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-46-科学技术创新2019.13易错PCR在酶的非理性设计改造中的应用王希曼陈建华(中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京211198)摘要：易错PCR是蛋白质分子改造非理性设计常用的技术，已被广泛应用于各类酶分子的性质改良。
本文对易错PCR的基本原理及应用优势作了简要阐述，并总结了影响易错PCR效果的关键因素及近年来运用易错PCR技术改善酶的性质方面的研究进展。
关键词：易错PCR;非理性设计淀向进化；蛋白质工程中图分类号:Q55文献标识码:A随着工业生物技术的发展,酶这类高效、专一的生物催化剂在工业生产中愈发显现出其重要作用。
然而酶对复杂环境因素通常十分敏感，天然酶往往不能很好适应体外的化学环境体系，因此常在催化过程中表现出活性低、稳定性差等问题叫天然酶在催化中的种种缺陷使其不能很好地应用于大规模工业生产。
因此，为获得能够满足特定工业应用需要的酶，人们一开始将目光投向对现有酶的分子改造。
在酶的分子改造中策略中，非理性设计策略是运用较为广泛的一种。
本文了介绍了非理性设计中一种较常用的方法：易错PCR 法(error-prone PCR),对影响该方法分子改造效果的因素进行分析并简述了其运用于酶分子改造的近期研究进展。
文章编号：2096-4390(2019)13-0046-021非理性设计策略对蛋白质分子的了解程度不同，酶分子改造通常可以通过理性设计、非理性设计、半理性设计或从头设计等策略来完成。
对于空间结构了解较少的酶蛋白，采用理性设计的改造风险较大。
针对这种情况，酶的非理性设计策略应运而生。
酶的非理性设计又称为定向进化(directed evolution),即在不需明确酶蛋白的结构信息和催化机制的情况下,通过模拟自然进化中出现的随机突变、重组等进化机制，并在后期筛选中定向施压，便可在短时间内获得具有某些特定优秀性能的突变体叫2易错PCR的基本原理易错PCR是非理性设计中的经典方法，其原理(转下页)△/=t\—/5=/1—血+/2 —為+/3—/4+/4—⑦即n-/5=/i+/n+Aii+/i\r⑧为了计算方便,引入参考温度如则A/i、Ani、Ann,Artv 分别为竺、竺、更•、匹撚后带入到⑧式中，可得参考温度A1入2入3入4A,如果将4层介质的平板引入到n层介质的平板，那么多层介质的参考温度为to=Arn1⑸其中△/为多层介质表面两侧的温度之差。
酶的定向进化蒋本国范圣第刘宝全(大连民族学院生物工程系大连 116600)摘要酶的定向进化是发展迅速的重要生物工程技术之一耐酸碱性底物特异性使酶更适于工业应用的重要途径本文综述了酶的定向进化的意义并综述了在最近几年内关键词酶定向进化性质改进Some Progresses of the Directed Enzyme EvolutionJiang Benguo, Fan Shengdi, Liu Baoquan(Dalian Nationalities University, Dalian 116600)Abstract The directed enzyme evolution is one of the important bioengineering technologies that was developed rapidly, it is also the necessary way through which the traits of enzymes½«Ã¸´ß»¯ÓÃÓÚ¹¤ÒµÉú²ú±ØÈ»»áÒý·¢Ò»³¡Ðµıä¸ï[1]酶的定向进化是为满足这种需求而改变酶的结构和性质的有效途径近年发展起来的酶定向进化技术使人们可能开发出天然酶蛋白分子不具备的选择特殊环境极地碱湖及盐湖来源的酶可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要[4]1 酶定向进化的策略与途径蒋本国男副教授2003-03-04收稿1.1 