＩｂＡ甲４＋＋＋＋ＩｂＢ甲５＋＋＋＋ＩＩａＡ甲６＋＋＋＋ＩＩａＢ甲７＋＋＋＋ＩＩｂＡ甲８＋＋＋＋ＩＩｂＢ甲９＋＋＋＋ＩａＡ乙１０＋＋＋＋ＩａＢ乙１１＋＋＋＋ＩｂＡ乙１２＋＋＋＋ＩｂＢ乙１３＋＋＋＋ＩＩａＡ乙１４＋＋＋＋ＩＩｂＢ乙１５＋＋＋＋ＩＩｂＡ乙１６＋＋＋＋ＩＩｂＢ乙１７＋＋＋＋ＩａＡ丙１８＋＋＋＋ＩａＢ丙１９＋＋＋＋ＩｂＡ丙２０＋＋＋＋ＩｂＢ丙２１＋＋＋＋ＩＩａＡ丙２２＋＋＋＋ＩＩａＢ丙２３＋＋＋＋ＩＩｂＡ丙２４＋＋＋＋ＩＩｂＢ丙㊀注：＋代表组合采用该处理方法㊂㊀Ｎｏｔｅ：＋ｍｅａｎｓｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｄｏｐｔｓｔｈｉｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄ．表４㊀提取的ＤＮＡ检测结果Ｔａｂｌｅ４㊀ＴｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｅｄＤＮＡ品种编号ＩｔｅｍＮｏ品种名称ＶａｒｉｅｔｙｎａｍｅＤＮＡ浓度ＤＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｎｇ／ｍＬＤ２６０ｎｍＤ２８０ｎｍＤ２６０ｎｍ／Ｄ２８０ｎｍ１南Ｎ２１４２８３．３０１．４０３０．６８４２．０５１２南Ｗ８１６７０．１５１．６６８０．７７０２．１６６２．３㊀聚丙烯酰胺凝胶电泳下不同处理对ＰＣＲ产物质量的影响㊀利用８个试验处理分析了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下不同退火温度㊁不同ＴａｑＤＮＡ聚合酶和不同品牌的ＰＣＲ扩增仪对玉米品种真实性ＳＳＲ标记扩增产物质量的影响（图２）㊂处理ＩａＡ乙与ＩＩａＡ乙㊁ＩａＢ乙与ＩＩａＢ乙比较，２个不同的退火温度对目的条带的特异性并无较大区别，杂质少，条带和背景均较干净；处理ＩｂＡ乙与ＩＩｂＡ乙㊁ＩｂＢ乙与ＩＩｂＢ乙相５９５１卷６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀林显凤等㊀玉米品种真实性ＳＳＲ分子检测体系优化注：２５个泳道依次为Ｍａｋｅｒ和１２对ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１玉米品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测对南Ｎ２１４２和南Ｗ８１６的扩增产物㊂Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ２５Ｌａｎｅｓｗｅｒｅｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｍａｋｅｒａｎｄ１２ｐａｉｒｓｏｆＧＢ／Ｔ３９９１４－２０２１ＶａｒｉｅｔｙｇｅｎｕｉｎｅｎｅｓｓａｎｄｐｕｒｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇｏｆｍａｉｎｃｒｏｐｓｗｉｔｈＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ⁃Ｍａｉｚｅ，ＳｏｕｔｈＮ２１４２ａｎｄＳｏｕｔｈＷ８１６ｂｙＳＳＲｍａｒｋｅｒｍｅｔｈｏｄ．图１㊀琼脂糖凝胶电泳分析扩增程序㊁仪器设备和反应体系对ＰＣＲ产物质量的影响Ｆｉｇ．１㊀Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ注：２５个泳道依次为Ｍａｋｅｒ和１２对ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１玉米品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测对南Ｎ２１４２和南Ｗ８１６的扩增产物㊂Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ２５Ｌａｎｅｓｗｅｒｅｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｍａｋｅｒａｎｄ１２ｐａｉｒｓｏｆＧＢ／Ｔ３９９１４－２０２１ＶａｒｉｅｔｙｇｅｎｕｉｎｅｎｅｓｓａｎｄｐｕｒｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇｏｆｍａｉｎｃｒｏｐｓｗｉｔｈＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ⁃Ｍａｉｚｅ，ＳｏｕｔｈＮ２１４２ａｎｄＳｏｕｔｈＷ８１６ｂｙＳＳＲｍａｒｋｅｒｍｅｔｈｏｄ．