枯草芽孢杆菌_淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达及其产物的分泌

枯草芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达及分离纯化摘要：以枯草芽孢杆菌（B.subtilis HN503）的基因组 DNA 为模板,运用PCR法克隆α-淀粉酶基因,并转化大肠杆菌进行异源表达。

SDS-PAGE鉴定产物及通过离子交换柱和凝胶层析分离纯化，PAGE进行纯度鉴定。

1．立项依据与研究内容1.1项目的立项依据1.1.1α-淀粉酶及其应用α- 淀粉酶(α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中，其国际酶学分类编号为 EC.3.2.1.1，是一种重要的淀粉水解酶。

它以随机作用方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1,4 葡萄糖苷键,产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取，而工业中主要应用的是真菌和细菌α- 淀粉酶。

目前，α- 淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶[1]。

α- 淀粉酶在淀粉工业中的应用。

α- 淀粉酶现已广泛的应用于淀粉糖的生产, 主要用于淀粉的糖化和液化，其水解产物如葡萄糖和果糖有着高甜度，被广泛用于饮料工业中软饮料的甜味剂。

在冷饮制作中，由于淀粉糊具有老化的物理性质，低温静置会形成不溶性的硬性凝胶块，影响冷饮的质量及口感。

α-淀粉酶的加入，能很快将淀粉水解到糊精和低聚糖范围大小的分子,使料液粘度急速降低，流动性增高,从而保证了高淀粉冷饮的质量,使其在口感上更适合于人们的需要。

工业生产中, 淀粉的液化是将α- 淀粉酶先混入淀粉乳中，加热，淀粉糊化后进行液化[2-3]。

α- 淀粉酶在焙烤工业中的应用。

α-淀粉酶作为一种安全、高效的改良剂,多用于面制品行业,适量的α-淀粉酶可改良面包品质,用于面包工业[4]。

α- 淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大, 纹理疏松; 提高面团的发酵速度;改善面包心的组织结构, 增加内部组织的柔软度; 产生良好而稳定的面包外表色泽; 提高入炉的急胀性; 抗老化, 改善面包心的弹性和口感; 延长面包心储存过程中的保鲜期[5]。

枯草芽孢杆菌降解淀粉的原理
枯草芽孢杆菌降解淀粉的原理是通过分泌胞外淀粉酶将淀粉分解为小分子有机物，进而被吸收到细胞内。

在细胞内，这些小分子有机物通过呼吸作用被彻底分解为无机物。

具体来说，枯草芽孢杆菌能够产生一种生理性细菌，这种细菌能够直接发酵淀粉，将其分解为短链脂肪酸和气体。

这个过程中，淀粉被分解为一种类似于营养细胞壁的纤维，这些纤维将淀粉营养物质包围在细胞壁内。

部分纤维可溶解于水并产生粘性物质，这些粘性物质抑制动物的正常消化功能，妨碍动物吸收营养。

然而，当这些纤维被去除后，营养物质就能从细胞壁里释放出来，从而提高代谢能和蛋白质的利用率。

此外，酵母作为单细胞生物，在操作和生产上具有细菌表达系统的特点，同时也具有真核细胞对翻译后蛋白的加工及修饰过程。

酵母细胞壁中的β-葡聚糖和甘露糖醇可以与淀粉分子中的葡萄糖基团结合，使其酶解，从而进一步促进淀粉的降解。

总之，枯草芽孢杆菌降解淀粉的过程是一个复杂的生物化学过程，涉及到多种酶和代谢途径的协同作用。

嵌合信号肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌作者：张春晓冉从国徐志斌王丽丽来源：《河北科技大学学报》2023年第05期文章编号：1008-1542（2023）05-0485-08摘要：.为提高α-淀粉酶的分泌效率，将不同天然信号肽的N，H和C区进行组合，以期筛选出优于天然信号肽的嵌合信号肽。