对酶实行定向进化的重要意义天然的生物催化剂存在着无法适应工业化生产中非自然条件的限制经常不能很好地适应环境的转变不稳定性以及苛刻的酶促反应条件酶在活细胞的复杂条件下相反在非水溶液中是活性的(这一点可能在绝大多数生物环境中是不需要的)以及酶能够接受不同的底物(在自然界中不存在的底物)¿Ë·þÕâЩ²»×㵫Óë×ÔÈ»½ø»¯Ïà±ÈÉõÖÁÊÇÊýÖÜ[7]Ò²²»´æÔÚÒ»¸öÄ¿±êø·Ö×Ó¶¨Ïò½ø»¯ÊµÑéÓÐÌض¨µÄÄ¿±ê,要求通过简捷的途径重组等手段得到比较理想的酶功能[8]½«¸Ä±äµÄ»ùÒò¿Ë¡½øÈëÖÊÁ£¸Ä½øøµÄ¿Ë¡±í´ïÔÚ¸ßͨÁ¿É¸Ñ¡Öмø±ðÓëÌôÑ¡¶¨µãÍ»±ä×Ô1980年起用于产生具有增进性质的酶[9]Ô¤²âºÍǶÈëÌØÊâµÄ°±»ùËáµ÷ÕûøµÄÈýά½á¹¹最适温度底物专一性导致具有理想特性的酶的表达大大强化了基因调控的能力再经筛选获得所需的突变株改变反应体系中的Mg2+和dNTPs浓度便可有效的控制所引入的点突变率然后多重这样的小步幅取代变异(每次1»ñµÃÀíÏëµÄø¹¦ÄÜ[11]Ò»ÊÇÏ൱ÂýÈýÊÇÉæ¼°µÄ»ùÒòƬ¶ÎÌ«¶Ì(少于800碱基对)另一种途径是在基因的相对小的区域中定向高水平的随机变异[12]¶¨ÏòµÄ±äÒì¿ÉÄܲúÉúÐµİ±»ùËáÈ¡´úÎï×éºÏÒòΪС²½·ùÈ¡´úÖÐijЩÖмä²úÎï¿ÉÄܲ¢²»ÊÇÓÐÀûµÄ[13]»ò¼Ò×åÖØÅŽø»¯µÄÆæÒì»ùÒò×éÔÚÐòÁпռäÉϱíÏÖ³öºÜ´óµÄ¿çÔ½DNA随机重组称作有性PCR[10]但是与体外方法得到的结果相比其它几种方法如随机前体重组(RPR)[17]随机插入与删除(RID)[19]增长剪截(ITCHY)和DNA随机重组相结合(SCRATCHY)[21]以及交错延伸(StEP)[22]等1.4 成功的酶定向进化的基本要求对成功的定向进化有四个要求(2)这个功能也必须是生物的可行的(4)必须可以针对预期的功能进行快速的筛选[24]ÌØÒìÑ¡ÔñÐÔÌØÕ÷ÍùÍùÄÑÒԸĽø非选择性特征易于改进改进生物功能从不要求的特征或者是对新底物的活性就可以得到较大的改进空间2 酶定向进化研究进展酶的定向进化研究主要集中于改进酶的底物特异性提高热稳定性并用于抗体酶的研究本文择要列举最新的研究结果如下细菌合成生物降解性聚酯聚羟基烷酸酯(PHA)的关键酶方法是集中在PhaC(Ac)基因的一个小的区域中,由易错PCR介导随机突变,然后用聚酯累积方式筛选具有更高活性的酶以谷氨酸取代活性位点上的亲核性半胱氨酸(Cys-161)µ«È´´Ù½øÁ˱û¶þõ£ÍÑôÈ·´Ó¦½øÐÐÓë´Ë¶ÔÓ¦±û°±Ëá¸Ê°±ËáºÍËÕ°±ËáÈ¡´ú°ëë×°±Ëá(Cys-161)对缩合反应不利Zaccolo等[29]对抗生素抗性基因的定向进化并改变了β-内酰胺酶的底物专一性在可以获得两个或多个适当的同类基因的情况下如疱疹单纯病毒1和2的胸腺嘧啶激酶基因的四轮重排后改变了底物的专一性家族DNA重排优于单一基因重排家族DNA重排已经被广泛接受可以用于D-和L-糖并保留了其天然的合成D-唾液酸的活力获得一定成功用一个纈氨酸取代一个活性位点上的谷氨酸对甘油醛活性上升两倍的结果Stemmer等[13]运用DNA体外随机拼接技术对β-内酰胺酶进行改造从中筛选出数百个酶活提高的突变体DNA序列用于下次循环使用E.coli表达体系并使催化活性增加但使用定向进化的方法得到了好几个活性增加5倍以上的突变体硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的耐热菌株HPHmut转化株表现出较高的热耐受力仍然具有可测量的明显的残留活性到82 这个酶仍具有活性分子伴侣以及其它抗热因素存在通过由家族DNA重排得到的2048b-糖苷酶杂交体库的组建检验了杂交体的热稳定性进行了三个循环的筛选１８和20)在70ÆäË®½âÈéÌǵÄÄÜÁ¦·Ö±ðÌá¸ß1.58.6倍[35]Öظ´Á½´Î½ø»¯D-氨基酸酰胺酶值增强约3倍最适温度提高了5V酶的稳定性及催化活性常常剧减提高磷脂酶A的稳定性和催化活性分离出三个具有明显稳定性及催化活性的突变体(SA81%卵磷脂凝胶中实验)ÓëÒ°ÉúµÄø±È½ÏMoore等[38]使用随机突变和筛选从枯草芽孢杆菌蛋白酶E获得了一个突变株Yang等[39]主要使用3个循环的易错PCR及DNA随机重组以及点定向突变大多数可溶性的突变体带有3ËùÓеÄÍ»±äλÓÚ±£ÊØÇøÓòÖ®ÍâÒò´ËÕâЩͻ±äÌå±£ÁôÁËÔ-Óй¦ÄÜÆäÖбàÂëµ°°×ÖʵĻùÒò½øÐÐËæ»úÖØ×齫Ŀ±êµ°°×½Óµ½GFP(绿色荧光蛋白)的N末端GFP才能正常折叠并放出绿光旋光异构选择性是酶的一个最重要的也是难于处理的性质通过随机突变D-乙内酰脲酶的旋光异构选择性发生了反转(从ee