图２㊀变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增程序㊁仪器设备和反应体系对ＰＣＲ产物质量的影响Ｆｉｇ．２㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ａｐｐａｒａｔｕｓａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃ⁃ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ６９㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年比较，６０ħ图谱杂质少，背景干净，条带清晰易读取㊂ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｅ１和Ｅ２以及不同品牌的ＰＣＲ扩增仪对目的片段的扩增结果并无较大区别，但Ｅ２未能扩增出ＩｂＡ乙㊁ＩＩｂＡ乙㊁ＩｂＢ乙㊁ＩＩｂＢ乙中Ｐ２５目的条带，这与琼脂糖凝胶电泳结果相一致㊂因此，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下６０ħ退火温度和ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｅ１较有利于玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测㊂２．４㊀毛细管电泳下不同处理对ＰＣＲ产物质量的影响㊀不同退火温度㊁ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＰＣＲ扩增仪下毛细管电泳图谱与琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱相一致㊂通过胶图（图３）和信号图（图４）可知，２台ＰＣＲ扩增仪对玉米品种真实性ＳＳＲ标记扩增产物质量的影响无明显区别㊂不同退火温度处理下，５３ħ退火温度的４个组合中，ＩａＢ丙㊁ＩｂＢ丙非特异性条带浓度比目的条带高，ＩｂＡ丙的非特异性条带的信号明显强于目的条带；６０ħ退火温度的胶图背景干净，杂质少，特异性较高，信号图中的主峰明显，仅ＩＩｂＡ丙和ＩＩｂＢ丙中存在较多小于１００ｂｐ的非特异性条带㊂ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｅ１扩增结果中，ＩａＡ丙㊁ＩＩａＡ丙㊁ＩａＢ丙㊁ＩＩａＢ丙非特异性条带较少，背景较干净；Ｅ２扩增结果中，ＩｂＡ丙㊁ＩＩ⁃ｂＡ丙㊁ＩｂＢ丙㊁ＩＩｂＢ丙小于１００ｂｐ和大于４００ｂｐ的非特异性条带较多（图５），部分条带浓度高于目的条带浓度，这可能与试验条件组合不同有关㊂因此，在毛细管电泳下６０ħ退火温度和ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｅ１较有利于玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测，这与琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果相一致㊂图３㊀毛细管电泳分析扩增程序㊁仪器设备和反应体系对ＰＣＲ产物质量影响的胶图Ｆｉｇ．３㊀Ｇｅｌｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓａｎｄｅｑｕｉｐｍｅｎｔａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓ３㊀结论与讨论ＰＣＲ扩增是品种真实性分子标记鉴定过程中的重要环节㊂影响ＰＣＲ反应结果的重要因素包括反应体系㊁扩增程序和仪器设备等㊂该研究主要针对这３个方面进行组合比较，得出最优组合，以满足分子检测工作的开展需要，能够快速为种子管理部门㊁执法机关提供技术支撑㊂结果表明，６０ħ退火温度有利于玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测；ｎｏ⁃ｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑ聚合酶较适合玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测；２种不同公司㊁不同年度采购的ＰＣＲ扩增仪对玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测并无明显区别㊂最终得出ＩＩａＡ丙组合为最佳㊂琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中，Ｅ２未能扩增出Ｐ２５目的条带；毛细管电泳检测时，Ｅ２和ＰＣＲ１组合，无论退火温度是５３ħ还是６０ħ，均有目的条带的主峰图存在；Ｅ２和ＰＣＲ２进行组合时，均无目的条带，这有可能由于某些引物与使用不同的ＰＣＲ扩增仪有关，也有可能与人为操作有关㊂鉴于只使用ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１‘主要农作物品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测玉米“中的１２对引物，对其他引物扩增效果尚不清楚，建议优先使用Ｅ１，即ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡ聚合酶㊂７９５１卷６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀林显凤等㊀玉米品种真实性ＳＳＲ分子检测体系优化图４㊀毛细管电泳分析扩增程序㊁仪器设备和反应体系对ＰＣＲ产物质量影响的信号图Ｆｉｇ．４㊀Ｓｉｇｎａｌｄｉａｇｒａｍｏｆｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓａｎｄｅｑｕｉｐｍｅｎｔａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｑｕａｌｉｔｙｂｙｃａｐｉｌ⁃ｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓ８９㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年图５㊀针对Ｐ２５引物，采用Ｅ２Ｔａｑ聚合酶，不同退火温度㊁不同ＰＣＲ扩增仪对ＰＣＲ产物质量影响的信号图Ｆｉｇ．５㊀ＳｉｇｎａｌｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓａｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｕ⁃ｓｉｎｇＥ２ＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｏｒＰ２５ｐｒｉｍｅｒｓ３种方法检测的片段大小基本一致，琼脂糖凝胶电泳方法可扩增出目的条带的大概位置，分离效率较低，适宜鉴定２个品种是否为同一品种的检测；变性ＰＡＧＥ银染检测法的仪器设备及试剂成本低廉，适合于少量材料的检验分析，特别是ＳＳＲ标记的筛选，其过程复杂，因素较多，且工作效率较低㊂毛细管电泳荧光检测法具备高通量㊁上样灵活㊁高灵敏度（１ｐｇ／μＬ）和高分辨率（最佳可达１ ４ｂｐ）等优势，操作过程无须人工制胶㊁染色㊁加样㊁拍照，操作简便，可自动计算片段大小，结果美观易判断，可替代ＰＡＧＥ凝胶电泳，作为四川大批量材料的检测分析，也为四川ＳＳＲ指纹库的构建［２７－２９］打下坚实基础㊂参考文献［１］沈仁飞．ＳＳＲ分子标记及其在玉米真实性鉴定上的应用［Ｊ］．云南农业科技，２０１８（５）：３６－３８．［２］孙琦，张世煌，李新海，等．中国不同年代主推玉米品种品质性状的变化趋势［Ｊ］．中国农业科学，２０１４，４７（１４）：２７２３－２７３０．［３］李巧英，郑戈文，任路路，等．ＳＳＲ分子标记两种电泳方法快速区分玉米种子杂交种［Ｊ］．农业科技通讯，２０２１（５）：４６－４９．［４］孙卫永，尹航，郝德荣．玉米杂交种生产中存在的主要问题及关键措施［Ｊ］．中国种业，２０１５（５）：１７－２０．［５］郑成超，温孚江．ＤＮＡ分子标记技术与作物品种纯度鉴定［Ｊ］．山东农业大学学报，１９９７，２８（４）：４９９－５０５．［６］农业部全国农作物种子质量监督检验测试中心．农作物种子检验员考核学习读本［Ｍ］．北京：中国工商出版社，２００６：２３９－２４５．［７］刘峰，冯雪梅，钟文，等．适合棉花品种鉴定的ＳＳＲ核心引物的筛选［Ｊ］．分子植物育种，２００９，７（６）：１１６０－１１６８．［８］周会，苏秀，毛双林，等．杂交水稻品种真实性和纯度的ＳＳＲ分子标记鉴定［Ｊ］．种子世界，２０１４（３）：３４－３５．［９］张冰清，陆徐忠，吴新杰，等．利用ＳＳＲ标记进行杂交油菜品种鉴定［Ｊ］．中国油料作物学报，２０１４，３６（６）：７２８－７３４．［１０］王飞．