首先从天然信号肽库中筛选了适合解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中分泌的天然信号肽，以其中4种天然信号肽（SPyvcE，SPyoqM，SPBglS和SPyobB）的H区替换信号肽SPsacB的H区，构建4种嵌合信号肽RSP1—RSP4指导α-淀粉酶的基因工程菌株。

结果表明，适合α-淀粉酶的最适天然信号肽和嵌合信号肽分别为SPyoqM和RSP1，且RSP1指导α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌的分泌效率较SPyoqM提高27%，较具有相同H区的SPyvcE提高了3.6倍，较仅H区不同的SPsacB提高了2.07倍。

嵌合信号肽构建策略是一种有效提高α-淀粉酶分泌效率的方法，可为其他蛋白质的高效分泌提供参考。

关键词：基因工程；α-淀粉酶；枯草芽孢杆菌；信号肽；疏水区中图分类号：Q789文献标识码：ADOI：10.7535/hbkd.2023yx05007收稿日期：2023-08-01；修回日期：2023-09-03；责任编辑：卢琼基金项目：河北省重点研发计划项目（21372802D）第一作者简介：张春晓（1971—），女，河北安国人，副教授，博士，主要从事酶工程及微生物代谢工程方面的研究。

通信作者：王丽丽教授。

E-mail：****************张春晓，冉从国，徐志斌，等.嵌合信号肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌［J］.河北科技大学学报，2023，44（5）：485-492.ZHANG Chunxiao， RAN Congguo， XU Zhibin， et al.Improvement of α-amylase secretion in Bacillus subtilis by chimeric signal peptide［J］.Journal of Hebei University of Science and Technology，2023，44（5）：485-492..Improvement of α-amylase secretion in Bacillus subtilisby chimeric signal peptideZHANG Chunxiao， RAN Congguo， XU Zhibin， WANG Lili（School of Food and Biology， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang，Hebei 050018， China）Abstract：The chimeric signal peptides superior to natural signal peptides were constructed based on the N，H and C regions of different natural signal peptides to improve the α-amylase secretion in Bacillus subtilis. Through screening the natural signal peptides library， several optimal natural signal peptides were selected for Bacillus amyloliquefaciens α-amylase secretion in B.subtilis. The H region of signal peptide SPsacB were replaced by H region of four natural signal peptides （SPyvcE，SPyoqM， SPBglS and SPyobB） to construct four different chimeric signal peptides （RSP1 to RSP4）applied in α-amylase genetic engineering strain. The results show that the most suitable natural and chimeric signal peptides for α-amylase were SPyoqM and RSP1， res pectively. The α-amylase secretion efficiency guided by RSP1 was 27% higher than that by SPyoqM， 3.6 times higher than that by SPyvcE which has the same H region with RSP1， and 2.07 times higher than that by SPsacB which has the same N and C region but different in H region. The chimeric signal peptide construction strategy is effective for α-amylase secretion in Bacillus subtilis， which provides guidance for efficient secretion of other proteins.Keywords：genetic engineering; α-amylase; Bacillus subtilis; signal peptide; hydrophobic region重组蛋白对工业、医疗保健和可持续的生物经济发展具有重要意义，因此，建立高质、高量蛋白质高效生产平台很有必要[1]。

枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种在垃圾堆、陆地和淡水中常见的细菌，它可以合成淀粉酶，参与食品加工和制药等领域。

为了深入研究芽孢杆菌产淀粉酶的机制，本文旨在克隆和表达枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因，为今后的更深入研究奠定基础。

研究中，我们首先从枯草芽孢杆菌的形态学特性中确定菌株，然后利用定点突变技术，以外源基因引入枯草芽孢杆菌，以达到调控基因表达的目的。

实验中，通过对枯草芽孢杆菌分离介质DNA的提取、限制性内切酶扩增以及后续的PCR扩增，我们能够从大量杂合DNA中克隆出淀粉酶基因的片段，然后进行终止密码子转录、酶切以及连接方面的实验，最终可以将淀粉酶基因克隆入宿主细菌质粒中，从而表达淀粉酶蛋白。