D=40%变为ee L=20%)ÖµµÃ×¢ÒâµÄÊÇÐý¹âÒ칹ѡÔñÐԵķ´×ª°üº¬Ò»¸öµ¥Ò»°±»ùËáÈ¡´úµÄ¸ßD-选择性突变体(ee D=90%)也已得到提高拆分能力仅仅经过四代突变就取得了如此巨大的提高经过与热点区域密集突变耦合对应91%ee 和18%的转化率经过三轮DNA 随机重组和筛选对非天然底物1,6-二磷酸果糖2.6 抗体酶的定向进化研究抗体催化剂[42,43](abzymes)一般用过渡态类似物免疫方法产生由Fujii等[44]使用经典的免疫方法完成大多数注意力集中在活性近来的工作利用DNA杂交热力学与重组过程中的退火Sandro等[49]依靠合成的化学信息库利用人结合抗体数据库选择高效率的抗体催化剂并进行定向选择得到的结果显示出芳基磷酸酯酶活性使催化效率改进10倍每个基因中1¶ø¶ÔÓÚ¶¨Ïò½ø»¯Ñо¿¶øÑÔ7个核苷改变(1Daugherty等[50]发展的用于酶的定向进化实验的GeneMorph成套仪器GeneMorph成套仪器是高效创造具有特殊性能的生物催化剂为目的的高通量筛选创造或修饰酶的所有实验中的关键技术提供了测定手性分子中在化学上不活泼的功能基团的新手段这些分析方法适用于微滴定板和高度小型化装置分离具有特殊催化性能的抗体在酶的定向进化方面仍然有许多工作要做如耐热旋光异构选择性等有些酶需要辅助因子或复杂的辅助蛋白究成果尚缺乏处理这些复杂情况的成功方法才能使进化产生多功能酶成为可能高效的生物合成途径将生物催化剂用于工业用途的手段和方法的创新研究也是必要的近年来的研究工作已经取得了非常显著的进展但是要真正达到这一点参考文献[1] W R Cannon, S F Singleton, S J Benkovic. 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-----------------------------------Docin Choose -----------------------------------豆 丁 推 荐↓精 品 文 档The Best Literature----------------------------------The Best LiteratureＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ·综述与专论·２００７年第２期收稿日期：２００６－１０－２５作者简介：王楠（１９８１－），女，硕士，研究方向：食品科学与食品生物技术经过自然界上亿年的发展进化，蛋白质逐渐形成了今天的多种多样的形态。
这些蛋白质适应其自身所处的环境并发挥各自的作用。
其中酶是一种具有催化活性的特殊蛋白质，它在自然界和人类生产、生活中发挥着重大作用。
虽然目前酶的种类很多，但仍无法满足人们的需要，人们想尽办法寻找符合要求的酶。
这主要有两种途径，第一是传统的从环境中分离纯化新酶，但酶的发展进化与其所处环境是密切相关的，有时工业环境与自然环境差别很大，酶极少能进化出适应工业环境的特殊性质，这是就产生了第二个途径，即对现有酶的人工改造。
人工改造的方法有很多，理想的方法是直接将酶分子中某些关键部位的氨基酸进行调整，使其产生理想的宏观性质，但是就目前酶分子结构及催化作用机理研究的程度用于上述理想的改造还是有很大困难的，这个矛盾促使产生了酶分子体外定向进化。
随着人们对自然进化过程认识的不断加深以及分子生物学的迅猛发展，人们已经能够在实验室模拟自然进化机制，在短期内创造出新的酶类。
酶分子体外定向进化是近年来发展起来的一种酶分子改造的新策略，它是根据达尔文进化论，在试管中模拟进化机制，在人工创造的条件下筛选出进化酶类，它可以将自然界需上亿年才能完成的进化缩短至几个月，由于筛选的条件是人为设计的，因此，产生自然界不需要而人类需要的酶也就成为可能。
B-Factor读书报告王彤B-Factor 值，也叫“温度因子”，是另一个描述蛋白质灵活性的指标。
如果说RMSF 反映的是蛋白质的动态灵活性，那么B-Factor 体现的则是蛋白质的静态灵活性。
B-Factor 值是从蛋白质的X 光衍射晶体结构的数据中获得的，它反映了原子的电子层的离散程度。
一个氨基酸的B-Factor 值通过平均组成氨基酸的所有原子的B-Factor 来获得。