ＳＳＲ分子标记在棉种真实性和纯度中的应用研究［Ｄ］．北京：中国农业科学院，２０１３．［１１］许鲲，李锋，吴金锋，等．ＳＳＲ荧光标记毛细管电泳法与国家冬油菜区试指纹鉴定平台的构建［Ｊ］．中国油料作物学报，２０１４，３６（２）：１５０－１５９．［１２］纪玉忠，肖振军，罗丽萍．两种农作物品种真实性鉴定方法的比较分析［Ｊ］．农业与技术，２０１５，３５（１８）：９２．［１３］郭奕生，陆俊，郭奕南．利用ＳＳＲ分子标记鉴定水稻品种真实性［Ｊ］．种子，２０１４，３３（６）：１１５－１１８．［１４］ＤＩＮＧＳＭ，ＷＡＮＧＳＰ，ＨＥＫ，ｅｔａｌ．Ｌａｒｇｅ⁃ｓｃａｌｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｏｍｅｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓａｒｅｇｅｎｅｒａｌｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｔｔｈｅｆａｍｉｌｙｌｅｖｅｌｉｎｉｎｓｅｃｔｓ［Ｊ］．ＢＭＣＧｅｎｏｍ，２０１７，１８（１）：１－１０．［１５］罗兵，孙海燕，徐港明，等．ＳＳＲ分子标记研究进展［Ｊ］．安徽农业科学，２０１３，４１（１２）：５２１０－５２１２，５２４６．［１６］ＷＵＫＳ，ＴＡＮＫＳＬＥＹＳＤ．Ａｂｕｎｄａｎｃｅ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｐｉｎｇｏｆｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓｉｎｒｉｃｅ［Ｊ］．ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ，１９９３，２４１（１）：２２５－２３５．［１７］罗玉娣，李建国．ＳＳＲ标记及其在蔬菜育种中的应用［Ｊ］．热带农业科学，２００５，２５（６）：６８－７１．［１８］ＡＫＡＧＩＨ，ＹＯＫＯＺＥＫＩＹ，ＩＮＡＧＡＫＩＡ，ｅｔ．ａｌ．ＭｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅＤＮＡｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｒｉｃｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，１９９６，９３（７）：１０７１－１０７７．［１９］ＭＣＣＯＵＣＨＳＲ，ＣＨＥＮＸ，ＰＡＮＡＵＤＯ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｄｅｖｅｌ⁃ｏｐｍｅｎｔｍａｐｐｉｎｇａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｒｉｃｅｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，１９９７，３５（１／２）：８９－９９．［２０］穆建新，李殿荣，郭蔼光，等．用ＳＳＲ分子标记检测杂交油菜秦优７号的种子纯度［Ｊ］．西北农业学报，２０１０，１９（１１）：６４－６８．［２１］杨华．农作物种子质量检测能力验证中的品种真实性室内分子检测研究［Ｊ］．种子科技，２０１９，３７（６）：１２７－１２９，１３１．［２２］王凤格，赵久然，郭景伦，等．一种改进的玉米ＳＳＲ标记的ＰＡＧＥ／快速银染检测新方法［Ｊ］．农业生物技术学报，２００４，１２（５）：６０６－６０７．［２３］夏春兰，方清建，付存念，等．玉米简易多重ＳＳＲ－ＰＣＲ和荧光标记检测技术［Ｊ］．分子植物育种，２０１５，１３（９）：２０９５－２０９９．［２４］易红梅，王凤格，赵久然，等．玉米品种ＳＳＲ标记毛细管电泳荧光检测法与变性ＰＡＧＥ银染检测法的比较研究［Ｊ］．华北农学报，２００６，２１（５）：６４－６７．［２５］殷长生，许昌慧．玉米的不同取材对品种真实性和纯度鉴定结果的影响［Ｊ］．种子，２０１３，３２（１１）：１１８－１２０．［２６］国家市场监督管理总局，国家标准化管理委员会．主要农作物品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测玉米：ＧＢ／Ｔ３９９１４ 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玉米品种鉴定技术规程 ssr标记法SSR（Simple Sequence Repeat）标记法是一种用于玉米品种鉴定的技术规程。