经过蛋白质免疫印迹分析，可以看到从枯草芽孢杆菌中克隆和表达的具有淀粉酶功能的蛋白质，在不同pH条件下具有较强的淀粉水解能力，与未经克隆表达的芽孢杆菌菌株相比，淀粉酶产量有了显著提高。

基于以上结果，我们总结出了枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达的技术方案，为今后的深入研究提供基础，也为特定乳酸菌淀粉酶防护剂的研发提供参考价值。

本文通过介绍枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达，探索了枯草芽孢杆菌淀粉酶的分子机制，证明了定点突变技术对淀粉水解能力的增强作用，为淀粉酶的进一步研究提供了可靠的技术手段。

未来，
我们将借助于新的基因技术等技术平台，进一步深入研究芽孢杆菌淀粉酶的功能、结构和稳定性，以期能更好地利用该酶的乳化作用，为食品加工和药物制造等领域提供支持。

a-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达耐高温a-淀粉酶是食品工业中应用最普遍的酶种之一,广泛应用于啤酒、酒精、味精及淀粉工业等领域[1]。

其适用pH范围为6~7,在酸性条件下其酶活明显降低,不能满足酸性条件下淀粉原料深加工工艺的要求,因此对耐酸性a-淀粉酶的需求日益上升。

20世纪90年代以来国外已陆续有耐酸性a-淀粉酶的研究报道[2,3]。

而我国的a-淀粉酶品种较单一,目前还未见相关报道。

枯草芽孢杆菌由于其安全性和分泌胞外蛋白的特点,被认为是表达和分泌异源蛋白的理想受体[4]。

但外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达水平一般比大肠杆菌低,原因之一是由于枯草芽孢杆菌可向胞外分泌高浓度的蛋白酶,以致影响了表达产物的稳定性。

而DB403是三蛋白酶缺陷菌株,有助于提高分泌蛋白的稳定性。

另外某些外源基因的表达产物对宿主存在一定的毒害作用。

构建诱导型分泌表达系统可将宿主菌的生长与外源蛋白的表达两个过程分开,是克服这个问题的重要途径之一。

芽孢杆菌的sacB基因编码果聚糖蔗糖酶,此胞外酶的表达受蔗糖诱导[5]。

本研究中将地衣芽孢杆菌的耐高温a-淀粉酶基因进行耐酸性改造,利用获得的sacB基因的启动子-信号肽序列(称为sacR)构建诱导型分泌表达载体,并实现了在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

为耐酸性a-淀粉酶的工业化生产奠定了基础。

1 材料与方法1.1 菌株和质粒E.coli菌株BL21(De3),JM109,Bacillussub2tilisDB403(HisnprR2,npre18aprA)由本实验室保存;质粒peT-22b,购自NOVAGeN公司(含T7启动子的高效表达载体);大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBe2,由天津大学赵学明教授惠赠;质粒pSA60含有枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子信号肽序列,由中山大学罗进贤教授惠赠;质粒peTAM含有地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因,由本实验室构建。

peTAM是由peT-22b的上游和下游分别被NdeI和HindIII酶切后与经同样双酶切的a-淀粉酶基因连接构建而成。

芽孢杆菌β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
王为先;张沁;申同健
【期刊名称】《遗传学报：英文版》
【年(卷),期】1993(20)4
【摘要】本工作采用新设计的营养缺陷型淘汰筛选法,从本实验室筛选的芽孢杆菌Bacillus R2中分离到能够水解生淀粉的β-淀粉酶基因。

该基因所在的DNA片段
为5.25kb,在大肠杆菌(E.coli)中的表达产物具有与供体菌相同的淀粉酶特性,实验
室条件下酶产量为500IU/ml以上,RDA值为57%,并且可以全部分泌到培养基中。