B-FITTER 就是这样一个软件，从蛋白质的三级晶体结构中提取原子B-Factor 数据，然后平均，获得所有残基B-Factor 值，以此衡量蛋白质的灵活性。
但在进行蛋白质柔性区域的预测的过程中需要注意，即便同一种蛋白质，从不同的晶体结构中获得的B-Factor值是有所不同的，B-Factor 值跟蛋白质的结晶质量、结构的分辨率有很大的关系。
组成蛋白的氨基酸的B-Factor 值越大，表示该氨基酸对于稳定蛋白的作用越小。
因此将组成蛋白的氨基酸的B-Factor 值进行排序，然后将B-Factor 值高的氨基酸替换为B-factor值低的氨基酸，可以提高蛋白的热稳定性。
具体的操作方法大致分为四种，分别是B-Factor 值与Rosetta design配合确定突变位点与突变氨基酸，B-Factor 值与特殊结构的同源对比确定突变位点与突变氨基酸，B-Factor 值与饱和突变，B-Factor 值与迭代饱和突变。
下面对于四种方法进行详细的介绍：1．B-Factor 与Rosetta designB-Factor 与Rosetta design的结合使用是当前最高效的方法之一，首先计算出组成蛋白质的所有氨基酸的B-Factor值，然后选出B-Factor值最高的氨基酸，将其输入到Rosetta之中，经过Rosetta计算，确定将B-Factor值高的氨基酸突变为何种氨基酸，然后通过定点突变得到突变株。
参考文献：1.Enhancing the Thermostability of Serratia plymuthica Sucrose Isomerase Using·B-Factor-Directed MutagenesisXuguo Duan , Sheng Cheng , Yixin , Jing Wu将沙雷氏菌AS9（AS9 Pal1）的蔗糖异构酶在大肠杆菌BL21（DE3）中表达，在45℃下AS9 PalI的半衰期为20分钟，表明其不稳定。
易错PCR技术在淀粉酶定向进化中的应用易错PCR技术应用于酶体外进化的研究进展沈思军1*，马春萍2，哈杰提2，马全磊1(1. 石河子大学动物科技学院，新疆，石河子，832021；2. 新疆西部牧业股份有限公司，新疆，石河子，832000)摘要：易错PCR技术是通过调整PCR反应条件，产生随机错配而引入多个突变。
由于该技术操作简单易行，广泛应用于酶工程改造研究中。
本文介绍了易错PCR技术的影响因素及近几年在酶工程改造中的应用进展。
关键词：易错PCR技术；影响因素；酶工程改造在体外进行酶分子改造的常用采用分子体外定向进化技术。
常用的方法有易错PCR （error-prone PCR）、DNA重排（DNA shuffling）、交错延伸法（staggered extension process, StEP）、随机引物体外重组（random-priming in vitro recombination, RPR）、易错滚环扩增法（error-prone rolling circle amplification, EP-RCA）、序列饱和诱变（sequence saturation mutagenesis, SeSaM）、随机插入/删除的链交换突变（random insertion/deletion strand exchange mutagenesis, RAISE）等[1]。
基本原理都是通过导入突变获得大量含有不同突变的酶，在不同环境条件下定向筛选有益突变菌株。
易错PCR是通过改变PCR条件，提高扩增产物的三大错配率，从而获得与原来不同的DNA序列或基因[2]，其操作简便易行，成为体外酶工程应用较为广泛的技术之一。
本文就易错PCR 过程中影响突变率的因素和易错PCR技术在酶分子进化中的应用这两个方面，综述国内近几年的研究进展。
1. 影响易错PCR突变率的因素易错PCR技术是结合随机突变与定向筛选，利用Taq DNA 多聚酶不具有3`→5`校对功能的特点，在PCR反应中通过调节离子浓度等方法引入随机突变，在特定培养基或培养条件下定向选择所需酶的方法。
酶体外定向进化技术及其发展酶的定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略，近年来发展迅速。
酶能催化各种各样的化学反应，可使需要几天几个月甚至几年时间完成的转化在几分钟甚至几秒钟内完成，能催化化学方法难以完成的反应，如构象的改变等。