以下是关于玉米品种鉴定技术规程 SSR 标记法的一些基本信息：1. SSR 标记的原理：SSR 标记是基于短小简单重复序列的分子标记技术。

这些重复序列在基因组中广泛存在且具有高度多态性。

通过设计特定的引物，可以扩增并检测这些 SSR 标记，从而识别不同品种之间的差异。

2. DNA 提取：从待鉴定的玉米样本中提取高质量的 DNA 是进行 SSR 分析的重要步骤。

通常使用适当的 DNA 提取方法，如 CTAB 法或商业试剂盒。

3. SSR 引物设计：针对玉米基因组中的 SSR 位点，设计特异性的引物对。

这些引物可以根据已发表的玉米 SSR 数据库或通过自行开发来获得。

4. PCR 扩增：使用设计的 SSR 引物对，对提取的 DNA 进行 PCR 扩增。

PCR 反应条件可以根据引物的特性和设备要求进行优化。

5. 电泳和凝胶分析：扩增产物通过电泳在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。

根据 SSR 标记的大小差异，可以观察到不同的电泳条带。

6. 数据分析：对电泳结果进行分析，记录每个品种的 SSR 标记图谱。

通过比较不同品种之间的图谱差异，可以鉴定出品种的独特特征。

7. 品种鉴定：根据 SSR 标记的多态性和品种特有的图谱模式，可以对玉米品种进行准确的鉴定和区分。

需要注意的是，SSR 标记法需要专业的实验室设备和技术操作，同时也需要对玉米基因组和 SSR 标记的相关知识有一定的了解。

在进行品种鉴定时，建议遵循相关的标准操作程序和实验室安全规范。

SSR分子标记在玉米育种中的研究进展摘要简要介绍了SSR分子标记的原理及特点，综述了近年来SSR分子标记在玉米遗传多样性分析、杂种优势群的划分、品种纯度及真伪鉴定、遗传连锁图谱的构建及基因定位、单倍体育种、分子标记辅助选择育种中的研究进展及应用前景，以期为SSR分子标记技术在作物育种中的应用提供参考。

关键词SSR；分子标记；玉米；遗传育种中图分类号S513 文献标识码 A 文章编号1007-5739（2016）07-0015-02Abstract The principle and characteristics of SSR molecular marker were simply introduced，the research advances and application prospect of SSR molecular marker in maize breeding were summarized in past years，such as the analysis of genetic diversity，division of heterosis groups，the detection of the hybred purity and its authenticity，construction of genetic spectrum and gene locating，haploid breeding and selection breeding assisted by molecular markers，in order to provide reference for the application of SSR molecular markers in crop breeding.Key words SSR；molecular markers；maize；geneticbreeding在传统的培育玉米的过程中，选择的依据常为表型的性状，由于受环境等多方面的影响，该依据效率不高，有很多缺点。

ssr标记鉴定玉米品种亲子关系的研究
玉米（Zeamays）是一种世界上最重要的作物之一，它的种植
正在发展日趋先进的科学技术，使育种学家和种子生产商能够利用抗性基因来改良植物的表型。