【总页数】7页(P374-380)
【关键词】β-淀粉酶;基因克隆;芽孢杆菌
【作者】王为先;张沁;申同健
【作者单位】中国科学院化工冶金研究所生化工程室;中国科学院生物物理研究所【正文语种】中文
【中图分类】Q939.110.3
【相关文献】
1.地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 潘风光;宋德群;任洪林;艾永兴;柳增善
2.地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌[J], 李金霞;蔡恒;路福平;杜连祥
3.地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达 [J], 蔡恒;陈忠军;
路福平;杜连祥
4.产β-淀粉酶菌株的筛选及β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 [J], 李猛;陈利飞;杨建楼;马春玲
5.嗜热脂肪芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达 [J],
N.Tsukagoshi;李尔炀
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蛋白分泌表达,枯草芽孢杆菌来表达Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】枯草芽孢杆菌，学名Bacillus subtilis，是一种被广泛应用于工业生产的革兰氏阳性细菌。

与大肠杆菌不同，枯草芽孢杆菌没有外层膜，分泌的蛋白能直接释放到培养基中，是一种理想的原核蛋白分泌表达菌株。

那么作为一种潜能巨大的原核表达系统，它究竟强在哪些方面呢？且让AtaGenix为您一一道来。

枯草芽孢杆菌的安全性是食品级的，收录于FDA的GRAS菌中，欧洲食品安全局认为枯草芽孢杆菌可用于食品发酵。

很多常用食品工艺中都能见到它的身影。

与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌的细胞壁组成简单，只含肽聚糖和磷壁酸，在分泌的蛋白质产品中不会混杂有类似革兰氏阴性菌细胞壁成分中的热源性脂多糖（内毒素）等物质。

该表达系统用于药用蛋白的表达纯化时还可省掉去除内毒素这一步。

同为原核生物界的明星，虽然大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都只需短时间就可表达和积累大量目标蛋白。

但大肠杆菌在后续发酵工艺中需要对收集的菌体进行破胞处理，而枯草芽孢杆菌得益于其本身所拥有的一套高效分泌信号肽及分子伴侣系统，只要简单处理发酵上清就能得到较纯的蛋白，并且表达的蛋白在多数情况下具有天然构象和生物活性。

蛋白质组学研究表明，枯草芽孢杆菌中至少有四种蛋白质分泌途径，其中Sec 分泌途径是主要分泌途径。

另外枯草芽孢杆菌拥有良好的发酵生产技术，目前大部分商业化的蛋白水解酶和淀粉酶都是由其发酵得到的。

AtaGenix拥有的 5 L、20 L、150 L及其他型号的发酵罐（上图就是真相），可满足各种大规模发酵的需求。

虽然枯草芽孢杆菌表达外源蛋白潜力无限，但也有其短板，如自身胞外蛋白酶对表达产物的降解、遗传操作相对困难、外源蛋白有时得不到有效的表达等等。

但AtaGenix却能成功避免以上问题使外源目标蛋白在枯草芽孢杆菌表达系统中有效表达，这主要得益于以下三个方面的优势：①丰富的表达宿主由于枯草芽孢杆菌没有明显的密码子偏爱性，表达外源蛋白时无需对DNA序列进行优化。

枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究-回复枯草杆菌生产α淀粉酶的研究引言：淀粉是一种由葡萄糖分子组成的多聚体，是植物细胞中最重要的储能物质。

为了有效地利用淀粉，许多微生物产生了淀粉酶。

淀粉酶能够水解淀粉成为可被微生物利用的单糖，其中α淀粉酶是将淀粉水解成麦芽糖或是葡萄糖的主要酶类之一。

而枯草杆菌是一种广泛存在于土壤中的细菌，在许多领域都具有潜在应用价值。

本文将探讨枯草杆菌生产α淀粉酶的研究目的、方法、结果和展望。

目的：本研究的目的是通过培养枯草杆菌，使其表达α淀粉酶，以探索其在产业应用上的潜力。

方法：1. 枯草杆菌菌种的筛选：从不同的土壤样本中筛选出具有较高淀粉酶产量的枯草杆菌菌株；2. 培养基的优化：对枯草杆菌菌株进行不同培养基的筛选和优化，以提高淀粉酶产量；3. 发酵条件的优化：调节发酵条件，包括温度、初始pH、培养时间和淀粉浓度，进一步提高淀粉酶活性；4. α淀粉酶的提取和纯化：通过离心、过滤、浓缩和柱层析等技术，将淀粉酶从菌体中分离提取，并进行纯化。