同时，它无毒无害，对环境没有污染，在环境问题日益严重的今天，酶的应用显得至关重要。
1 概述酶的体外定向进化又称蛋白质分子定向进化，是蛋白质工程的新策略。
简单来说，就是在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，在实验室中通过模拟达尔文自然进化过程，让目标酶分子在预先设计好的道路上快速进化，获得有价值的非天然酶。
定向进化是随机突变和选择的结合，随机突变是人为控制某些条件改变而引发的。
后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起选择预期方向的突变、排除其他方向突变的作用，整个进化过程是在人为控制下进行的。
定向突变使在自然选择条件下需几百万年乃至上亿年才能完成的进化过程，缩短到几年、几个月，甚至更短的时间，加速了酶的进化过程。
目前，该方法主要应用于提高酶的稳定性、酶活性、对有机溶剂的耐受性，扩大底物的选择性，改变光学异构体的选择性等方面。
在目前已发现的8 000多种酶中，真正能够进行大规模生产和应用的商品酶并不多，主要原因是天然酶的性质与生产环境，例如高温、高压、有机溶剂、极端pH等的要求相差甚远。
天然酶的底物选择性等性质难以满足对蛋白酶的需求。
酶的定向进化技术是酶工程学研究的有效工具，该技术的发展使酶应用于工业生产成为可能。
2 酶体外定向进化的常用方法2.1 易错（error-prone）PCR易错PCR技术是指采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，比如提高镁离子浓度、加入锰离子等方式改变体系中4种dNTP的浓度等，改变Taq酶的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变构建出突变体库，并从中选择或筛选出所需要的突变体。
由于在实验中仅经过一次易错PCR扩增，所以往往很难得到所需的突变，由此而产生了连续易错PCR扩增技术，即一次PCR获得的扩增基因作为下一次的目的基因进行操作，连续多次进行上述PCR过程，直至获得突变显著的结果基因。
枯草芽孢杆菌淀粉酶定向进化及对玉米粉水解效果的研究摘要：淀粉是一种广泛存在于植物细胞中的高分子碳水化合物，具有丰富的能量和营养。
枯草芽孢杆菌是一种在自然界中广泛存在的产气厌氧菌，可以分解多种有机物质，包括淀粉。
本研究旨在通过淀粉酶的定向进化，提高枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。
1. 引言随着人口的增长和生活水平的提高，对粮食的需求也在不断增加。
利用高效的淀粉水解酶进行玉米粉加工，可以提高淀粉的利用率和食品生产的效益。
2. 方法与材料2.1 枯草芽孢杆菌的培养与体外筛选首先，从自然环境中分离枯草芽孢杆菌，并通过连续传代培养。
然后，制备含有淀粉的琼脂培养基，通过扩展成分筛选培养出具有较高淀粉酶活性的菌株。
2.2 淀粉酶基因的筛选与克隆采用PCR技术，从高淀粉酶活性菌株中扩增出淀粉酶基因。
将扩增的目的基因与表达载体质粒进行连接，并转化到大肠杆菌中进行蓝白斑筛选。
2.3 淀粉酶的定向进化策略通过PCR技术，在淀粉酶基因的特定区域引入随机突变。
然后，选取淀粉酶活性较高的突变体，并继续进行下一轮突变和筛选工作，最终得到活性更高的定向进化淀粉酶。
2.4 玉米粉的水解实验将定向进化淀粉酶转化到枯草芽孢杆菌中，并对其进行培养。
然后，将玉米粉加入到培养基中，利用玉米粉的水解情况评估定向进化淀粉酶对玉米粉的水解能力。
3. 结果与讨论通过筛选和定向进化，我们获得了一株具有较高淀粉酶活性的定向进化淀粉酶。
将该基因转化到枯草芽孢杆菌中，成功提高了枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。
4. 结论本研究通过淀粉酶的定向进化，成功提高了枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。
这为进一步提高玉米粉的利用率和淀粉的加工效益提供了新思路。
5.通过连续传代培养和扩展成分筛选，我们成功获取了具有较高淀粉酶活性的菌株。
通过PCR技术，我们扩增出了淀粉酶基因，并成功将其连接到表达载体质粒上，并进行了蓝白斑筛选。
通过淀粉酶的定向进化策略，我们引入了随机突变，并筛选出了活性更高的突变体。