在维持品种的稳定性的同时，了解农作物的亲子关系非常重要。

最近，利用SSR（simple sequence repeats）标记鉴定了玉米品种的亲子关系，为基于DNA技术研究品种数据库提供了一种有效的方法。

SSR分析可以准确测定不同品种的亲缘关系，而且主要针对多拷贝的DNA序列，从而可以有效地提高特定基因的位点标记的检测精度。

为了评估SSR技术应用于玉米品种鉴定的有效性，在本研究中，我们选择了20个水稻杂交组合，并使用7个常用SSR标记。

本研究中使用的所有标记位点均可以有效检测玉米品种间的遗传分化和亲
子关系，检测率都非常高，达到97.5%。

此外，两个品种中样本间SSR 分型的多样性证明了这种技术能够有效地检测和鉴定玉米品种间的
亲缘关系。

本研究的结果表明，使用SSR标记鉴定玉米品种的亲子关系是一种有效的方法，并且具有优良的可行性和高分辨率。

同时，这种技术还可以有效地筛选出优良的单系杂交种，作为育种的起点，以提高新品种的性能。

从了解品种亲缘关系的角度出发，现实中利用SSR技术来进行玉米品种鉴定具有重要意义，为工程应用提供了基础材料。

今后研究中，
将有更多的SSR标记开发，才能满足不同品种研究者对SSR技术应用的要求。

总之，利用SSR标记鉴定玉米品种亲子关系具有可行性和高精度，能够有效改善玉米作物的育种工作。

未来，这种技术将持续发展，会为育种和遗传研究带来更多机会和收获。

SSR标记在玉米研究中的应用研究进展SSR标记是短串重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）的标记，也叫微卫星标记。

SSR标记在玉米研究中具有广泛的应用价值，因为它具有高度多态性、稳定性、可重复性等特点，已经成为了描绘遗传多样性、构建遗传图谱、探讨种质资源开发利用方向等方面的主要工具。

一、SSR在遗传多样性分析方面的应用SSR标记已成为了玉米遗传多样性分析的主要手段之一，因为它具有高度多态性和稳定性。

随着SSR技术的发展，越来越多的SSR标记被应用于玉米遗传多样性分析中，已经被广泛应用于各种不同品种和种群的遗传多样性分析。

通过SSR标记的应用，可以描绘玉米的遗传多样性分布、不同品种之间的遗传差异等，为玉米的保护与发展提供了有力的基础支撑。

构建遗传图谱是研究玉米遗传进化和遗传多样性的重要手段，也是探究玉米品种间亲缘关系的重要途径。

SSR标记的高度多态性、可重复性和稳定性，使其成为构建玉米遗传图谱的重要工具。

在构建玉米遗传图谱的过程中，SSR标记提供了一种快速而容易的方法，可以高效地确定基因的遗传距离和亲缘关系，从而为进一步的玉米种质资源开发提供基础支撑。

三、SSR在玉米品种分类中的应用SSR标记可以描绘不同品种之间的遗传差异，为玉米品种分类提供了有力的支撑，使其成为了玉米品种鉴定的重要工具。

通过SSR标记的分析，可以鉴别出不同品种之间的遗传差异和亲缘关系，进而为玉米品种分类提供参考，从而指导玉米种质资源的保护和留种。

种质资源是作物育种研究的基础，SSR标记可以描绘不同品种之间的遗传差异与亲缘关系，为种质资源的鉴定、保护和开发提供了重要的手段。

SSR标记在玉米种质资源开发与利用中的应用，具有以下几个方面的特点：（1）种质资源的鉴定和鉴别。

通过SSR标记分析种质资源的遗传差异和亲缘关系，可以确定不同品种或不同来源的种质资源的遗传差异和亲缘关系，为玉米育种研究提供了基础数据。

（2）新品种的创制和筛选。

玉米品种鉴定技术规程 ssr标记法玉米（Zea mays L.）是世界上最重要的粮食作物之一，具有广泛的生态适应性和经济价值。

为了满足农业生产的需求和科学研究的需要，科学家们开发了多种玉米品种，并针对其进行了鉴定和分类。

其中，SSR标记法是一种常用的玉米品种鉴定技术规程，本文将重点介绍该技术规程的原理和步骤。

SSR（Simple Sequence Repeat）标记法是一种基于已知序列的重复单元寻找多态性位点的分子标记技术。

其原理是利用多态性位点的存在或不存在来鉴定不同的品种。

在玉米品种鉴定中，研究人员根据SSR标记法的原理，选取一些具有丰富多态性的SSR标记位点，通过PCR扩增和凝胶电泳等技术手段，检测和分离出目标位点，并根据目标位点的存在与否来判定玉米品种。