结果：通过以上的实验步骤和优化条件，我们成功获得了一株高产α淀粉酶的枯草杆菌菌株，并获得了较高的淀粉酶产量。

实验结果表明，枯草杆菌在适宜的发酵条件下能够表达和产生大量的α淀粉酶。

展望：虽然本研究已经取得了一定的成果，但仍然存在一些挑战和改进的空间。

首先，我们可以进一步优化发酵条件，以提高淀粉酶产量。

其次，可以通过基因工程手段改良枯草杆菌的基因组，提高其淀粉酶产量和活性。

此外，可以进一步研究α淀粉酶的性质和机制，以在其应用领域发挥更大的作用。

结论：本研究通过对枯草杆菌的研究，成功实现了α淀粉酶的生产。

这为淀粉酶的产业化应用提供了新的途径和可能性。

枯草杆菌生产α淀粉酶具有较高的生物安全性和可行性，且可以通过合理优化发酵条件和基因工程手段，进一步提高产量和活性。

通过深入研究淀粉酶的性质和机制，有望在食品加工、饲料行业和生物能源领域等方面发挥重要作用。

总结：枯草杆菌是一种潜在的产α淀粉酶的微生物菌株。

大麦β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的异源表达朱培;李崎;朱林江;贺鹏宇;李永仙【摘要】大麦来源的β-淀粉酶具有稳定性高和工业应用效果好的优点,被广泛应用于食品、酿造以及粮食加工,但是其制备成本高,价格较昂贵.该研究使用大肠杆菌异源表达大麦来源的β-淀粉酶.首先通过基因合成技术获得密码子优化的大麦来源的β-淀粉酶基因,将该基因通过质粒pET28a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达获得重组β-淀粉酶.其次,对重组表达的β-淀粉酶和大麦中直接提取的β-淀粉酶进行酶学性质比较分析.结果表明,重组表达的β-淀粉酶其分子质量大小与大麦中β-淀粉酶一致,即59 kDa,重组的β-淀粉酶比酶活由大麦来源的588 U/mg降为285.5 U/mg,最适作用温度降低了10℃,最适pH保持一致.所以,大麦β-淀粉酶能够在细菌中高效表达,但是其酶学性质发生较大改变.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2016(042)006【总页数】5页(P31-35)【关键词】大麦;β-淀粉酶;异源表达;大肠杆菌【作者】朱培;李崎;朱林江;贺鹏宇;李永仙【作者单位】江南大学酿酒科学与工程研究室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;;;江南大学酿酒科学与工程研究室,江苏无锡,214122【正文语种】中文淀粉酶是水解淀粉和糖原的一类酶的总称，主要存在于动物、植物以及微生物中[1]，一般作用于可溶性淀粉、糖原、α-1,4-葡聚糖等，水解其中的α-1,4-糖苷键。

根据氨基酸序列的同源性，分属糖苷水解酶类的14族[2]。

根据淀粉酶对淀粉的不同催化水解方式，可将其分为4种淀粉酶，即α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和脱支酶。