２０１０Ｎ０．２·９４·ＳｅｒｉａｌＮｏ．２１５ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇＩ衄。
ｖａｔｉ。
ｎａｎｄＫｎ。
、Ⅳ１ｅｄｇｅＴｒ嬲ｓ衔基于易错ＰＣＲ技术的仅一淀粉酶基因的定向进化研究张建云１，谷立坤协，陈红歌２（１．河南工程学院资源与环境工程系，河南郑州４５１１９１；２．河南农业大学生命科学学院，河南郑州４５０００２）摘要：采用基因体外定向进化策略巾易错Ｐｃ刚支术，用碱基类似物５挨脱氧尿苷三磷酸（５．ＢｒｄＵＴＰ）部分取代脱氧胸苷三磷酸（ｄ１１限），对野油菜黄单胞菌的Ｏｔ．淀粉酶基因进行了体外诱变。
通过鉴别培养基进行筛选，得到５个具有高酶活的诱变基因，利用生物学软件ＤＮＡｓｔａｒＮ出发基因序列进行比较，分析了突变位点和酶功能变化的相应关系。
结果显示：基因诱变后酶活的改变主要是由淀粉酶基因空间结构的改变向引起的，而不是由启动了的变化引起的。
关键词：定向进化：碱基类似物；诱变；ａ．淀粉酶基凶中图分类号：Ｑ５５６文献标识码：Ａ文章编号：０２５４—５０７１（２０１０）０２—００９４＿０３Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｖ／ｔｒｏｏｆｏｒ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅｂｙｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲＺＨＡＮＧＪｉａｎｙｕｎｌ，ＧＵＬｉｋｕｎ”，ＣＨＥＮＨｏｎｇｇｅ２（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５１１９１。
Ｃｈｉｎａ；２，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌａｎａｌＵｎｉｖｅｍｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｔｍａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒａｎｄｏｍｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｔ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂａｓｅｄｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲｓｔｒａｔｅｇｙ．５－ＢｒｄＵＴＰｐａｒｔｌｙｒｅｐｌａｃｅｄｎ限ｗｈｅｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔａｒｔｅｄ．Ｂｙｕｓｉｎｇｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ，ｗｅｓｃｒｅｅｎｅｄｆｉｖｅｍｕｔａｔｅｄｇｅｎｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅａｌｉｇｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｇｅｎｅｂｙｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｏｆｔｗａｒｅＤＮＡｓｔａｒ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｍａｉｎｌｙｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅ，ｎｏｔｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ；５－ＢｒｄＵＴＰ；ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ａ－ａｍｙｌａｓｅｄ．淀粉酶（ａｌｐｈａ－Ａｍｙｌａｓｅ）为１，４一仪一Ｄ一葡萄糖苷水解酶，作用淀粉时可从分子内部切开Ｏｔ一１，４键生成小分子糊精和还原糖，产物末端葡萄糖残基Ｃｌ碳原子为仅一构型，故称Ｏｔ．淀粉酶。
ｄ一淀粉酶在动物、植物、微生物【１】中均能产生，但大量生产主要还是靠微生物发酵闭。