玉米品种鉴定的具体步骤如下：1. 提取玉米DNA：玉米DNA的提取是进行SSR标记法鉴定的关键步骤。

通常采用的方法是将玉米叶片或种子样品经过粉碎处理，使用提取试剂将DNA从细胞中分离出来。

2. PCR扩增：PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种通过体外合成技术快速扩增特定DNA片段的方法。

在玉米品种鉴定中，选择目标SSR标记位点进行PCR 扩增，采用合适的引物组合和PCR条件，使目标位点得到特异性扩增。

3. 凝胶电泳：凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，用于分离和鉴定扩增产物。

将PCR扩增产物与DNA分子量标记物一同加载到琼脂糖凝胶孔中，施加电场后，根据扩增产物的大小，观察和记录目标位点的迁移距离。

4. 结果分析：通过观察凝胶电泳图像，可以判断目标位点的存在与否以及不同品种之间的差异。

如果目标位点在某个品种中存在，而在其他品种中不存在，则可以判定该品种具有独特的SSR标记，从而进行鉴定和分类。

SSR标记法作为一种快速、准确、可重复的玉米品种鉴定技术规程，广泛应用于玉米遗传育种和种质资源保护等领域。

它不仅可以用于鉴定玉米品种的纯度和纯度保持，还可用于种质资源的评价、亲源分析和遗传多样性研究等方面。

SSR标记在玉米研究中的应用研究进展SSR（Simple Sequence Repeats）是一类分子标记，在玉米研究中被广泛应用于遗传多样性分析、种质资源评价、亲缘关系确定、基因定位与连锁图构建、优良品种选育等方面。