其中β-淀粉酶，又称α-1,4-葡聚糖麦芽糖水解酶(EC3.2.1.2)，是一种外切型淀粉酶。

它从淀粉的非还原性末端开始，依次切开间隔的α-1,4糖苷键，生成麦芽糖和β-极限糊精[3]，其在啤酒酿造、糖浆制造、纺织与医疗中具有重要应用[4-5]。

枯草杆菌生产α-淀粉酶摘要：α-淀粉酶广泛应用于生产生活的各个方面，并且枯草杆菌生产技术也已经拥有相当成熟的工业生产线。

但随着社会的发展，对α-淀粉酶的生产也提出来更高的要求。

本文着重介绍枯草杆菌生产α-淀粉酶生产流程以及最新的最新研究进展。

关键词：枯草杆菌α-淀粉酶基因工程菌筛选1、α-淀粉酶：1.1理化性质：米黄色、灰褐色粉末。

能水解淀粉中的α-1，4,葡萄糖苷键。

能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶。

作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度为60~70℃，作用pH 值范围 5.5~7.0，最适pH 值为6.01.2化学性质：α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。

2、枯草芽胞杆菌：2.1细胞及菌落形态：枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。

单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

2.2产α-淀粉酶机制2.2.1机制一：枯草杆菌含有α-淀粉酶基因，通过基因的转录表达可以产生α-淀粉酶。

为了提高枯草杆菌的产酶能力，物理方法(射线和紫外线等)和化学方法(亚硝酸胍)常被用于诱变育种，其产酶能力提高一般5—6倍。

2.2.2机制二：利用基因工程的手段将枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因导入基因工程菌内并得到表达，提高产酶能力。

3、α-淀粉酶工业生产流程：3.1菌种的初筛复筛及优化3.1.1初筛：将土壤样品10g放入带有玻璃珠盛有100ml无菌水的三角瓶中。

(此文档为word格式，下载后您可任意编辑修改！) 实验报告：淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌（amp+）中的表达目录相关背景目前研究情况简略研究步骤相关实验详细介绍实验结果与讨论参考文献1、相关背景1、1淀粉酶1、1、1 淀粉酶的发现和分类淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。

1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。

1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。

淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶类的总称。

现在淀粉酶大致可分为四大类。

第一类α-淀粉酶，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

微生物的酶几乎都是分泌性的。

此酶以钙离子为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α－1，4-链。

因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。

另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。

一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。

按照使用条件α-淀粉酶可以分为中温型，高温型，耐酸耐碱型。

按产生菌不同又可分为细菌、真菌、植物和动物淀粉酶。

第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键，切下的是麦芽糖单位。

β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α－1，4-葡聚糖链。

主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。

对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。

枯草芽孢杆菌，学名Bacillus subtilis，是一种被广泛应用于工业生产的革兰氏阳性细菌。

与大肠杆菌不同，枯草芽孢杆菌没有外层膜，分泌的蛋白能直接释放到培养基中，是一种理想的原核蛋白分泌表达菌株。

那么作为一种潜能巨大的原核表达系统，它究竟强在哪些方面呢？且让AtaGenix 为您一一道来。

枯草芽孢杆菌的安全性是食品级的，收录于FDA的GRAS菌中，欧洲食品安全局认为枯草芽孢杆菌可用于食品发酵。

很多常用食品工艺中都能见到它的身影。

与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌的细胞壁组成简单，只含肽聚糖和磷壁酸，在分泌的蛋白质产品中不会混杂有类似革兰氏阴性菌细胞壁成分中的热源性脂多糖（内毒素）等物质。

该表达系统用于药用蛋白的表达纯化时还可省掉去除内毒素这一步。

同为原核生物界的明星，虽然大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都只需短时间就可表达和积累大量目标蛋白。

但大肠杆菌在后续发酵工艺中需要对收集的菌体进行破胞处理，而枯草芽孢杆菌得益于其本身所拥有的一套高效分泌信号肽及分子伴侣系统，只要简单处理发酵上清就能得到较纯的蛋白，并且表达的蛋白在多数情况下具有天然构象和生物活性。