微生物中许多种类均能产生饯．淀粉酶，其中有关的属有：Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｐ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｓｐ．Ｔｈｅｌ＂ｍＯＣＯＣＣＵｓｐ．［３１等，从淀粉酶的发现至今ｄ．淀粉酶的种类已越来越多。
ａ一淀粉酶能水解淀粉中的仅一ｌ，４葡萄糖苷键，导致淀粉迅速被液化，可被广泛应用于葡萄糖生产、啤酒酿造、酒精工业、发酵行业问以及纺织行业等。
因此有关仅．淀粉酶的研究也是酶类中最活跃的研究领域之一。
许多研究者通过筛选和育种工作，改变菌种特性，提高丫ｄ一淀粉酶活力，但由于多次使用同种诱变剂，使负变率加大，并且可能发牛平顶效应。
近年来基因一Ｉ：程的飞速发展，为（Ｉｔ一淀粉酶的研究开辟了新的道路［５－６１。
酶分子的定向进化不需要事先Ｊ，解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组、门然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）｝Ｈ所需性质的突变酶１７．８１。
易错ＰＣＲ技术是在采）｜ｊＴａｑ酶进行ＰＣＲ扩增同的毖阗时，通过调整反应条件（如提高酶离子浓度，改变体系中４种ｄＮＴＰ的浓度等），改变Ｔａｑ酶的突变频率，从而向目的基因中以一定频率引入突变，构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。
ＣＨＥＮＫ等［９１用此策略定向进化枯草杆菌蛋白酶Ｅ获催化活性提高２５６倍的突变体。
本研究使用碱基类似物５．溴脱氧尿营三磷酸为诱变剂，利用热稳定性的Ｔａｑ聚合酶不具备校对功能的特点而引入突变，经多轮诱变后，获得５株酶活性显著提高的诱变株。
碱基类似物掺入诱变简便、快捷，成为基因体外定向进化的又一新策略∞。
研究进一步验证了这一方法的可行性，并为研究仅．淀粉酶基因突变位点和酶功能的关系提供了材料，从而为深入研究ｄ．淀粉酶基因的进化和诱变育种打下了基础。
１材料与方法１．１试验材料１．１．１质粒和试剂大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｔｉｃｈｉａｃｏｂ３ＤＨ５０ｔ菌株和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ质粒（２．９６ｋｂ）均ｒｆｌ本实验室保存；含野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ｃｔ一淀粉酶基冈的质粒ＰＨＮＨ００３：南术实验室构建（ｄ一淀粉酶基冈人小为１８０８ｂｐ）；限制性内切酶，Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡｍａｒｋｅｒｓ：均购ｆＩＴａｋａｒａ公叫：ＴａｑＤＮＡ聚介酶、肤ＲＮＡ酶、ｄＮＴＰ、矿油、ＩＰＴＧ、Ｘ—ｇａｌ、ＳＤＳ、ＴＲＩＳ、ＥＢ：购自上海生工生物工程公司。
１．１．２培养基ＬＢ培养基：在９５０ｍＬ去离子水中加入蛋白胨１０９，酵母收稿日期：２００９．１１－０８基金项目：河南省科技厅科技攻关项目（０９２１０２２１０２１２）作者简介：张建云（１９７９．），女，河南南召人，讲师，研究方向为应用微生物技术；谷立坤·，讲师，通讯作者。
创新与借鉴中国酿造２０１０年第２期总第２１５期·９５·提取物５９，ＮａＣＩ１０９，待完全溶解后，用５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调节ｐＨ值至７．０，加入去离子水至总体积ＩＬ，１２１℃、ｌｘｌＯＳＰａ高压条件下蒸气灭菌３０ｍｉｎ。
鉴别培养基ＬＢＳＰ：在ＬＢ培养基的基础．卜添加Ｏ．５％淀粉和０．０１％锥虫蓝。
１．２ＰＣＲ引物的设计试验所用引物是根据本实验室克隆的黄单胞菌一淀粉酶基因的核苷酸序列，由引物设计软件ＰｒｅｍｉｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０辅助设计而成，引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列如下：５’．ＡＡＡＡＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＴＣＡＣＧ—ＧＣＡＴＣ一３’，５’一ＴＡＴＡＱ鱼△！Ｑ￡ＧＣＴＧＡＴＧＴＴＡＣＣＴＡＧ一３’（引物两端分别引入ＫｐｎＩ，ＢａｍＨＩ限制性内切酶切割位点）１．３高效感受态细胞的制备宿主菌Ｅｃｏｌｉ（ＤＨ５００高效感受态细胞的制备参考ＴＡＮＧ）（等【ＩＩ】的方法。