随着分子生物学、生物信息学和基因组学等领域的快速发展，SSR标记的应用也得到了不断加强和拓展。

一、遗传多样性分析遗传多样性是指种群或个体间基因型和表型的差异程度。

通过SSR标记的多态性分析，可以准确测定玉米种质资源的遗传多样性水平，评估品种的亲缘关系，为玉米育种提供依据。

通过分析遗传多样性，可以发现不同地理分布的玉米亚种之间的遗传差异，从而为玉米的种质创新和种质改良提供理论指导。

二、新品种选育在玉米育种中，新品种的选育需要对大量的种质资源进行筛选和评估。

SSR标记可以帮助鉴定表现良好的亲本，加速杂交配制和品质改良过程。

通过SSR标记与目标性状之间的关联分析，可以筛选出与特定性状相关的分子标记，缩短选育周期，提高选育效率。

SSR标记也可用于品种纯度鉴定和品种保护。

三、基因定位与连锁图构建SSR标记常用于基因定位和连锁图构建，有助于了解玉米基因组结构和基因座间的遗传距离。

通过标记与性状的关联分析，可以找出与目标性状相关的分子标记，进而鉴定和定位相应的基因。

SSR标记的高度多态性和均匀分布特性，为构建高密度的连锁图提供了可靠的工具，促进了玉米的分子遗传学研究。

四、种质资源评价SSR标记可以帮助对玉米种质资源进行鉴定和评价。

通过遗传多样性的分析，可以评估遗传资源的丰富性和多样性。

通过SSR标记的分析，可以揭示种质资源中的关联关系和遗传背景，为玉米育种提供合适的亲本材料和育种策略。

SSR标记在玉米研究中有着广泛的应用。

通过对遗传多样性的研究，可以了解玉米种质资源的多样性和遗传背景，为玉米育种提供理论依据。

通过与目标性状的关联分析，可以筛选出与特定性状相关的分子标记，加速选育过程。

通过基因定位和连锁图构建，可以了解玉米基因组结构和基因座间的遗传距离。

ssr分子标记技术及其在玉米种子鉴定上的应用随着现代农业的发展，种子质量的鉴定变得越来越重要。

其中，分子标记技术成为了种子鉴定的重要手段之一。

SSR分子标记技术是一种基于DNA序列多态性的分子标记技术，具有高度的稳定性、可重复性和高度的信息含量。

本文将介绍SSR分子标记技术及其在玉米种子鉴定上的应用。

一、SSR分子标记技术的基本原理SSR分子标记技术是基于DNA序列上短重复序列的多态性而开发的一种分子标记技术。

这些短重复序列通常为2-6个碱基的重复序列，如ATATAT、AGAGAG等。

在不同个体中，这些短重复序列的重复次数和排列方式不同，因此可以用作分子标记。

SSR分子标记技术的基本原理是：首先从待分析的DNA样品中提取出DNA，并使用PCR技术扩增出含有SSR位点的DNA片段。

然后，利用电泳技术将扩增出的DNA片段分离出来，并通过染色体特异性的显色剂进行染色。

最后，通过比较不同个体的DNA条带图谱，确定不同个体之间的遗传差异。

二、SSR分子标记技术在玉米种子鉴定中的应用SSR分子标记技术在玉米种子鉴定中的应用主要体现在以下几个方面：1.玉米品种的鉴定SSR分子标记技术可以通过比较不同玉米品种的DNA条带图谱，确定不同品种之间的遗传差异。

这种方法比传统的形态学鉴定方法更为准确和可靠。

2.杂交种子的鉴定杂交种子是由不同品种的玉米杂交而成的，因此杂交种子的遗传背景比较复杂。

使用SSR分子标记技术可以快速准确地鉴定杂交种子的亲本品种，有助于杂交育种的进展。

3.种子纯度的鉴定种子纯度是指种子中所含的杂质和其他品种的比例。

使用SSR分子标记技术可以准确地鉴定种子的纯度，有助于保证种子的品质和纯度。

4.种子存储的鉴定种子存储过程中，可能会发生一些突变和遗传变异，从而影响种子的品质和纯度。

使用SSR分子标记技术可以快速准确地鉴定种子存储过程中的遗传变异，有助于提高种子的品质和纯度。

三、SSR分子标记技术在玉米种子鉴定中的应用案例1.玉米品种的鉴定一项研究使用SSR分子标记技术对中国南方地区的20个玉米品种进行了鉴定。

SSR标记在玉米研究中的应用研究进展吴子温路运才*（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，黑龙江哈尔滨150080）摘要：简单重复序列作为第二代分子标记技术，在农作物分子辅助育种、种质资源鉴定等方面得到了广泛的应用。

该文介绍了SSR标记引物开发及其原理，并对SSR标记在玉米种质资源遗传多样性分析、DNA指纹图谱构建、杂交种种子纯度鉴定以及杂种优势种群划分等方面的应用进行了综述，旨在为推进精准育种、缩短育种周期等提供参考。

关键词：玉米；简单重复序列；分子标记；标记辅助育种中图分类号S513文献标识码A文章编号1007-7731（2020）（02-03）-0013-04当前，玉米作为粮饲兼用型作物在农业生产中发挥了不可取代的作用，并在饲料、工业等方面也有一定的应用［1-2］。

截至2012年，我国玉米总产量超过了谷类产量，成为我国第一大粮食作物。

而当前，我国玉米遗传育种仍是以传统常规育种为主，这种育种方式主要依据表型性状的观察，容易受到外界因素的影响。

近年来，随着B73、Mo17等骨干玉米自交系基因组序列的公布，SSR等分子标记技术在玉米遗传育种方面得到了广泛的应用［3］。

1SSR引物开发随着引物开发软件的不断更新，不同物种引物设计的软件各不相同。

在玉米引物开发上常用软件有Prim⁃er5.0、Oligo7、DNAsis等。

NCBI、MaizeGDB等网站的BLAST选项中找到候选引物的原始序列，通过原始序列可对候选引物重新设计。

引物设计的原则：候选引物长度最好在15~30、碱基的分布应符合随机性、候选引物序列中不可出现互补序列。

现如今，MaizeGDB已经公开的玉米SSR引物约有2000对。

SSR核心序列引物的来源有以下3个：（1）利用SSR序列两翼的保守序列，在基因文库中搜索选择出所需引物序列；（2）微卫星富集法［4］；（3）利用计算机软件对核苷酸数据库中选择的引物进行引物设计。

对所获得的引物用PCR进行扩增，所扩增出来目的片段的长短，取决于引物重复单元的重复次数。