蛋白质组学研究表明，枯草芽孢杆菌中至少有四种蛋白质分泌途径，其中Sec 分泌途径是主要分泌途径。

另外枯草芽孢杆菌拥有良好的发酵生产技术，目前大部分商业化的蛋白水解酶和淀粉酶都是由其发酵得到的。

AtaGenix拥有的 5 L、20 L、150 L及其他型号的发酵罐（上图就是真相），可满足各种大规模发酵的需求。

虽然枯草芽孢杆菌表达外源蛋白潜力无限，但也有其短板，如自身胞外蛋白酶对表达产物的降解、遗传操作相对困难、外源蛋白有时得不到有效的表达等等。

但AtaGenix却能成功避免以上问题使外源目标蛋白在枯草芽孢杆菌表达系统中有效表达，这主要得益于以下三个方面的优势：①丰富的表达宿主由于枯草芽孢杆菌没有明显的密码子偏爱性，表达外源蛋白时无需对DNA序列进行优化。

在不同宿主中表达时，蛋白表达情况可能有差异。

2021年702微生物真题一、选择题(每题2分)1、一个U型管两侧是两种不同的培养菌液，下列不可能在两个菌种间发生的是（）A.接合B.转导C.转化D.回复突变2、下列只能发生在原核生物的有()。

A.阻尼B.诱导C.阻遏3、下列属于真菌单倍体孢子的有()。

A.子囊孢子B.孢子囊孢子C.担孢子D接合孢子4、下列能产生芽孢的菌种有( )。

A.Streptococcus lactisB.Clostridium acetobutylicumC.Bacillus subtilisD.Bifidobaterim5、下列哪个细菌没有SOD酶（）？A.Escherichia coliB.BifidobaterimC. Bacillus subtilisD.Methanogenus6、Acetobacter aceti的电子传递链在哪个部位?( )？A.cellwall B Cell membrame| C.mitochondrion D.nucleus二、名词解释1、cfu2、aerobic active sludge3、mismatch repair4、competence5、Three-domain system6、mutator gene7、homolatic fermentation8、ascocarp9、group translocation三、问答题1、细菌的革兰氏染色原理和步骤，以及确定染色结果正确的方法。

（10分）2、用3种化学诱变剂来解释自发突变和诱发突变本质上相同。

（15分）3、列举三种防止新冠病毒的传播和感染的方法，并说明其中的微生物学原理。

（15分）4、黄色短杆菌中有关苏氨酸生物合成的部分途径如图，代谢途径中涉及的酶序列和蛋白质空间结构已知，如何用基因工程技术来选育高产苏氨酸菌株。

（15分）5、大肠杆菌在同时有葡萄糖和乳糖的培养基上生长会出现什么现象？用乳糖操纵子模型解释这个现象。

如何利用紫外诱变筛选出能同时利用乳糖和葡萄糖的菌株。

枯草芽孢杆菌生产淀粉酶流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达沈微;俞玲;陈献忠;樊游;王正祥【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2011(037)006【摘要】采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。

重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。

枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。

酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶（BlMa）全部分泌到培养液中。

HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。

对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。

获得优化发酵培养基配方：10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%（NH4）2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。

【总页数】5页(P1-5)【作者】沈微;俞玲;陈献忠;樊游;王正祥【作者单位】江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q939.124【相关文献】1.麦芽糖诱导耐碱性木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 [J], 张云雁;杨明明;周煌凯;段春燕;龚月生2.绿色糖单孢茵麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达 [J], 柳梅梅;谢敏;杨燕芳;刘滔滔;杜丽琴;梁智群;韦宇拓3.转录终止子对麦芽糖淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响 [J], 楼志华4.麦芽糖诱导耐碱性木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 [J], 张云雁;杨明明;段玉兰;周煌凯;段者燕;龚月生5.转录终止子对麦芽糖淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响 [J], 楼志华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基因工程的方法设计大肠杆菌,生产芽孢杆
菌淀粉酶
大肠杆菌为革兰氏阴性菌，细胞壁有细胞质膜，肽聚糖，外膜三层结构。