１．４突变库文库的构建利用Ｔａｑ聚合酶不具有校对功能，在ＰＣＲ过程中掺入一定浓度的５．溴尿嘧啶，可引起碱基错配，从而诱发突变。
扩增条件为９４ｃＣ预变性２ｍｉｎ，然后９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸ｌｍｉｎ，３０个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ，使用ＴａｑＤＮＡ聚合酶。
碱基类似物５－ＢｒＵＴＰ的浓度为ｄＮＴＰ的１／１０００。
产物用胶回收试剂盒纯化。
ＰＣＲ产物用两端相应内切酶酶切，载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ经对应内切酶酶切后，产物回收片段在１６％温箱中连接过夜，连接产物转化对应的宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５Ｑ）的感受态细胞，转化产物涂布于将转化培养液涂ｆＬＢ平板（含ＡｍｐｌＯＯｗｇ／ｍＬ、ＩＰＴＧ４０１ｘｇ／ｍＬ、Ｘ—ｇａｌ４０１ｘｇ／ｍＬ上，连续培养１６ｈ即可得到蓝白斑。
这种情况下得到的菌落只能说明其含有外源片段，是否含有所需的仪一淀粉酶基因，还需进一步进行功能鉴定。
１．５Ｏｔ．淀粉酶高阳性转化子的筛选方法采用锥虫蓝和淀粉胶联形成蓝色附合物，在淀粉被淀粉酶水解后，蓝色褪去，在、Ｆ板上出现透明水解圈的原理，可用于Ｏｔ一淀粉酶产生菌的筛选。
当产叶淀粉酶的微生物在牛长时分泌了０【一淀粉酶，挑取平板上透明水解圈直径大的转化子为高酶活转化子【１２】。
把蓝自斑筛选产生的白斑用无菌牙签转点到锥虫蓝淀粉平板卜（ＬＢＳＰ平板），初筛一个平皿卜（直径９０ｍｍ）可以点１５～２０个菌落。
３７℃过夜±；ｉ：｝养２０ｈ以后，观察各个茵落透明圈的大小，若不太明显，可在４℃冰箱中放置２４ｈ，再比较透明圈的大小。
１．６ｄ．淀粉酶阳性转化子的鉴定将在ＬＢＳＰ平板上有显著透明圈的阳性克隆子转接到ＬＢ液体培养基中扩大培养，抽取质粒，以质粒ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ鉴定。
扩增条件为９４℃预变性２ｍｉｎ，然后９４％变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２０Ｃ延伸ｌｍｉｎ，３０个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ，使用ＴａｑＤＮＡ聚合酶。
质粒抽提方法参考《分子克隆实验指南》。
１．７Ｏｔ．淀粉酶酶活测定方法将阳性克隆子转接于一装有５ｍＬＬＢ液体培养基的试管中，３７％过夜振荡培养；取１００ｐ，Ｌ培养液，接入一装有５０ｍＬＬＢ液体培养基的三角瓶中，３７ｑｃ、２２０ｒ／ｍｉｎ振荡培养，在产酶高峰期取出待用；取粗酶液３ｍＬ于氨苄青霉素玻璃瓶中，用超声波破碎后取出１．５ｍＬ于１．５ｍＬ离心管中，低温条件下８０００ｒ／ｍｉｎ离，心５ｍｍ后取上清液待用（全酶）；测胞外酶时，直接取粗酶液于１．５ｍＬ离心管中，低温条件下８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｎｌ埘舌取上清液待用（胞外酶）。
Ｏｔ一淀粉酶酶活测定参考ＹＯｏ等的方法【１３】。
１．８序列测定及分析高酶活转化子经鉴定后送上海生工生物工程公司进行基因测序。
突变基因与出发基因的序列比对分析使用生物软件ＤＮＡｓｔａｒ５．０。
２结果与分析２．１用ＬＢＳＰ筛选阳性转化子用锥虫蓝淀粉平板ＬＢＳＰ进行鉴别筛选是一种简单、快捷的方法，可以直接通过平板上出现的透明水解圈的大小进行筛选，（见图１）而且又不对菌落产生负面影响，锥虫蓝淀粉平板上的菌落可以直接用来活化、转板和保存。
南于人工操作过程中每次点菌量的大小不同，经过夜培养后长出的菌落大小也不相同，所以在筛选时应以透明圈直径／菌落直径比为依据，进行二次筛选。
ａ、ｂ为ｄ＜ｌ－Ｊ批次的筛选图图１ＬＢＳＰ筛选阳性克隆子效果图Ｆｉｇｕｒｅｌ．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｒｎａｎｔｓｕｓｉｎｇＬＢＳＰ２．２阳性转化子的ＰＣＲ鉴定通过初筛获得的高酶活基冈，透ｆ川糊的大小ｊ｛足表砸特征，一。