细胞质膜与外膜之间称细胞周间，外源蛋白从细胞中分泌到胞外的主要障碍在于外膜，在大肠杆菌中带有信号序列的外源蛋白一般能通过细胞质膜进入细胞周间,但通常不能分泌到胞外。

这对基因工程产物的工业化生产不利,所以目前各国都很重视细菌分泌的研究。

我们在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因时,得到一株具有较强分泌能力的亚克隆菌株H150。

其外源基因表达的淀粉酶大部分被分泌到细胞外培养基中。

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验杨仕春2008113130化学与生命科学学院摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。

通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。

关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。

通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。

实验材料和方法一、实验材料：（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）（二）培养基：1、种子培养液葡萄糖1%Tryptone(胰蛋白胨)：1%,Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%,NaCl(氯化钠)：1%调pH7.2若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。

2、产淀粉酶发酵培养液玉米粉 2 .0 %黄豆饼粉1 .5%CaCl 2 0 .02 %MgSO4 0 .02%NaCl 0 .25%K2HPO4 0 .2%柠檬酸钠0 .2%硫酸铵0 .075%Na2HPO4 0 .2 %调节pH 值7 .0（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四）实验仪器离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管二、实验1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。

2、种子斜面及种子液准备–A. 挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。

–B. 将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（100KPa 20min ）。

枯草芽孢杆菌分解有机质的产物
枯草芽孢杆菌是一种好氧异养菌，具有丰富的酶系，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶等。

这些酶能够强烈地分解有机物，例如多糖、蛋白质等。

枯草芽孢杆菌能够利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

在污水处理中，由于其繁殖速率较快，极易形成优势种群，并且由于其具有芽孢的特质，使得其抗冲击能力非常突出。

然而，枯草芽孢杆菌的缺点是无法分解复杂的、水溶性差的有机物，因此，一般只用于河道、市政、生活等污水的处理。

以上内容仅供参考，如需更准确的信息，建议查阅生物学或环境科学领域的专业书籍或咨询相关专家。

枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达李海军;王林刚;王治泽;陈芳;高剑峰【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)003【摘要】借助生物信息学对已克隆的枯草杆菌脂肪酶LipB2全长基因序列进行比对分析.结果显示该脂肪酶基因全长635 bp,编码包括31个氨基酸分泌型信号肽在内的211个氨基酸,与NCBI GenBank中已报道的枯草杆菌属脂肪酶核苷酸序列有94.0%的一致性.将该基因克隆到pET-28a(+)表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用枯草杆菌脂肪酶的信号肽序列进行了分泌表达.SDS-PAGE电泳显示分泌表达的脂肪酶分子质量约为21 kD.对表达条件优化后,在30℃、大肠杆菌菌液OD_(600)值为1 8、乳糖诱导浓度为1 5 mM、摇瓶发酵10 h后大肠杆菌分泌表达26 0 U/mL重组脂肪酶,相比较IPTG的诱导,既实现了脂肪酶的高效表达,又节省了成本.【总页数】6页(P90-94,118)【作者】李海军;王林刚;王治泽;陈芳;高剑峰【作者单位】石河子大学生命科学学院,石河子,832003;石河子大学生命科学学院,石河子,832003;石河子大学生命科学学院,石河子,832003;石河子大学生命科学学院,石河子,832003;石河子大学生命科学学院,石河子,832003【正文语种】中文【相关文献】1.枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 [J], 扈会平;张立全;格根通拉嘎2.大肠杆菌aroG基因在枯草杆菌中的分泌表达 [J], 江培■;施宓;钱志康;闵太善;黄伟达3.枯草杆菌的淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达 [J], 尹清强;韩彪;郑秋红;康相涛4.分泌载体pUS186的构建及地衣杆菌α－淀粉酶基因在枯草杆菌中的表达和分泌[J], 李文清;罗进贤;王红革;张添元5.产嘌呤核苷的枯草杆菌prsA基因在大肠杆菌中的表达 [J], 杜郭君;张一平;王红连;朱晓宏;柏建新;邓崇亮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。